SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 586586年 10.4061 / 2011/586586 586586年 研究文章 检测鼻骨骨髓来源间充质基质细胞在损伤小鼠大脑:警示报告 Chartoff 埃琳娜·H。 1 Damez-Werno 黛安娜 1 星期日 Kai C。 1 Hassinger 琳达 1 考夫曼 丹尼尔·E。 2 彼得森 杰西 1 McPhie 唐娜 1 Cataldo 安妮·M。 1 科恩 布鲁斯·M。 1 Ruohola-Baker 汉娜T。 1 精神病学部门 麦克莱恩医院 哈佛医学院 密尔街115号 贝尔蒙特,马02478 美国 harvard.edu 2 雷根研究所正是从马萨诸塞州综合医院 麻省理工学院和哈佛大学,查尔斯镇,马02129 美国 mit.edu 2011年 16 10 2011年 2011年 01 04 2011年 23 08年 2011年 2011年 版权©2011埃琳娜·h·Chartoff et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

骨骨髓来源间充质基质细胞(msc)治疗自体神经病理学带来希望。鼻内交付相对无创性和最近报道导致msc运输到大脑。然而,骨髓间充质迁移的能力从鼻腔到网站的神经病理学和最终生存没有完全检查。在这篇文章中,我们收获的msc的表达增强绿色荧光蛋白转基因小鼠细胞(以下称为MSC-EGFP)和交付他们给与野生型老鼠维持机械纹状体病变。使用荧光比色和超微结构检测方法,GFP-expressing大脑细胞被察觉MSC从3个小时到2个月后交货。然而,明亮的自体荧光强烈类似于发射从观察GFP的嗅球和纹状体进行控制和MSC-EGFP-treated老鼠。在对照实验中,我们直接将MSC-EGFPs植入小鼠纹状体和健壮的GFP表达发现植入后1和7天。这些研究结果建议(我们conditions-intranasally交付MSC-EGFPs不生存或迁移。此外,我们的观察突出的必要性包括适当控制在处理GFP细胞标记。

 1。介绍

骨骨髓来源间充质基质细胞(msc)是自我更新的前体(一些处境——被证明能够分化成细胞的间叶细胞谱系如骨、软骨、肌肉、脂肪( 1, 2]。此外,据报道在体外和体内的msc可以在神经细胞的前体血统( 3- - - - - - 6),虽然有持续争论这些发现( 7, 8]。大量的研究已经证明,msc可以灌输和生存有限时间后直接植入到纹状体( 9- - - - - - 11]。然而,争议仍然msc在体内是否有内在能力分化成神经细胞,大脑内迁移,和长时间生存 12, 13]。无论如何,为自体msc被广泛认为是一个潜在来源治疗一系列神经退行性或通过交付的生长因子或神经紊乱替代受损细胞的 14- - - - - - 16]。

侵入性或低效的路线通常用于管理msc(即。,intracerebroventricular, intracerebral, intraperitoneal, or intravascular), which would complicate clinical use. Intranasal administration is an attractive option for delivering MSCs to the brain because it is relatively noninvasive, and the olfactory region is a unique interface between the external environment and the central nervous system that bypasses the blood-brain barrier [ 17, 18]。鼻内的小肽,药物,和病毒导致大脑通过这些物质( 18- - - - - - 23),虽然大的病毒颗粒不出现迁移的嗅球( 22, 23]。尽管鼻内路线的效率可能会低,潜在的优势更多侵入性技术值得进一步研究。

最近,据报道,骨髓间充质老鼠导致鼻内交付荧光标记的一些细胞迁移到大脑( 24, 25)和衰减6-OHDA-mediated运动障碍的帕金森病模型( 26]。目前的研究旨在复制上面的结果和测试假设鼻内骨髓间充质小鼠纹状体病变持续交付将导致细胞的迁移和移植嗅上皮病变的网站。

