SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 383709年 10.4061 / 2011/383709 383709年 评论文章 心脏分化的多能干细胞 Rajala Kristiina 1 Pekkanen-Mattila 毛伊岛 1 Aalto-Setala Katriina 1、2 哦 史蒂夫 1 Regea——再生医学研究所 坦佩雷大学 坦佩雷大学医院 33520年坦佩雷 芬兰 uta.fi 2 心脏中心 坦佩雷大学医院 33520年坦佩雷 芬兰 2011年 01 03 2011年 2011年 16 11 2010年 01 02 2011年 08年 02 2011年 2011年 版权©2011 Kristiina Rajala et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

人类多能干细胞分化的能力向心脏血统吸引了巨大的利益,在一开始对再生医学的强烈关注。最终目标来修复心脏的心肌细胞替换,然而,证明具有挑战性。人类心脏分化已经很难控制,但方法改善,和过程,在某种程度上,可以操纵和导演。到目前为止所描述的心肌细胞干细胞展览,而不成熟的比成人心肌细胞功能和结构特点。因此,未来的挑战将是发展战略以达到更高程度的心肌细胞成熟 在体外从异构池,分离心肌细胞的分化细胞,以及指导分化成所需的子类型,也就是说,心室、心房起搏细胞。在本文中,我们将讨论的策略生成心肌细胞的多能干细胞及其特点,以及突出细胞的一些应用程序。

 1。介绍

人类心肌细胞可以从心脏切片孤立,但是人类心脏组织的访问是非常有限的,而且过程复杂;很难获得大量活细胞的准备,和获得的细胞不能战胜自然。因此,生理上相关 在体外人类心肌细胞模型目前有限的。这使得创建的替代模型,如隔离从各种新生心肌细胞的动物或生产转基因细胞系overexpressing某些目标蛋白质(如离子通道) 1]。然而,所有这些模型的份额很大的局限性对他们的基本生理差异而人类心肌细胞以及高成本和道德问题。提出了许多不同的人体组织来源的干细胞能够产生新的心肌细胞(例如,胎儿心肌细胞,成人心脏祖细胞,骨胳肌母细胞,骨骨髓来源干细胞,脂肪干细胞,脐cord-derived干细胞,多能干细胞)( 2]。成人的心脏分化潜能、多功能干细胞存在于胎儿和成人组织,然而,是有争议的 3, 4]。这是归因于有限的成体干细胞的可塑性,这就排除了他们分化成心肌细胞功能。唯一的成体干细胞,显然有可能分化成跳动的心肌细胞心脏祖细胞( 5]。此外,到目前为止,只有多能干细胞已被证明 在体外有效地分化成自发收缩cardiomyocyte-like细胞( 6- - - - - - 9]。

多能干细胞几乎无限的自我更新能力 在体外和有能力分化成三个胚芽层,因此,原则上,能增加人体的所有细胞类型( 10]。以来的第一次描述隔离和表征人类胚胎干细胞(为)从供体胚泡 11),有报道称的分化为功能由多个分化心肌细胞的方法。最近的突破领域的诱导多能干细胞(iPS)电池技术已经证明,人类“诱导多能性”细胞可能提供一个额外的来源 在体外分化的心肌细胞,与hESC-derived同行分享相似之处 12- - - - - - 14]。目前,可以从多能干细胞分化心肌细胞(1)自发的胚状体的身体(EB)分化悬浮,(2)coculture用鼠标endoderm-like细胞(END-2细胞),或(3)指导心脏分化与生长因子定义在暂停或单层培养( 15]。

由于心脏表型和功能性质的多能干细胞心肌细胞,他们可以提供更多的生理和临床相关的复制比目前人类细胞模型。 在体外分化心肌细胞可以作为模型来研究人类cardiogenesis的早期事件,有可能被用于制药药物发现和安全毒理学。动物模型目前广泛用于药物代谢和毒性研究还没有完全可靠预测人类物种之间由于人体基本的生理差异的反应非常快跳动率等鼠标可能覆盖心律失常的影响将是严重的人类。预计多能干细胞心肌细胞将是很重要的 在体外药品安全测试工具可以大大促进药物开发和一代更安全的药物。领域的心脏再生修复,心肌细胞会促进干细胞的发现小分子促进心肌细胞分化用于激活内源性心脏干细胞在临床的设置( 15]。有迫切需要规范和验证分析涉及多能干细胞心肌细胞以及比较这些心肌细胞与建立 在体外和 在活的有机体内模型以有效地确定新模型的功能和限制的心脏安全性做出准确的预测新的潜在的药物在开发( 15, 16]。能够重组成人细胞多能干细胞和干细胞的基因操纵提供了机会来开发人类疾病模型( 17, 18]。直到今天,许多严重的疾病在动物模型研究,特别是使用转基因小鼠。尽管小鼠模型可以提供有价值的信息,区别人类和小鼠生理限制结果的适用性。“诱导多能性”细胞来自患者从各种心脏疾病或障碍,如channelopathies或先天性心脏病( 19, 20.),预计,成为研究机制的重要工具的底层的疾病发病机理和调查新的治疗机会。然而,这还有待证明 在体外生成的iPS细胞衍生心肌细胞实际上概括适当的疾病表型观察在成年人的心脏。

