SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 582382年 10.4061 / 2010/582382 582382年 研究文章 Cotransplantation脂肪Tissue-Derived分泌细胞间充质干细胞和造血干细胞:一种新的治疗胰岛素依赖型糖尿病 Vanikar 答:V。 1 戴夫 s D。 1 塔迦尔 美国G。 2 Trivedi h·L。 2、3 邦内尔 布鲁斯。 1 病理学系 医学实验室 输血服务和免疫血液学 h·l . Trivedi移植科学研究所博士 印度 2 美国肾脏学和移植医学 g . r . Doshi和k . m . Mehta肾脏疾病研究所和研究中心(IKDRC) 印度 ikdrc-its.org 3 h·l . Trivedi移植科学研究所(其) 民用医院校园,Asarwa 380016年古吉拉特邦艾哈迈达巴德 印度 2010年 06 12 2010年 2010年 01 04 2010年 10 06 2010年 25 11 2010年 2010年 版权©2010 A。诉Vanikar et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

的目标是。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)被认为是一种自身免疫性疾病,干扰葡萄糖/胰岛素代谢,需要终生胰岛素替代疗法(红外热成像),30%的患者出现终末器官衰竭。我们提出我们的经验cotransplantation脂肪组织衍生的分泌细胞骨髓间充质干细胞(IS-AD-MSC)和培养(CBM)作为这些病人的红外热成像。 方法。这是一个潜在的非盲临床试验,以测试的有效性和安全性IS-AD-MSC + CBM治疗IDDM co-transplantation,机构审查委员会批准的知情同意后在11(男性:女性:7:4)患者1-24-year疾病持续时间、年龄:13-43年,外源性胰岛素需求的平均值1.14户/公斤体重/天,糖化血红蛋白(Hb1Ac): 8.47%,和c -肽水平:0.1 ng / mL。从活体供体,Intraportal注入xenogeneic-free IS-AD-MSC受到文化定义条件和分泌细胞表型分化,意味着量子:1.5毫升,表达Pax-6 Isl-1, pdx-1,细胞计数: 2。1 × 10 3 / μL, CD45−/ 90+/ 73+:40/30.1%,c -肽水平:1.8 ng / mL,和胰岛素水平:339.3国际单位/毫升与煤层气意味着量子:96.3毫升和细胞计数: 28.1 × 10 3 / μL, CD45−/ 34+:0.62%,。 结果。所有被成功移植没有任何不利影响。意味着后续的23个月,他们有一个减少的意思是外源性胰岛素要求0.63户/ kgBW /天,Hb1Ac至7.39%,血清c -肽水平提高到0.38 ng / mL,并成为免费的糖尿病酮症酸中毒的事件平均2.5公斤体重正常的素食饮食和身体活动。 结论。这是第一次报告的IDDM insulin-secreting-AD-MSC + CBM治疗安全有效地使用相对简单的技术。

 1。介绍

糖尿病(DM)的发病率一直在增加在一个epidemic-like时尚全球在过去的二十年。印度有望成为世界资本的DM(2030年 1- - - - - - 3]。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是第二个最常见的慢性疾病的儿童被认为是自身免疫性分泌胰腺的性质和特点是不可逆转的破坏 β胰岛细胞。当制造胰岛素的症状出现 β细胞团会减少大约90%导致严重缺乏胰岛素和高血糖。目前管理的唯一治疗选择终身外源性胰岛素制剂。零星的报道自体造血干细胞移植(HSCT)已报告与有限的成功 4]。

我们提出我们的经验的胰岛素替代疗法(红外热成像)co-transplantation体内脂肪组织衍生的间充质干细胞(IS-AD-MSC)和cultured-bone-marrow——(CBM)派生HSCT 11 IDDM患者。

 2。研究设计(图< xref ref-type =“无花果”掉= "应该" > < / xref > 1)

这是一个前瞻性非随机开放临床试验进行了从2007年10月至2008年9月测试的有效性和安全性结合IS-AD-MSC IDDM患者和HSCT红外热成像。HSC co-transplantation与IS-AD-MSC旨在增强后的效果。网膜的静脉输液进行这样的细胞会被困在肝微循环和肝脏,耐受性器官,不会拒绝他们。机构审查委员会批准同意表格和临床试验。