一个问题已经阻碍了努力学习的治疗潜力msc追踪msc在大脑是有限的能力和区分他们从内源性细胞。我们使用msc与转基因小鼠表达EGFP CAG启动子的控制下,正如前面描述的( 3, 27]。因为内源性组织自体荧光的存在可以使人难以准确检测相对罕见的事件干细胞迁移和生存在大脑中,加入适当的控制一直是强烈推荐( 28, 29日),我们将特别强调区分非特异性和脑组织中GFP-specific信号。最后,我们进行了控制实验,我们直接移植msc到纹状体来验证msc孤立和培养我们的条件下可以生存在大脑,如前所述[ 9- - - - - - 11]。

 2。材料和方法 2.1。代的一个EGFP-Expressing间充质基质细胞(MSC)线

的一代EGFP-expressing MSC线(MSC-EGFP)骨髓细胞(BMC)股骨的收获7-week-old雄性转基因小鼠( N = 6 老鼠)表达增强型绿色荧光蛋白(C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1的osb / J;杰克逊实验室、巴尔港、MN)根据出版协议 6, 27, 30.)使用杜尔贝科的修改鹰中/高葡萄糖(DMEM / HG媒体;英杰公司)补充2毫米谷酰胺,15%胎牛血清的边后卫。BMC总人口分离msc,媒体改变了3小时然后每8小时后72小时BMC悬挂的初始镀。在每个媒体的变化,不依从细胞被移除,留下附着msc ( 30.]。下面的隔离msc、克隆细胞群是派生如前所述 6),除了3周的细胞传播DMEM /低葡萄糖(DMEM / LG;σ)2%的边后卫(Hyclone), 1纳米地塞米松(σ),2.5 ng / mL bFGF, 10 ng / mL mEGF, 10 ng / mL mLIF(如[ 27])。

 2.2。流式细胞术(FCM)

培养的bmc和MSC-EGFPs使胰蛋白酶化,在PBS清洗,然后使用鼠标进行标准FCM分析多功能间充质基质细胞标记抗体面板(研发系统;目录# SC018)根据制造商提供的条件与568 -标记Alexa萤石二级抗体(英杰公司)和一个LSR Fortessa流式细胞仪机器(BD生物科学)。数据分析使用FlowJo软件版本8.7.3 (TreeStar)。

 2.3。老鼠

总共有38 C57Bl / 6 j小鼠(杰克逊实验室、巴尔港、我)被用于这项研究。小鼠体重g 25日- 27日的时候学习(大约10 - 12周大)和保持在12 h光/暗周期(上午7点到下午7点) 随意除了在测试过程中获得食物和水。实验按照1996年的国家健康研究所 指导实验室动物保健和使用的和麦克莱恩医院政策。见表 1的分解每个治疗组小鼠的数量。

治疗组。

老鼠/组编号
预处理 MSC 传递路线 3人力资源 1 d 7 d 2金属氧化物半导体
机械损伤 阿明费 在 3 3 3 3
MSC-EGFP 在 3 3 2 2
没有损伤 阿明费 在 2
MSC-EGFP 在 2
阿明费 是 3 3
MSC-EGFP 是 3 3

总老鼠:38。

缩写::鼻内;是:intrastriatal。

 2.4。鼻内MSC-EGFP交付

总共26个老鼠用于研究鼻内MSC-EGFP交付(见表 1)。外科(虚假)背侧纹状体进行小鼠的损伤( N = 22 鼻内交付MSC-EGFPs之前)3周。这个时间框架是使用,因为我们的长期目标是确定鼻内政府的msc可以拯救神经化学和行为引起的赤字6-hydroxydopamine (6-OHDA)多巴胺能系统的病变,这需要大约3周发生( 31日]。在最近的研究中,并没有涉及6-OHDA,小鼠麻醉与腹腔内注射(IP)的盐酸氯胺酮(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪盐酸(15毫克/公斤)混合物(σ)。老鼠被固定在一个立体定位仪和接收2单方面显微镜下注射0.01%抗坏血酸( N = 22 老鼠;注射2×1.5 μL /注射)进入左纹状体。抗坏血酸是使用,因为它是一种常见的6-OHDA的工具。注入坐标前囱前1.0毫米,1.4毫米侧中线,和3.3毫米腹侧颅骨表面;前囱前0.1毫米,3.3毫米1.6毫米侧中线,腹侧颅骨表面( 32]。显微镜下注射的速度是0.35 μL / min 33-gauge注射器针(塑料,弗吉尼亚州)连接于聚乙烯(PE)管材10 μL汉密尔顿注射器注射泵。每4.3分钟注入之后,3分钟的等待时间,允许扩散之前清除喷油器针。