成人心肌细胞终末分化细胞。虽然一小部分心肌细胞的增殖能力,它不足以取代受伤或死亡的心肌细胞,例如,心肌损伤。近年来,干细胞技术引发了人们对于新治疗心脏组织损伤与再生能力有限。可能应用多能干细胞心肌细胞修复受损心肌已经证明在临床前研究中是一个可行的方法虽然仍存在许多障碍有待解决这些发展翻译诊所(之前 21- - - - - - 28]。简而言之,要解决的障碍包括代纯化细胞制剂消除畸胎瘤形成的风险,为细胞移植后心肌梗死定义的最佳时机,适当的水平的成熟细胞的制备、剂量和交货机制促进成功的移植,减少移植移植后细胞死亡,和避免免疫排斥反应的移植( 16]。此外,目前仍担心多能干细胞心肌细胞的准备工作包括与节点细胞,心房和心室类型的动作电位(AP)属性( 8, 9]。这个电生理学异质性代表一个机会和挑战,心肌细胞干细胞心脏修复的应用。丰富的节细胞的潜在使用生物起搏器的形成( 29日]。另一方面,节细胞需要从梗塞心肌细胞准备维修,排除他们持续当标兵活动和独特的神经激素的反应性可能会加剧本已心律失常风险升高( 30.]。

有效的方法来诱导分化心肌细胞生成同质心肌细胞的数量足够的质量,大量重复性良好,是这些应用程序的任何先决条件。未来细胞疗法还需要定义心肌细胞生产协议满足监管要求。在本文中,我们描述多能干细胞的发育进程状态为心脏心肌细胞和概述协议多能干细胞的分化以及心肌细胞的富集策略迄今为止。

 2。心发展教训

器官发生在胚胎发育的早期事件的形成。虽然知识有关的分子机制管理cardiogenesis人类仍在起步阶段,实验动物模型识别各种分子事件的巨大价值和许多重要的监管机构运营的不同阶段下早期细胞cardiogenesis期间承诺的过程。在小鼠和小鸡胚胎的研究已经证明心脏组织由三个主要mesoderm-derived细胞谱系:心脏肌细胞,血管平滑肌和血管内皮细胞谱系。原肠胚形成后不久,几天后受精,胚胎三层形式,内胚层、外胚层和中胚层。原条由原始内胚层形成,是许多组织的起源。心脏祖细胞形成后原条( 31日]。需要四个主要步骤生成心肌细胞的多能干细胞:(1)中胚层的形成,(2)对前中胚层中胚层的模式或心原性的中胚层,(3)心脏中胚层的形成,和(4)早期心肌细胞的成熟。心脏的诱导多能干细胞分化命运以下步骤可以表现为转录因子的表达,比如T / Brachyury原条中胚层,Mesp-1心原性的中胚层,和Nkx2.5 Tbx5/20, Gata-4, Mef2c, Hand1/2心脏中胚层( 32- - - - - - 36]。Mesp-1被认为引起的epithelial-mesenchyme过渡外胚层和绑定直接监管的DNA序列许多成员的核心启动子的心脏监管网络,包括Nkx2.5从而促进发展的中胚层前兆心血管血统以及抑制关键基因的表达调控其他早期中胚层衍生品( 37, 38]。成熟的心肌细胞可以识别等心脏结构蛋白的表达 α辅肌动蛋白, α肌球蛋白重链( αmhc)或临床的心脏对碘氧基苯甲醚(cTnT)。通过启动心肌cross-regulatory复杂网络,这些因素被认为是参与地貌成因的事件导致心脏的形成。图 1说明了各个步骤的多能干细胞分化的心肌细胞,表明可能的细胞群,可以用于隔离和扩张。