入选标准是病人5到45岁之间,任何性别,证实诊断的IDDM至少6个月,低水平的血清c -肽水平(< 0.5 ng / mL)。

排除标准是积极为艾滋病毒/ HbSAg血清学/丙肝病毒和潜在的血液,nephrologic,心脏,精神病,或肝疾病,怀孕。

健康非糖尿病的捐赠者从家庭的接受者与患者匹配的血型,那些愿意捐赠脂肪和骨髓(BM)被批准为捐助者在这项研究协议后通知书面同意。

 3所示。方法 3.1。脂肪组织和BM采购从捐献者

脂肪组织(大约2通用)与腹前壁切除的捐助者−14天,缝合止血后采取实现并送往干细胞实验室文化的适当的运输中获得MSC和进一步分化成体内细胞。天10−−9,捐赠者与注射刺激粒细胞集落刺激因子(g - csf), 7.5 μ克/公斤体重/天皮下注射之后,BM愿望从髂后上嵴在局部麻醉下,在这60毫升BM收集−8天。

 3.2。从脂肪组织分离MSC

的切除脂肪组织被送往实验室自行设计扩散介质与杜尔贝科的修改鹰的介质(美国σDMEM)(高葡萄糖),20%白蛋白(生命科学的依赖、印度),纤维母细胞生长因子:2 ng / mL, 1%丙酮酸钠,和适当的抗生素包括青霉素、链霉素、头孢噻肟、fluconazol和刀剁碎成小块在胶原酶I型(10毫克/毫升)的解决方案。的全部内容中被加工在培养皿和切碎后,他们被放置在孵化器37°C与瓶安排1小时35 RPM,随后转移到15毫升离心管,离心780 RPM 8分钟。离心后上清液和颗粒在增殖培养基培养分别在100平方。25平方厘米,。厘米细胞+板块(美国Sarstedt),分别在37°C和5%的二氧化碳在潮湿条件下10天。媒介是每隔一天补充。

 3.3。文化和h-AD-MSC成分泌细胞的分化

文化扩散介质的第十天,细胞被洗的磷酸缓冲盐(1 N)。通过胰蛋白酶化细胞收获(0.25%胰蛋白酶EDTA溶液,嗨,媒体,印度)使用台盼蓝和检查的可行性,不育(美国Bactec)和纽鲍尔室数量修改。流仪分析的细胞,CD 45 (/ CP)消极,CD90 (PE) / CD73 (PE)(美国Becton, Dickinson)阳性。他们也染色染色和进一步受到体内细胞使用差异化与DMEM培养基(葡萄糖- 17.5毫米),DMEM: F 12,烟酰胺、苯丙酸诺龙,Exendin 4、五肽胃泌素,肝细胞生长因子,B-27,血清n -补充,和抗生素。这个鸡尾酒基因表达上调,滋养细胞,防止其进一步扩散。没有异基因的材料使用。

细胞被保存在这个中等分化为3天,然后被隔离在聚蔗糖Hypaque密度梯度。

 3.4。检测分子标记鉴定的胰岛素分泌MSC

细胞颗粒被稀释的介质和检测不育后,生存能力,和细胞计数,免疫荧光检测转录因子的表达,配对盒6 (Pax-6),胰高糖素的标志生产、isl-1,胰岛细胞的正常发展的关键调节器,胰岛素的基因上调表达,胰十二指肠同源框基因(pdx-1)的监管机构 β细胞特定的基因表达,功能和自我更新的 β祖细胞( 5, 6]。

c -肽和胰岛素

从培养细胞的上清液测定化学发光。

 3.5。葡萄糖的挑战分析

在6孔板细胞进一步孵化5细胞/厘米平方的浓度。没有葡萄糖,葡萄糖(90毫米),5毫升,10毫升分别为2小时和胰岛素和c -肽水平测定。

 3.6。BM的文化

吸气BM受到体外的扩张在自行设计使用DMEM培养基:F12(1: 1) 20%的白蛋白,促红细胞生成素(V.H.B.生命科学公司,印度),10 μL / 100毫升,g - csf (Gennova生物制药、印度),10 μL / 100毫升,丝裂霉素C, 2 μL / 100毫升,不必要的氨基酸,1毫升/ 100毫升,抗坏血酸,10 μL / 100毫升,抗生素在二氧化碳培养箱37°C和5%二氧化碳在潮湿的条件下。没有异基因的材料使用。媒介是补充每隔一天8天。