三周后病变,收件人老鼠收到MSC-EGFPs或鼻内的车辆。unlesioned额外4日,老鼠也会收到鼻内msc(见表 1)。老鼠轻轻用IP注射麻醉的盐酸氯胺酮(50毫克/公斤)和甲苯噻嗪盐酸(7.5毫克/公斤)混合物(σ)。使用标准gel-loading吸管,10 μL(无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)或PBS包含25000 MSC-EGFPs一滴一滴地注射到每个鼻孔,导致交付50000 MSC-EGFPs /鼠标。PBS被选为车辆基于先前发表的报告( 24, 26]。老鼠牺牲3 h, 1 d, MSC-EGFP 7 d,或2个月后交货。

 2.5。Intrastriatal MSC-EGFP交付

老鼠( N = 12 )进行麻醉的腹腔内注射(ip)盐酸氯胺酮(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪盐酸(15毫克/公斤)混合物(σ)。老鼠被固定在一个立体定位仪和接收1单边显微镜下注射(2 μL在0.2 μL / min)的75000年文化传媒(MSC-EGFPs NaHCO DMEM / F12含有0.66%葡萄糖,0.125%3,0.0056消息灵通的仅0.05% DNAse)或媒体,如Moloney et al。 11使用26-gauge汉密尔顿注射器)。注入坐标是:1.0毫米前囱前,3.3毫米1.4毫米侧中线,腹侧颅骨表面。老鼠牺牲1或7 d后MSC-EGFP交付。

 2.6。免疫组织化学

老鼠牺牲在不同时间点MSC-EGFP交付后戊巴比妥钠过量(130毫克/公斤,IP)和与10%的福尔马林灌注transcardially磷酸盐缓冲剂(费舍尔)。大脑被保存在福尔马林在4°C过夜然后饱和蔗糖30%磷酸缓冲盐3天直到切片Vibratome组织处理器(TPI系列1000年,圣路易斯,密苏里州)。矢状面和冠状部分(30 μ米)穿过整个大脑和收集10%福尔马林。MSC-EGFPs荧光检测,组织部分要么是直接安装到视图内生GFP,免疫组织化学或加工。

组织部分洗3×5分钟在稀释缓冲(2%牛血清白蛋白,0.9%生理盐水、0.4%补间正常羊或马血清20到1% 0.1磷酸缓冲盐PBS)然后用20%阻塞正常的羊或马血清0.1 PBS 30分钟。主要抗体稀释在稀释缓冲和部分孵化在室温下过夜。荧光成像技术,有些部分复染色1 μg / mL DAPI (4′6-diamidino-2-phenylindole;σ)。主要抗体用GFP(兔多克隆,1:2000年,Abcam)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP),兔多克隆,1:250年,DAKO公司Carpinteria, CA)。二次抗体包括Alexa萤石488荧光团在山羊(anti-rabbit 1: 1000年,表达载体,卡尔斯巴德,CA)和生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 1000)其次是streptavidin-conjugated Alexa 568荧光团(1:200年,英杰公司)。为了满足自体荧光,一些组织部分使用0.3%的苏丹黑0.1 PBS(σ)5分钟前免疫组织化学((参见图2补充在网上补充材料,doi: 10.4061.2011.586586)]。

组织部分相邻为nonfluorescent那些用于荧光处理,比色检测GFP使用avidin-biotin系统(Vectastain ABC设备;向量)和diaminobenzidine(轻拍;chromagen向量)。绿色荧光蛋白多克隆抗体(Abcam)在兔在1:使用2000和生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白(向量实验室,Burlingam, CA)是用于1:1000。