图描述顺序步骤获得心肌细胞的多能干细胞。早期中胚层分化通过心脏中胚层和心脏祖细胞进一步致力于功能性跳动的心肌细胞。每一步的典型标记表示。

心脏是一个动态的发展过程,紧密编排的顺序表达多个信号转导蛋白和转录因子结合的方式工作。许多信号通路和生长因子与专业发展的心脏亚型,实际上wnt /节点最研究bmp, fgf [ 39- - - - - - 42]。因为这些因素优化工作在特定的时间窗口,在某些情况下,对抗cardiogenesis在其他窗口,除了指导的时机多能干细胞分化所需的方向必须仔细优化。

此外,小分子核糖核酸(mir)最近确认为分化过程的主要贡献者,( 43, 44]。小分子核糖核酸- nt长ssRNA参与基因调控和能够抑制翻译起始和诱导mRNA退化。心脏表达miR-1, mir - 133, mir - 206,特别是mir - 208 ( 45, 46]。此外,mir - 143年和-145年也出现重要cardiomyogenesis [ 47]。最近的一项研究调查了表达miR-1和mir - 133相比,制和为他们的潜能在胚状体诱导Nkx2.5身体和对中胚层分化的影响。miR-1击败总量的比例增加,因此似乎大大增强心脏表型。相反,mir - 133也促进早期中胚层分化但进一步抑制心脏的承诺( 48]。有趣的是,这两种大鹏coexpressed来自同一集群( 49]。识别大鹏调节心脏分化将提供另一个路线指导心肌细胞的分化。

(也就是第一步。,mesoderm induction) in cardiac differentiation from pluripotent stem cells has been well characterized. Numerous studies have demonstrated that Wnts, BMPs, and transforming growth factor (TGF) β家庭成员节点(或苯丙酸诺龙节的替补)有效地诱导中胚层( 50, 51]。尽管一些机制控制下的心脏分化(即两个步骤。,patterning to cardiogenic mesoderm and the formation of cardiac mesoderm) have been characterized in experimental animal embryos, knowledge about how these mechanisms might be applied to pluripotent stem cell cardiogenesis is still lacking. Nodal and Wnt inhibition have been found to regulate the formation of cardiomyocytes in xenopus and chick embryos [ 52- - - - - - 54),似乎是重要的小鼠ESC分化心肌细胞( 55, 56]。Dickkopf-1 (shh)是经常使用的Wnt拮抗剂在这个阶段分化协议( 57]。另一个重要的信号通路是由跨膜受体,这种药被证明能诱导的表达生长因子的组合Wnt5a, BMP6, Sfrp1,增加心脏祖细胞形成一个ESC-derived中胚层分组人口( 58]。最后一步分化阶段心肌细胞的分化是犯了心脏跳动的心肌细胞的祖细胞,这一过程通常是自发产生的 在体外和了解甚少,但可以控制的因素,如Wnt11 [ 56]。总的来说,很少有人了解的两个关键步骤在cardiogenesis多能干细胞,促进mesendoderm形成心脏中胚层和因素引起心肌细胞。

 3所示。心脏分化的多能干细胞

表 1和图 2总结了微分方法目前用于心肌细胞分化的多能干细胞。

总结常见心脏分化方法。

方法描述 分化效率% 干细胞类型 参考
身体自发的胚状体的方法 < 10% hESChiPSC Kehat et al。 6]Zhang et al。 12]
END-2方法胰岛素消耗,PGI2,p38 MAPK抑制 20% - -25% hESChiPSC 帕西et al。 68年),Graichen et al。 71年]Freund et al。 70年]
引导分化方法苯丙酸诺龙,BMP4 > 30% hESChiPSC Laflamme et al。 27]高桥et al。 17]
引导分化方法激活素A、BMP4 bFGF、VEGF、消退 40% - -50% hESC 杨et al。 57]

原理概述概述了微分方法目前用于心肌细胞分化的多能干细胞。 胚状体的身体方法,到目前为止,最使用的方式从多能干细胞获得跳动的心肌细胞三维细胞聚集形成的启动和促进分化的过程。一般来说,细胞转移到悬挂文化,或为了获得更稳定的和可再生的细胞聚集,形成拟胚体使用悬滴或强制聚合方法。 使用END-2方法,通过coculture触发心肌细胞分化的多能干细胞,END-2细胞或胚状体的身体形成悬浮培养使用END-2条件培养基。血清的损耗和胰岛素可以促进cardiogenesis在这种方法中,并且它可以进一步提高通过抑制p38 MAPK通路由特定抑制剂或通过增加前列腺素2。 在引导分化方法,未分化的多能干细胞培养在馈线颗粒在悬浮培养条件或胚状体形成。心脏分化诱导各种生长因子,如BMP2 BMP4,激活素A, bFGF和Wnt3a。