 3.7。接受条件

Nonmyelo-ablative低强度调节包括目标特定的辐照subdiaphragmatic淋巴结、脾、骨盆骨的一部分,腰椎(200 cGY×5天)从8−−3天的移植。Anti-T细胞抗体,1.5毫克/公斤BW和anti-B细胞抗体,6毫克/公斤体重管理静脉注射在天2−1,分别以防止排斥和促进移植细胞的移植。没有post-transplantation使用免疫抑制药物。

 3.8。细胞移植

0天细胞混合移植到受体在全身麻醉下按照我们自己的技术网膜的管子通过mini-laparotomy中线处切口的3厘米是5厘米以上脐,网膜静脉插管使用20针规和细胞融合的速度是6 - 8毫升/分钟。网膜的静脉输液后结扎用丝绸,止血,伤口关闭检查vicryl 2/0针和表皮下的针被使用3/0 monocryl [ 7]。

 3.9。病人的监测具有重要的意义

患者密切监测4小时血糖水平后移植后3天12小时监测1周。空腹和餐后血糖(BS) (PP)水平检查每周1月和每2个月。血清c -肽水平测量每日1周和混合餐宽容每周1月。胰岛素注射了滑动规模与客观的维护的边后卫< 150毫克%,十亿分之200毫克%左右。谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体ELISA技术监控(Euroimmun -Medizinische Labordiagnostika AG)、英国)之前,输液后3个月。接收方每月体重,和糖尿病酮症酸中毒的数量(分析)集注入前后的监控和评估。糖化血红蛋白(Hb1Ac)(参考范围:正常:< 8.3%,良好的控制:8.3到9%,合理控制:9 - 10%,可怜的控制:> 10%,Erba诊断曼海姆GmbH,德国)水平在两个月的间隔post-transplantation测量。

研究的关键端点发病率,死亡率,从干细胞移植麻烦的副作用,外源性胰岛素的变化需求(每天/持续时间)。二次端点与mixed-meal耐量试验血清c -肽水平在每月的间隔,GAD抗体和Hb1Ac干细胞移植。

 3.10。病人

男性11例(7、4女性),平均年龄为21.1岁(范围:13-43年)意味着疾病持续时间为8.2年(范围:24年)受到co-transplantation IS-AD-MSC + HSCT。七11患者相关分析集(1到5集)。意味着Hb1Ac水平8.47%(范围:6.2 - -10.3%)和平均胰岛素的要求是1.14户/ kgBW /天(范围:0.42 - -2.4单位每天)。

 4所示。结果

捐赠者是父母和兄弟姐妹,1 4例表兄,叔叔在2例。

4.1。干细胞

平均总量子细胞移植96.3毫升(范围:92 - 118毫升)与煤层气的有核细胞计数: 28 × 10 3 / μL(范围:12.2 62.7 × 10 3 / μL)和MSC - 1.2 × 10 3 / μL(范围:0.5 2。1 × 10 3 / μL),意味着CD34+,0.62%(范围:0.06 - 2.01%),意思是CD 45−,90年+/ 73+计数,39.99%(范围:16.6 - 81.4%)/ 30.1%(范围:14.1 - 65.7%)。所有这些转录因子表达pax-6, pdx 1, isl-1(图 2)。意思是c -肽水平的细胞接种物1.84 ng / mL(范围:1.15 - -3.6 ng / mL)和胰岛素水平为339.3 μ国际单位/ L(范围:118 - 739 μ国际单位/ L)。

艾哈迈达巴德的范式Cotransplantation IDDM的胰岛素分泌和造血干细胞。

间接免疫荧光法证明pax-6, isl-1 pdx-1,从左到右,×100。

 4.2。病人的价值观

意味着移植前血清c -肽水平的0.1 ng / mL(范围:0.02 - 0.3 ng / mL)逐渐增加到平均0.37 ng / mL(范围:0.1 - 1.8 ng / mL)(正常范围:0.7 - 1.9 ng / mL Monobind . n:行情),美国),移植前外源性胰岛素需求1.14户/公斤体重/天(范围:0.42 - -2.1 /公斤体重/天)下降到0.63个单位/公斤体重/天(范围:0.09 - 1单元/公斤体重/天)(图 3(一个))。这是观察到有外源性胰岛素需求在逐步下降2到4个月保持稳定(图 3 (b))。意思是在移植Hb1Ac 8.47%(范围:6.22 - 10.3%)下降到7.39%(范围:5.72 - 8.98%)。