部分是可视化和捕获一个正直的蔡司Z1显微镜连接到一个数码相机(蔡司AxioCam HRc)。图像处理使用AxioVision软件(蔡司)和Photoshop(版本8.0;奥多比公司,圣何塞,CA)。负控制省略主要抗体进行免疫组织化学染色。同时,大脑区域侧病变检查,担任内部控制。

超微结构分析病变MSC-EGFPs的网站,组织部分处理的GFP包含IHC民建联和1%四氧化锇(OsO后固定4)钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.2,通过分级乙醇脱水,平嵌在论之间的嵌入- 812表(EMS、宾夕法尼亚州华盛顿堡)。适当的地区组织被附加到epon空白和超薄部分削减使用Reichert-Jung ultra-microtome,安装在铜网格和轻沾水醋酸双氧铀(10分钟)和雷诺氏柠檬酸铅(4分钟)。部分使用Jeol检查1200例透射电子显微镜(Jeol、东京、日本)的AMT数字成像系统(先进的显微技术Corp .,丹弗斯马)。

 3所示。结果 3.1。表型的MSC-EGFPs

使用FCM和鼠标多能间充质基质细胞标记抗体面板,我们表型MSC-EGFP线(4通道),相比正常C57BL / 6的bmc收获和成长在三周后血清mitogen-free条件(3通道;图 1(一))。bmc隔离成两个分数的总人口:大细胞,表达本来就弱,但强烈表达CD29、CD44和CD106是负面,CD105, CD73, CD11b,和CD45和小细胞,这种细胞表现出没有任何标记的表达分析。MSC-EGFPs本来就强阳性,CD29、CD44和(类似于bmc的大部分)而不利于CD106 CD105, CD73, CD11b和CD45。

养殖的bmc和MSC-EGFPs表型分析。(a)的bmc培养三周的血清mitogen-free条件和增殖MSC-EGFPs在18段分析流式细胞术(FCM)使用鼠标多能间充质基质细胞标记抗体面板(研发系统)。显示积极的染色标记本来CD29、CD44、一个例子CD45造血负染法的标志。((b)、(c)、(d))未分化的间充质基质细胞来源于成人EGFP转基因小鼠(MSC-EGFP)表现为大,扁平纤维母细胞表达高水平的增强绿色荧光蛋白的记者,EGFP。MSC-EGFPs在(b)所示相衬和(c) GFP带通滤波器,展示eGFP表达和(d)德州红色的带通滤波器,展示缺乏自发荧光。

 3.2。检测EGFP在msc

msc在通过使用4和GFP的存在被证实在分娩前的培养细胞动物(见图 1 (b)- - - - - - 1 (d))。MSC-EGFPs有扁平的外观和形状呈(图 1 (b))。这些细胞表现出明亮的绿色荧光(图 1 (c)当可视化GFP带通滤波器,但没有发出荧光可视化时德克萨斯红带通滤波器(图 1 (d)),确认绿色荧光是由于GFP的表达而不是自发荧光。因此,鼻内政府之前,立即MSC-EGFPs是可行的和表达绿色荧光蛋白。

 3.3。检测MSC-EGFPs鼻内交付

矢状面和冠状大脑部分从纹状体损伤小鼠鼻盐水或MSC-EGFP检查GFP-positive细胞荧光显微镜的存在。MSC-EGFP交付三小时后,荧光细胞样的结构可见肾小球层内的OB,但是他们没有像MSC-EGFPs文化。OB的荧光检测到类似的强度级别在多个排放过滤器,表明自体荧光。一种可能性是,OB GFP表达很低,所以为了放大GFP信号,我们使用了一个抗体,为后续观察GFP。在这种情况下,类似的荧光细胞样的结构可见肾小球内较小的程度上,外丛状层的OB 3人力资源,MSC-EGFP 1和7天,2个月后交付给小鼠纹状体病变看GFP带通滤波器(3小时和7 d,见图 2(一)和 2(b))。然而,荧光观察相同的强度和空间分布与所有过滤器,包括德克萨斯红带通滤波器(数字 2(′)和 2(b′))。相似的荧光结构可见肾小球内细胞层纹状体损伤小鼠接受鼻内的车辆(数字 2(c)和 2(d))。没有观察到荧光背景之上的深层OB沿着既定的路线或迁移等olfactory-neuronal通路( 18]。