 3.1。胚状体的身体自发形成和心肌细胞分化

最初的观察,为成长为自发收缩cardiomyocyte-like细胞据报道十年前当为悬浮培养和形成三维聚合物称为拟胚体( 6, 59]。在胚状体的身体,衍生品的三个胚芽层(外胚层、内胚层、中胚层)自发发展。在这些混合的细胞收缩功能性质的区域心肌细胞可以被探测到。心肌细胞是第一个细胞诱导多能干细胞的拟胚体,在细胞为中胚层细胞相互作用刺激标记的表达和早期心脏细胞谱系( 60]。通常,拟胚体上镀matrix-coated进一步分化的细胞培养板,镀后几天内,与心肌细胞收缩扩展特点可以观察到 10]。至于人类“诱导多能性”细胞,心肌细胞诱导胚状体的身体方法于2009年首次报道( 12]。心肌细胞的自发分化多能干细胞在拟胚体被认为是低效率通常低于10%,高度依赖细胞株( 6]。

心肌细胞诱导胚状体的精神分化系统也证明变量部分由于骨料之间的异质性,可能,例如,不同大小和形态。一个策略来解决这个问题是通过采用悬滴法一般用于制( 61年]。然而,这个方法还没有非常成功的为其无论多胚状体体内形成一致性。作为一种替代方法,介绍了forced-aggregation方法,定义的分离为离心机进圆底超低附件96孔板的允许更好地控制胚状体体型( 62年]。虽然这种方法是可再生的,以及被认为是相当实用和高效,forced-aggregation方法最初不是为心肌细胞分化[开发 62年]。

当时当胚状体的身体心脏分化方法被引入,cardiogenesis有限信息机制在人类多能干细胞。之后,它已成为明显的分化过程可以被添加生长因子,成形素或转基因修改直接多能干细胞向心肌细胞的命运。自发分化为,培养总量或拟胚体,已被证明是增强脱甲基代理5-aza-deoxycytidine [ 61年]。通过胚状体身体5-aza-deoxycutidine心脏分化方法,在8%和70%之间的显示跳动拟胚体领域,和2%到70%的超过地区包括心肌细胞( 61年]。低氧张力被证明能增加心肌细胞的数量为其在生物反应器。心脏分化为4%氧气总细胞数增加30% -47%以及一些心脏标记相比,20%的氧气( 63年]。电刺激与EB分化方法也已被证明能够增强心脏分化为通过机制与细胞内生成的活性氧( 64年]。虽然许多其他方法被用来从多能干细胞生成心肌细胞,形成胚状体体悬挂文化中仍然广泛应用方法诱导心肌细胞分化很大程度上是由于其简单和便宜的性质。

 3.2。Coculture Cardioinductive多能干细胞的细胞类型

心脏分化的另一个方法的灵感来源于关键作用的发育研究表明前内胚层的心脏感应相邻的中层结构( 65年- - - - - - 67年),已被广泛应用于诱导心肌细胞分化 在体外。方法是基于coculture多能干细胞的内脏endoderm-like细胞系(END-2),来自老鼠P19胚胎性癌(EC)细胞,导致细胞跳动集群的形成也显示心肌细胞的特征( 9, 68年]。的心脏分化效率方法可以增强在缺乏血清和抗坏血酸。抗坏血酸已被证明移植后期的标记cardiogenesis [ 69年]。他人以及我们小组发现,这种区分方法相对与诱导多能干细胞( 70年]。END-2条件媒体(END-2-CM)系统也得到了证实诱导健壮的心肌细胞的分化hESC-derived拟胚体( 71年- - - - - - 73年]。心肌细胞分化的多能干细胞与END-2细胞共培养后12天内发生。基于心肌细胞表型和电生理学,大部分的多能干细胞心肌细胞类似于人类胎儿心室心肌细胞( 9]。然而,心脏分化效率从标准END-2共培养实验通常是相当低的。