(a)的比较。c -肽水平和胰岛素需求前后(7个月)干细胞移植。(b)跟踪外源性胰岛素的需求(单位/ KgBW /天)。

GAD抗体10到210国际单位/毫升5例下降到4之间的值180国际单位/毫升和3例中值> 2000国际单位/毫升在移植仍然是一样的。没有功能之间的相关性观察胰岛素需求/ c -肽水平和GAD抗体水平。

 4.3。统计分析

胰岛素需求、Hb1Ac和血清c -肽水平受到学生的配对t检验和胰岛素的变化被发现最重要的要求 P = 。 009年 Hb1Ac显示, P = 。 03 和c -肽值显示 P = 。 05年 。

没有不良/麻烦的副作用有关干细胞注入或政府的诱导治疗。超过平均跟踪7.3个月(范围:2.2个月到1年)所有病人输液后继续有一种幸福的感觉,是身体更加活跃,警惕,在正常的素食,并在职业和个人生活中更好的恢复。有一个缺乏分析集在所有人留下了深刻的印象。移植前的重量54.6公斤(范围:23.5 - 82公斤)略微增加到55.2公斤(范围:25 - 82公斤)。

 5。讨论

IDDM的治疗策略,以解决免疫失调包括nonactivating CD3单克隆抗体、基因治疗、自体HSCT,注入的树突细胞,t调节淋巴细胞,脐带细胞,胚胎或成体干细胞,同种异体的BM移植( 4, 6]。体外的啮齿动物模型显示MSC源自BM和脾脏胰岛素分泌治疗高血糖的能力( 8]。已发现人类BM-derived脂肪tissue-derived MSC是相同的细胞分群的啮齿动物( 9]。我们已经从人类脂肪组织生成的体外MSC资格定义标准化的间充质干细胞和组织委员会国际社会的细胞疗法。MSC被定义为细胞有plastic-adherence当维护标准培养条件下,必须有成骨的能力,脂肪形成的chondrogenic分化,必须表达CD73, CD90、CD105,而且必须缺乏表达造血谱系标记c - kit, CD14, CD34, CD 45, CD 11 b, CD79 CD 29日 α,HLA-DR [ 10]。我们的细胞满足这些标准。我们进一步分化他们的胰岛素分泌细胞表型定义文化条件下相同的胰腺 β细胞( 11]。这些细胞转录因子表达pdx-1、pax-6 isl-1,所有三个中央控制基因重组nonpancreatic细胞替代的能力 β细胞的功能。再次我们的技术是一个捷径non-pancreatic细胞重新编程相比,基于矢量的基因转移技术( 12]。

我们的结果支持论点,结合这三个转录因子代表建立异位分泌胰岛素的机制。这些令人兴奋的结果提出有趣的问题;这种分化是否涉及到表观遗传重编程,或核MSC的内容变得宽容,允许激活转录程序 β细胞的功能。任何可能的原因这一战略工作即使在远亲的细胞来源。

 6。结论

这是第一次报告的成功治疗IDDM co-transplantation体内脂肪组织衍生MSC和HSCT。容易皮下脂肪组织的和可重复的访问提供了一个明显的优势在隔离BM的MSC。分离和培养技术是简单和容易执行。

 缩写 BM:

骨髓

 CBM:

培养的骨髓

 分析:

糖尿病酮酸中毒

 糖尿病:

糖尿病

 DMEM:

杜尔贝科修改鹰的媒介

 迦得:

谷氨酸脱羧酶

 g - csf:

粒细胞集落刺激因子

 Hb1Ac:

糖化血红蛋白

 HSCT:

造血干细胞移植

 IDDM:

胰岛素依赖型糖尿病

 红外热成像:

胰岛素替代疗法

 IS-AD-MSC:

胰岛素分泌脂肪组织提取间充质干细胞。

 确认

作者感谢Yazdi Wadia, Priyadarshini Shah的统计分析和打字。c . n . Patel j . v . Patel a·g·Bhargava b . n . Patel, p . n . Bhavsar进行的实验室检测包括flowcytometry分析案例中提到的。

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