自体荧光在嗅球(OB)鼻内交付MSC-EGFPs与之前的机械损伤小鼠纹状体。荧光结构观察肾小球层内的OB在3小时和7天之后鼻内MSC-EGFPs管理局(a)、(b)或生理盐水(c), (d)。高放大图像的OB 3小时((a′, c)插图)和7天((b′, d)插图)成像与GFP和德克萨斯红带通滤波器显示彩色的数量和强度之间的一对一关联结构。

健壮的自体荧光也观察到纹状体沿着轨迹的注射器针用于制造机械纹状体病变。不管鼻内治疗(MSC-EGFPs或生理盐水),自发荧光看起来相似。在鼻内治疗后第七天,荧光有一个“爆炸”,颗粒外观(数字 3(一)和 3(b))同等强度下的红色和绿色荧光过滤器(数字 3(c) - 3(d′))。高倍镜下,一些相关的荧光体出现松散DAPI-stained原子核,尽管他们有一个点状的外观未见的健康组织(数字 3(e) - 3(f′))。鼻内治疗2个月后,自发荧光明显消散在了针,但它仍无法区分MSC-EGFP -和saline-treated老鼠(增刊。图1 1 (A)和(B)),具有类似强度下红色和绿色的过滤器(增刊。图1 (C)和1 (D))。相关的一些荧光的身体似乎DAPI-stained核(增刊。图1 (E)和1 (F))。重要的是,荧光结构很难定义,它是不可能清楚地把精力集中在这些障碍上,类似于描述为脂褐质自发荧光( 33]。

纹状体的自发荧光小鼠接受机械纹状体病变3周后鼻内盐水或MSC-EGFPs。明亮的颗粒荧光观察到终止病变注射器针在7天后鼻内交付MSC-EGFPs (a, c, e)或生理盐水(b, d, f)。结构和荧光强度的数量是相同的GFP和德克萨斯红带通滤波器(c′和d′)。

几种方法来减少在大脑(淬火)自体荧光(见[ 33])。苏丹黑是一种不透明的染料,有效掩盖脂褐质没有与它在化学层面交互。它已经被证明可以减少自发荧光在免疫组织化学染色浓度有影响最小。我们组织的一个子集预处理部分与苏丹黑人(0.3%)和检查GFP和酪氨酸羟化酶(TH)纹状体染色。苏丹黑预处理在全球范围内荧光强度降低,但并没有消除自体荧光浓度,仍允许检测(增刊)。图2。

确定组织的自体荧光观察是否与胶质反应有关,我们从老鼠colabeled组织牺牲了2个月后鼻内MSC政府anti-GFP和anti-GFAP抗体。Autofluorescent身体同侧的一侧的纹状体在病灶周围强大的GFAP的表达,这是本地化的注射器针轨迹(数字 4(一)和 4 (b))。相比之下,低,背景水平的GFAP染色和自发荧光观察的纹状体侧病变(图 4 (c))。

双标免疫组织化学显示密切联系胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和自发荧光的注射器针跟踪在纹状体,2个月后鼻内MSC-EGFPs交付。(一)绿色沿针跟踪自体荧光。从(a)插图,放大图像。(b) GFAP表达(红色)沿针跟踪强。(c) GFAP大大降低,也没有绿色的自体荧光,发现在侧纹状体半球。

 3.4。检测体内EGFP:光学显微镜

绕过这个问题的自发荧光的荧光显微镜,我们执行额外的免疫组织化学相邻组织部分与MSC-EGFPs使用相同的GFP小鼠鼻内多克隆抗体和生物素化的二次抗体能被探测到的avidin-biotinylated过氧化物酶酶复杂反应。组织部分与甲苯基紫复染色。部分从小鼠治疗鼻内盐水或MSC-EGFPs,密集,DAB-positive集群是观察到末端的注射器针跟踪纹状体(没有显示)。高倍镜下,这DAB-positive集群出现点状的和不明确甲苯基紫染色细胞核(图 5(一个))。此外,它是不可能专注于这些结构,一种无形的外观。