基于知识从发育生物学,cardioinductive信号被认为来源于直接的细胞,细胞接触和/或从END-2细胞分泌因子刺激胚胎内胚层的存在( 71年]。虽然END-2心脏感应的确切机制仍不清楚,检查参与组成分泌腺的转录组和END-2细胞已经被描述 74年, 75年]。心脏感应通过END-2-CM可以至少部分模仿胰岛素消耗( 72年),抑制p38 MAPK [ 66年),和增加前列腺素E ( 73年]。END-2细胞已被证明清楚胰岛素从媒介和PGI分泌更多2比任何其他类型的老鼠细胞缺乏心脏诱导效应( 72年, 73年]。有趣的是高浓度的胰岛素似乎支持差异化neuroectoderm,和阻塞p38 MAPK进一步增强了心脏分化( 71年]。p38 MAPK信号被发现是高度活跃的neuroectoderm形成和cardiomyogenesis抑制剂,从而阻断这种途径可能忙内消旋/内胚层分化[ 71年]。这些修改END-2培养协议已报告导致准备20% - -25%的心肌细胞。进一步确定心肌细胞的诱导因素END-2细胞可能提供机会发展和更高效的流程定义诱导干细胞分化的心肌细胞和心脏祖细胞。最近,一个由金属堆焊方法诱导成熟的心肌细胞开始分化与END-2细胞共培养,新鲜END-2细胞紧随其后的是一个简短的三维培养步骤描述( 76年]。方法使心肌细胞维护长达1年越来越成熟的电生理特性以及起搏细胞的数量增加。

 3.3。指导心肌细胞分化与特定的因素

cardiogenesis可以捕捉的信号通路调节细胞培养的特定生长因子如fgf, bmp,实际上wnt。BMP4的多项研究表明,组合,Wnt3a和激活素诱导gastrulation-like事件和中间/内胚层发展多能干细胞( 77年- - - - - - 79年]。至少前内胚层的cardioinductive活动的一部分是由生长因子属于TGF β总科( 80年, 81年),指导心脏分化涉及两个TGF β家庭成员,激活素A和BMP4,被描述 27]。在这种方法中,基于高密度单层,多能干细胞培养在馈线系统和游离心肌细胞分化是由定义的无血清培养基,诱导补充顺序BMP4和激活素a被生长因子,细胞无血清培养系统中维护一个额外的2 - 3周在缺乏外源生长因子。自发收缩区域通常观察到大约10天后感应与苯丙酸诺龙、和保持酶的分离准备在三周后感应通常由心肌细胞> 30% ( 27]。都为其和“诱导多能性”细胞分化心肌细胞,使用这种方法( 17, 27]。

另一个协议还包括TGF β家庭分子还利用规范的重要角色在cardiogenesis Wnt信号。规范Wnt信号施加stage-dependent影响心脏分化:是中胚层诱导所需但必须抑制后的感应precardiac中胚层( 55, 56]。基于这些信息,引导胚状体身体差异化协议开发涉及感应的一种原始streak-like人口除了心脏中胚层的形成与激活素a, BMP4, bFGF, VEGF随后心脏规范和Wnt抑制剂,消退( 57]。这个协议被描述生产人口-50% ~ 40%心肌细胞组成。协议被排序的区分文化进一步加强早期心血管祖表达式的基础上Flk-1(也称为KDR)。早期的微分拟胚体包括两个KDR+人口:人口(即早期hemangioblast。,hematopoietic and endothelial progenitors) and another multipotent cardiovascular progenitor population that can be distinguished at 5-6 days after induction based on their differential expression of KDR and the stem cell marker c-kit [ 82年]。特别是,如果KDR高/ c - kit+心血管祖细胞通过fluorescence-activated细胞选择排序(流式细胞仪)在单层培养的这个计算然后山肩,他们随后分化成心肌细胞的高纯度制备,内皮细胞和平滑肌细胞。Mesendoderm Wnt3A也被诱导,形成规范的活化剂Wnt / β连环蛋白信号通路在心脏分化协议( 60]。暂时在这个协议,为其治疗Wnt3A或BMP4,胚状体的身体形成的初始步骤,随后降低了大量的血清和胰岛素培养基( 60]。

最近的另一个报告描述BMP2的心脏分化的多能干细胞,代理与Wnt3组合的方式,其表达式是引发的形态形成的机制,推动多能干细胞向早期中胚层和心脏发生的命运 在体外。BMP2-induced Oct-4+和SSEA-1+细胞产生endo / mesendodermal细胞分泌心原性的因素,进一步指导细胞命运向心脏表型在镀mef释放bFGF [ 5]。添加PDGF或VEGF BMP2-induced SSEA-1+细胞培养mef进一步指导的命运向平滑肌细胞和内皮细胞表型。

化学生物学提供了替代方法发现小说调停多能干细胞cardiogenesis细胞信号分子。因此,高通量的分子筛查技术已经利用搜索化合物诱导cardiomyogenesis与潜力 在体外。到目前为止,很少有研究结果发表这样的筛选方法,描述了识别的新型小分子刺激心肌细胞的多能干细胞的生成,包括cardiogenols、抗坏血酸,isoxazolyl-serines,磺酰腙,DMSO ( 69年]。所有这些分子被确定基于能力移植后期cardiogenesis的标志。虽然一些显然有许多影响细胞如DMSO和抗坏血酸,其他人可能更有选择性。这些因素是否直接参与cardiogenesis或如果他们刺激某些其他细胞群进而激活心脏发展还有待确定。

 3.4。心脏祖细胞

越来越多的证据表明,三大心脏细胞谱系可能出现从一个公共的多功能心血管祖细胞群起源于原始记录和显示标记如Flk-1的具体表现,c - kit, Isl-1 [ 5, 57, 82年- - - - - - 84年]。最近这些心血管祖细胞在早期还确认了多能干细胞衍生品( 5, 57]。在文化由于其增殖能力,这些细胞群将是理想的升级 在体外。此外,这些早期心脏前体细胞限制将允许建立的祖细胞 在体外模型揭示cardiogenesis的早期事件。策略可以改善心肌细胞产量通过刺激承诺祖细胞增殖也可能是有价值的。信息关于信号刺激仍然缺乏承诺祖细胞的复制;然而,激活规范Wnt信号已被证实能扩大Nkx2.5池+,Isl1+早期心脏祖细胞( 39, 54, 60, 85年],Notch通路的激活未成熟心肌细胞已被证明延长段复制的能力( 86年, 87年]。其他介质暗示可能持有坚定的祖细胞增殖状态的GSK-3抑制剂生物( 88年],p38 MAPK抑制[ 89年),和PI3K / Akt通路 90年]。

 4所示。浓缩干细胞心肌细胞的策略

尽管当前心脏分化的巨大的进步在发展协议,没有任何现有的协议结果同质群体的心肌细胞。过去一年的一个挑战开发健壮的隔离技术,使心肌细胞的可伸缩的净化和特定的心脏亚型。最直接的方法是基于手动机械隔离解剖的自发收缩心肌细胞。microdissected细胞甚至相对低纯度的细胞群可以包括心肌细胞(70% 6, 9, 24]。另一个公平利用的方法呈现显著提高了浓缩过程是Percoll密度梯度离心法,它利用独特的活跃的心肌细胞的性质。Percoll离心分离可能导致心肌细胞的3 - 7倍浓缩并已申请从拟胚体和引导具有分散细胞分化协议( 7, 22, 27, 77年]。然而,这些浓缩协议缺点关于纯度不足,相对劳动密集型的过程,和缺乏可伸缩性。

最近的一项研究利用一个内生表示表面标记时,ALCAM,从混合分离心肌细胞分化细胞( 78年]。然而,这种方法已经被证明相当具有挑战性的净化心肌细胞的多能干细胞由于可用cardiomyocyte-specific细胞表面标记的限制。另一个最近的研究表明,线粒体荧光染料标记可用于选择性地标记人类多能干细胞心肌细胞,随后,用于心肌细胞(纯度> 99%)的浓缩fluorescence-activated细胞排序( 91年]。其他最近的报告也证实了早期的引导差异化和随后的隔离人群的心血管祖细胞,表达Oct4 SSEA-1, Mesp1。祖细胞的分离是基于细胞排序使用anti-SSEA-1抗体允许分离的细胞表达信使rna和蛋白质编码中胚层和心脏标记( 5, 92年]。

迄今为止,纯度最高水平的心脏已经利用基因选择技术获得的。在这个策略,未分化的多能干细胞转基因携带报告基因,通常绿色荧光蛋白(EGFP)或哺乳动物选择基因(如抗生素耐药性)心脏启动子的转录控制下。转基因细胞诱导分化,选择基于心脏启动子的激活。虽然这种方法的主要缺点是它需要的一般风险基因改造(如插入肿瘤形成),它能够很大程度的心脏浓缩( 79年, 93年]。人类的基因选择基于激活 αmhc ( 94年, 95年]或MLC2v [ 96年, 97年)启动子已被证明产生人类多能干细胞心肌细胞> 90%的数量。总之,大多数最近出版的心肌细胞浓缩研究证明使用转基因策略的优点基于心脏耐药性选择,要么单独或结合报告基因方法( 73年, 98年, 99年]。其他细胞类型的影响心脏分化是一个方面仍需要进一步研究,以确定在哪个州净化优化( One hundred.]。而通常被认为是有用的 在体外应用,改进和/或替代策略需要开发之前克服额外的障碍将转基因细胞引入临床细胞疗法。