超微结构的分析,从小鼠纹状体组织给与MSC-EGFPs。(a)代表的例子的光学显微镜图像DAB-stained在纹状体组织。(b)特征结构中观察到的小鼠纹状体MSC-EGFP治疗后7天。黑暗的细胞样的结构几乎没有可辨别的细胞器但充满包涵体,脂褐质,和其他退化产品。健康的细胞核和细胞中可以看到的右下部分面板(B′)。MSC-EGFP治疗2个月后,也发现类似的黑暗的结构(c)以及黑暗的细胞固缩的细胞核,细胞质萎缩和液泡,(c)和(d)。比例尺是2 μm。

 3.5。超微结构分析DAB-Positive纹状体的结构

确定GFP-specific染色,暗示MSC-EGFPs,出现在非特异性和非晶态结构中观察到纹状体荧光和光学显微镜,我们进行了电子显微镜DAB-stained从小鼠纹状体组织接受鼻内MSC-EGFPs牺牲前7天或2个月。我们观察到许多细胞样的结构,比周围的组织和细胞(数据 5 (b)- - - - - - 5 (d))。许多这些细胞似乎是在退化的高级阶段:细胞结构,如线粒体,内质网,高尔基没有检测到,细胞质中充满了包涵体,脂褐质,溶菌酶,和原子核,当可观测的,是相对较小的,偏心(图 5 (c))。不同的人口萎缩,电子致密结构与黑暗,染色质固缩的观察(图 5 (d))。基于这一形态,很可能这些结构是坏死细胞( 34]。有趣的是,在这些更小的坏死细胞,细胞器如线粒体、内质网、高尔基体apparati仍然可以被探测到。相比之下,一个健康的神经细胞也可以看到在图的右下角 5 (b)(B′),正常的细胞结构明显,细胞核是完整和漫射光和染色质和集中,而且没有包涵体的证据。

 3.6。检测MSC-EGFPs Intrastriatally交付

验证MSC-EGFPs培养我们的条件下能够生存在大脑,在之前的报告( 9- - - - - - 11),我们进行了控制实验,MSC-EGFPs直接移植到受体小鼠纹状体。intrastriatal注射后的一天,GFP-specific荧光检测纹状体的细胞移植集中在注射部位(数字 6(一), 6(b) 6(c))。可视化MSC-EGFP嫁接在德克萨斯红带通滤波器没有可检测荧光(图 6(c′))。未发现MSC-EGFPs贪污之外的区域,表明缺乏迁移在这个时间点。七天intrastriatal注射后,GFP-specific荧光检测纹状体的细胞移植集中在注射部位观察到1天(数据类似 6(e), 6(f) 6(g))。相比之下,可视化的MSC-EGFP嫁接在德克萨斯红带通滤波器显示弥漫性,低水平的荧光点缀着明亮的puncta(图 6(g′))。这表明存在autofluorescent包涵体可能与MSC-EGFPs死亡有关。嗅球组织还研究了在intrastriatal植入后1和7 d。荧光细胞样的结构可见肾小球层内的OB(数字 6(d)和 6(h))。然而,荧光观察相同的强度和空间分布与所有过滤器,包括德克萨斯红带通滤波器(数字 6(d′)和 6(h′)),这表明内生OB的自发荧光的存在。因此没有检测到迁移的MSC注射部位后7天生存,但是有证据表明MSC损失注射部位。

检测MSC-EGFPs intrastriatal后交付。(a)植入后1 d,内生eGFP荧光从msc发现近端注射器针。组织与DAPI复染色。(b)在较高放大(40 x)呈结构植入MSC-EGFPs可以看到。荧光检测到GFP (c),但不是德克萨斯红(c′)排放过滤器。OB,自体荧光检测到GFP (d)和德克萨斯红(d′)排放过滤器。(e) 7 d植入后,发现内生eGFP荧光从msc在喷油器针。组织与DAPI复染色。(f)在较高放大(40 x)植入MSC-EGFPs可以看到。荧光检测到GFP (g),德克萨斯红(g′)排放过滤器,虽然没有与GFP信号重叠。 In the OB, autofluorescence is detected on both the GFP (h) and Texas Red (h′) emission filters. Abbreviations: cc: corpus callosum; lv: lateral ventricle.