 5。多能干细胞心肌细胞的特征

近年来,许多研究已经发表多能干细胞心肌细胞的基本特征进行了描述。在这些报告中,细胞分析一直是基于特定的分子标记心肌细胞的表达,结构的建筑物,和功能。虽然异质性有报道称,一般来说,30% -60%的细胞在孤立打击地区显示标记和其他功能的心肌细胞( 6, 101年- - - - - - 103年]。多能干细胞心肌细胞通常拥有更少的定义杆形状而成熟的成人同行。此外,多能干细胞心肌细胞显示multinucleation以非常有限的频率(< 1%) 101年)相比,成人心肌细胞(20%)。在超微结构水平多能干细胞心肌细胞显示明显idenfiable观察用,我和Z乐队和闰盘缺口juctions和细胞桥粒,这些细胞与成人心肌细胞有相似之处尽管肌纤维和sarcomeric组织表明人口不成熟干细胞的表型( 6, 61年, 101年, 102年]。附近的观察,mitochonrdia也在场。

在分子水平上,表达的几个标记心肌细胞也表达了多能干细胞心肌细胞,包括转录因子、结构蛋白、激素、离子通道、紧密连接蛋白( 6- - - - - - 9, 61年, 67年, 103年]。早期心脏转录因子的表达参与cardiogenesis GATA-4等Nkx2.5, Isl-1, Tbx-5, Tbx-20, Mef2c通常观察到的多能干细胞心肌细胞( 6, 7, 61年, 67年, 103年]。除了结构蛋白包括sarcomeric蛋白质 α辅肌动蛋白、心脏肌钙蛋白T,和我,肌节肌球蛋白重链(MHC),心房和心室肌球蛋白轻链(MLC-2A和MLC-2V),肌间线蛋白,和原肌球蛋白、缝隙连接蛋白表达( 7- - - - - - 9]。其他心脏和阳性蛋白包括心房利钠肽(ANP)、肌酸kinase-MB,肌红蛋白也被描述在几个报告( 7, 104年]。肌钙蛋白复合体位于薄丝的横纹肌和调节肌肉收缩反应在细胞内钙离子浓度的变化。

更重要的是,然而,是细胞的功能特征,不同的药理和电生理学的方法被用来检查这些属性。在成熟的心肌细胞,收缩引发的多能干细胞心肌细胞胞内钙上升[ 9, 105年]。然而,细胞内的钙处理的规定已被证明不同多能干细胞心肌细胞和心肌细胞成熟的成年人之间最有可能由于显然不成熟的肌浆网被认为是由于缺乏蛋白的表达受隐钙素,这是两个主要的细胞内钙处理的蛋白质( 105年- - - - - - 107年]。心肌细胞来源于多能干细胞的一个主要优点是,他们可以长时间保持在文化甚至几个月没有失去他们的自发收缩能力。虽然多能干细胞心肌细胞显示明确cardiac-type动作电位(AP),这些细胞表现出相对不成熟的美联社等参数自动性,慢美联社的一击,相对去极化的潜在最大舒张压( 8, 108年]。几项研究已经表明,多能干细胞心肌细胞表现出自发收缩活动,可以调制通过异丙肾上腺素等药物和碳酰胆碱,因此这些细胞对α/该项-和毒蕈碱的刺激进一步表明细胞表达特定的表面膜受体与信号通路激活离子通道,膜转运蛋白,肌丝蛋白( 6, 7, 103年]。相比一个典型的成熟心肌细胞收缩振幅增加特征(即增加刺激。,the force-frequency relation) in the adult myocardium, pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes have been reported to respond in the opposite manner and display negative force-frequency relations [ 104年]。

在一般情况下,心肌细胞诱导多能干细胞导致混合物的ventricular-like, atrial-like,像起搏器细胞定义为细胞内电生理测量动作电位(APs)。所示电压钳研究多能干细胞心肌细胞表现出预期的离子电流,如快钠电流,l型钙电流、起搏器电流以及瞬时外向和内向整流钾电流( 9, 108年)有趣的是,不同的差异化协议似乎影响这些心脏细胞类型的比率。虽然大多数差异化协议基于拟胚体/细胞聚集的结果或多或少相同数量的心室-和atrial-like细胞,心脏END-2诱导的培养通常导致细胞群的大部分心肌细胞显示ventricular-like表型基于形态和电生理参数( 9]。

总之,基于基因表达谱和结构、电生理和药理性质他们拥有成熟的多能干细胞心肌细胞表型,似乎一个不成熟的肌浆网功能。“诱导多能性”细胞衍生的心脏表型心肌细胞似乎与hESC-derived心肌细胞( 17]。多能干细胞心肌细胞已被证明成熟文化随着时间的推移,但没有携带到完全成熟。因此,进一步的研究是需要找到新的战略,以成熟的多能干细胞心肌细胞 在体外。然而,即使某些功能性质的多能干细胞心肌细胞明显不同于成熟的细胞存在于成人心肌 在体外生成心肌细胞有一个基础的功能和分子心脏病学仍然可以提供一个有用的模型。

 6。结论和未来的角度

心脏分化是一个动态的过程组成的复杂的信号网络,尽管各种信号通路和生长因子的发展涉及专业心脏亚型,有限的信息机制的底层cardiogenesis人类多能干细胞是目前可用的。因此,多能干细胞向心肌细胞的分化与其他细胞相比仍然是定义糟糕的命运。一系列差异化协议描述了生成心肌细胞的多能干细胞。集体、各种心脏分化研究演示各种生长因子的暴露多能干细胞,在准确的时间和剂量,对指导至关重要mesendoderm通过早期中胚层的分化过程朝着一个更具体的心脏的命运。尽管心脏分化协议中的最新进展,多数情况下心肌细胞分化是不受控制的和低效的剩余不到10% 69年]。大部分的诱导多能干细胞生成迄今为止受到病毒集成可能影响这些细胞的cardiogenesis。然而,人类“诱导多能性”细胞似乎心脏潜在的高度比为,和“诱导多能性”细胞可以分化成心肌细胞使用相似的分化协议( 17]。基于协议使用的变化和多能干细胞分化为心肌细胞的效率,看来多能干细胞系包括hESC和诱导多能干细胞的行为完全不同,暗示特定的多能干细胞线使用可能会影响最终结果。因此,每个多能细胞系可能需要特定的分化协议有效诱导cardiogenesis进一步复杂化的总体任务。显然,更深入的了解这些机制将提高收益率的多能干细胞心肌细胞大规模和临床应用。

到目前为止所描述的干细胞心肌细胞,通常像胎儿心肌细胞表现出不成熟的心肌细胞功能和结构特点与成人相比,只在细胞培养中慢慢成熟的。此外,分化的细胞混合非心脏细胞和心肌细胞的数量与几个亚型(例如,心室、心房,节点类型)和成熟阶段。目前,我们还缺乏有效的方法来指导心脏亚型分化以及从异构池分离心肌细胞和心肌细胞亚型分化细胞。因此,高效浓缩策略心肌细胞以及迫切需要不同的心脏亚型。最近的一项研究提供了一个战略浓缩的心肌细胞,特别是特定亚型的心肌细胞的生成,nodal-like细胞,没有基因改造。他们利用Ca的活化剂2 +激活钾离子通道的小和中间电导(SKCas)胚胎干细胞导致心脏中胚层诱导和心肌细胞规范导致强烈的像起搏器浓缩细胞( 109年]。

大多数当前的心脏分化方法产生跳动的总量,但对许多目的,单层心脏分化将是最优的。然而,它已经表明,胚状体体内细胞间的相互作用和总体结构为mesendoderm刺激标记的表达和早期心脏细胞谱系,认为这有利于优化三维细胞聚集的多能干细胞分化心肌细胞( 60]。然而,当前协议产生心肌细胞分化,拥有许多有前途的能力和广泛实用基础研究以及制药行业。在未来,心肌细胞干细胞预计有一个巨大的影响心脏病的治疗。引起“诱导多能性”细胞的能力提出了重组的可能性体细胞为另一种分化命运没有首先成为一个干细胞。最近,结果表明:三种转录因子的结合(Gata4、Mef2c Tbx5)重组心脏或真皮成纤维细胞直接转化为心肌细胞自发收缩,心脏标志物表达( 110年]。这些诱导心肌细胞提供了另一个重要的选择研究,药物发现和细胞疗法对心血管再生。

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