 4所示。讨论

在这项研究中,我们测试是否从骨髓msc孤立EGFP转基因小鼠和交付鼻内会进入OB,生存下去,随着时间的迁移到一个远端在纹状体病变部位。我们发现没有证据表明可行MSC-EGFPs在大脑的任何区域3小时,1或7天,或2个月后鼻内的管理。缺乏MSC-EGFPs不是由于细胞灌输一种内在的能力或在体内生存,因为MSC-EGFPs植入直接在纹状体存活了至少7天。值得注意的是,在我们寻找可行的MSC-EGFPs在大脑中,我们观察到高水平的自体荧光在进行完整的OB和纹状体机械损伤后数周。我们认为,可想而知,这个自发荧光可以被误认为是EGFP-labeled msc的存在。这符合过去的研究证明很难区分真正的GFP信号和工件之间,发生,至少在某种程度上,因为自体荧光发射光谱部分重叠的发射绿色荧光蛋白( 28, 29日, 33, 35]。

最近,据报道,鼻内的荧光标记大鼠msc老鼠导致移民的数量显著的细胞嗅球,皮质、海马、纹状体、丘脑的大脑结构的几小时内细胞管理( 24- - - - - - 26]。有几个可能的原因与我们研究的明显差异。首先,我们管理留学生和细胞少于而是et al .,提高的可能性的数量开始MSC-EGFPs并不足以产生有意义的检测数量的msc在大脑中。然而,这似乎不太可能,因为在500 - 2000年msc可检测的OB鼻内后第一个4小时内政府而是研究[ 24, 26翻),这个数字下降的OB msc仍将与这里描述的方法检测。第二,GFP的使用在我们的研究中可以减少了msc为生存的能力。但是,它最近表明,GFP在msc并不负面效应的存在大脑中干细胞的生存( 11]。第三,它是可能的机械纹状体病变引起组织反应导致拒绝msc。机械损伤,诱发炎症反应,我们发现intrastriatal抗坏血酸管理超过2个月后,仍有强劲的注射器针跟踪GFAP的表达。虽然我们不确定这产生免疫反应,很可能受损组织周围的化学环境包括细胞因子、生长因子和其他潜在的化学信号,可以吸引或排斥MSC-EGFPs。这是符合之前的工作表明炎症反应intrastriatal MSC交付本身就足以拒绝道MSC随时间( 10, 36]。然而,科因等人表明,msc存活至少一周前被拒绝而我们从未见过的证据后幸存的msc鼻内交货。我们认为最有可能的解释是,MSC-EGFPs根本无法通过嗅觉粘膜上皮,因此从不暴露于大脑本身。

虽然我们没有检测到msc鼻内交付后在大脑中,有丰富的荧光。真正从GFP荧光信号比自体荧光发射光谱较窄。因此,真正的GFP排放不会检测到较长的波长(> 550海里)带通滤波器(即。德克萨斯州红色)。在我们的研究中,一个GFP-specific信号出现在MSC-EGFPs文化和接受intrastriatal注入小鼠纹状体的细胞,因为发现荧光信号只在绿色(GFP带通),而不是在红色(德州红色)排放过滤器。然而,在老鼠MSC-EGFPs鼻内接种,没有GFP-specific信号可以从自体荧光歧视。每个结构下的荧光检测到GFP带通滤波器以同样的强度在德州红色过滤器。这些类型的消极控制通常不是在文献中报道,尽管数篇论文要求适当的控制( 28, 29日, 35, 37]。

纹状体的自发荧光观察到在我们的研究与机械损伤密切相关网站和GFAP表达和最有可能是由于受损组织产品和脂褐质,在波长autofluoresces类似于GFP ( 35]。OB, autofluorescent在组织结构观察小鼠接受鼻内盐水或MSC-EGFPs,从老鼠也没有收到任何鼻内治疗,表明身体压力引起的鼻内注射不是OB autoflourescence的原因。自发荧光的OB是知之甚少,但两份报告描述天然脂褐质在OB及其氧化酶活性的关系( 38, 39]。

为了规避自体荧光,我们对组织进行电镜chromagen加工使用民建联GFP免疫反应性。以往的经验显示在超微结构水平GFP在集群与内质网( 40- - - - - - 42]。在我们的研究中,我们没有观察到GFP-specific染色在超微结构水平的纹状体组织取自小鼠鼻内7天或2个月后交付MSC-EGFPs。相反,在区域彩色正面涂(见图 5(一个)),我们观察到很多细胞退化的不同阶段的例子,包括萎缩,电子致密坏死神经元核固缩的。这种类型的形态一直在前面描述的( 34],加上高水平的GFAP发现在纹状体注射部位,是一致的可能性纹状体病变导致炎症反应导致细胞退化和坏死,导致存款autofluorescent碎片(例如,脂褐质)。有趣的是,类似的结构中,并未观察到OB(数据没有显示)。

msc的表型可能发挥重要作用在移植后生存能力。FACS-based表现型通常用于识别骨髓MSC隔绝,但档案和标记选择研究之间的差异。因此,msc已被证明为一系列积极的抗原CD44、CD105 (SH2;endoglin)、CD106 (VCAM-1), CD166 CD29, CD73 (SH3和SH4), CD90 (Thy-1), CD117, STRO-1,,本来就缺乏造血和内皮细胞表面分子的表达,比如CD11b, CD14、CD31、CD33, CD34, CD133和CD45(综述( 43])。在最近的研究中,FCM表现型mitogen-containing MSC-EGFPs通道4的显示强烈的表达的本来就文化条件,CD29、CD44和没有CD106的表达式,CD105, CD73, CD45和CD11b。获得进一步洞察他们的表型属性,我们相比MSC-EGFP概要文件从骨髓细胞(bmc)培养使用一个既定协议( 30.]。在我们的手中,bmc培养三周的血清mitogen-free媒体隔离成两个不同的细胞群表达谱。一小部分的大细胞形态类似于MSC-EGFPs并表示本来(弱表达)、CD29、CD44;一小部分的小细胞为阴性标记分析。这些数据表明,尽管被建立派生方法无性繁殖系地扩大MSC-EGFPs用于这项研究有一个BMC-derived表型类似msc的一些特征,但显然不是造血或纤维母细胞谱系( 6, 24, 30.]。MSC-EGFPs应该注意的是,这条线是以前使用的体外分化模式获得神经细胞群( 27]。这些发现强调的重要性,建立一致的标准定义MSC和MSC亚型。

 5。结论

总之,我们发现没有证据表明鼻内交付MSC-EGFPs迁移,或坚持,老鼠的大脑纹状体病变而intrastriatally植入干细胞存活了至少7 d。另外,我们观察到高度的自体荧光完整OB和纹状体损伤,很容易被误认为是EGFP-labeled msc的存在。这些最后的观察证实过去的研究表明许多标准技术用于跟踪GFP荧光可以产生误导的工件( 28, 29日]除非包括适当的控制和披露 28, 29日, 35, 37]。

 信息披露

b·m·科恩是一个coinventor专利申请:Cataldo et al .,”方法和成分治疗医学疾病,”描述的使用msc交付或neurogenerative因素增长。没有其他作者报告任何生物经济利益或潜在的利益冲突。

 资金

中心格兰特,斯坦利医学研究所,弗雷泽研究所(b . m . Cohen)资助。

 确认

作者非常感谢Cataldo a . m .,激情和智慧的这背后的驱动力和其他MSC的研究。不幸的是,她去世了在这之前就可以完成工作,获得的知识用于未来的进步。

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