扫描 扫描 1932 - 8745 0161 - 0457 Hindawi 10.1155 / 2020/9371516 9371516 研究文章 SEM疯牛病的3 d图像分析胆脂瘤将影响人类砧骨骨破骨细胞的骨侵蚀和VpSEM dEDX分析显示新骨形成 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3805 - 9505 Relucenti Michela 1 Miglietta Selenia 1 Bove Gabriele 1 Donfrancesco 奥兰多 1 Battaglione 的支持 1 Familiari 彼得罗 2 Barbaranelli 克劳迪奥。 3 Covelli Edoardo 4 https://orcid.org/0000 - 0003 - 0740 - 0384 芭芭拉 莫里吉奥 4 Familiari 朱塞佩 1 Ardelean 拉维尼娅C。 1 人体解剖学的部门SAIMLAL部分 电子显微镜实验室“彼得罗·m·莫塔” Sapienza大学罗马 通过阿方索博雷利50 00161年罗马 意大利 uniroma1.it 2 部门NESMOS 神经外科单位 Sapienza大学罗马 通过di Grottarossa 1039 00189年罗马 意大利 uniroma1.it 3 心理学系 Sapienza大学罗马 通过一些马西人78 00185年罗马 意大利 uniroma1.it 4 部门NESMOS ENT单位 Sapienza大学罗马 通过di Grottarossa 1039 00189年罗马 意大利 uniroma1.it 2020年 17 2 2020年 2020年 29日 07年 2019年 22 01 2020年 17 2 2020年 2020年 版权©2020 Michela Relucenti et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

骨侵蚀被认为是先进的或复杂的胆脂瘤的典型特征(CHO),尽管它仍然是一个有争议的问题如果骨质流失是由于破骨细胞作用,被特定的文学争议。本研究的目的是应用一个新的扫描表征方法,疯牛病的3 d图像分析,研究病理表面侵蚀人类砧骨骨由曹,肯定为了评估最终监测再吸收的行动。要做到这一点,比较疯牛病的3 d图像吸收缺损(吸收坑)从人类骨质疏松性股骨颈(不容置疑地监测原点)与砧骨。表面参数(面积、平均深度和体积)的计算是通过软件日立MountainsMap©疯牛病3 d-reconstructed图像;结果然后由SPSS统计软件统计分析。我们的研究结果显示,两组之间没有显著差异存在。这种定量的方法实现了形态特征,使我们国家的表面侵蚀砧骨是由于破骨细胞的作用。此外,我们的观察和处理图像工作流在文献中是第一个显示的存在不仅骨质流失,而且在胶原基质小泡释放其内容包和self-immuring骨细胞,砧骨骨表面上所有标记的新骨形成。最近的文献的基础上,假设引起的炎性环境赵可能触发破骨细胞活动,诱发骨侵蚀。观察到的新骨形成可能发生以较慢的速度在正常的骨代谢,过程是分开(最近演示了几个炎性疾病,促进骨质疏松)从而导致整体骨质流失。 Novel scanning characterization approaches used in this study allowed for the first time the 3D imaging of incus bone erosion and its quantitative measurement, opening a new era of quantitative SEM morphology.

 罗马Sapienza大学研究项目资助 1。介绍

一致同意推荐先进的或复杂的胆脂瘤的定义(赵) 1]国家,这是一个凝聚的角质化鳞状上皮,牙龈结缔组织,随着逐步积累角蛋白碎片有/没有周围的炎症反应。关于其微结构曹是由矩阵(角质化的鳞状上皮)perimatrix(牙龈结缔组织变厚度)和角蛋白碎片。胆脂瘤的骨侵蚀被认为是一个典型的特征;然而,这仍然是一个有争议的问题如果骨质流失是由于破骨细胞作用,在当下文学相互矛盾的结果( 2- - - - - - 7]。扫描电镜是一种选择性成像技术骨超微结构的研究( 8- - - - - - 12),所以我们通过创新的SEM观察疯牛病3 d成像和VpSEM EDX分析胆脂瘤砧骨骨表面的影响,为了准确地描述表面修改最后评估如果破骨细胞是骨吸收直接责任。来完成这项任务,我们比较,使用SEM疯牛病3 d成像分析了日立MountainsMap软件,精细结构的吸收坑砧骨骨表面上观察到的吸收从骨质疏松性股骨颈部缺损,不容置疑地监测的来源。砧骨骨表面超微结构的地形也通过VpSEM EDX分析进行了研究。

 2。材料和方法 2.1。样品

我们观察到十八砧骨骨头恢复手术期间除曹获得患者的知情同意和1影响砧骨从尸体骨(控制)。

我们研究了18个股骨颈活检与髋关节关节和绝经后妇女骨质疏松症的人接受手术髋关节置换,1从女人没有骨质疏松股骨颈活检。BMD和t指数来评估骨骨质疏松条件进行评估,用(Hologic Delphi)在手术之前。样本获得患者的知情同意。

研究机构伦理委员会批准并遵守赫尔辛基宣言的原则。

 2.2。扫描电镜的协议 2.2.1。股骨颈活检

样本2.5%戊二醛固定后立即复苏在4°C PBS 48 h,然后在3%的过氧化氢溶液浸泡48小时在室温下(除骨髓),然后用蒸馏水冲洗。样品被用在音响设备( 13在蒸馏水在室温下,用蒸馏水冲洗,在丙酮脱水系列。样品终于干使用临界点干燥机(Emitech K850, Emitech, Corato,意大利),安装在铝存根,铂涂层使用一个Emitech K 550溅射涂布机(Emitech、Corato、意大利),和由日立FE SEM观测年代4000操作7千伏。扫描电镜显微图获得了DISS5数字图像扫描系统(电子,德国)。

 2.2.2。砧骨准备SEM的协议

样本2.5%戊二醛固定后立即复苏在PBS为48 h 4°C;然后,他们轻轻地用超声波设备(去除多余角质化鳞状上皮,防止表面观察)。15个样本准备SEM股骨颈(如前所述)和溅射镀铂使用一个Emitech K 550溅射涂布机(Emitech、Corato、意大利)。由日立FE SEM观测进行了年代4000操作3500 kV和日立SU(日立高新技术欧洲GmbH,曼海姆,德国),在10 kV SE模式。

 2.2.3。砧骨VpSEM协议准备和EDX微量分析

三个样品,在2.5%戊二醛固定后在4°C PBS 48 h,只是轻轻的在用声波设备( 13),然后直接观察苏日立3500(日立高新技术欧洲GmbH,曼海姆,德国),操作5 kV和60 Pa,疯牛病混合涂料模式没有金属涂层。

 2.3。疯牛病3 d图像分析

日立苏3500是一个四方形配备疯牛病探测器允许同时获得四个图像只有一个扫描。四个图片然后集成到3 d图像和处理来提取定量信息(所有这些步骤都是由软件日立7.4地图3 d数字冲浪,比法国)。获得这种数据是非常有用的实现形态分类参数通常用于描述突起,形成骨表面。事实上,收购定量吸收坑等信息区域,平均深度和体积可以比较来自不同来源的坑(股骨和砧骨)最后评估,如果他们有相同的起源。区域包含吸收湾砧骨骨和分析股骨颈样本。疯牛病3 d图像的分隔吸收坑了,4图像相结合的软件,和3 d重建。吸收池区域,平均深度和体积被MountainsMap提取软件在三维图像重建。在更多的细节,我们执行单坑选择三维图像重建,紧随其后的是自动测量区域,平均深度和体积。数据收集和统计分析SPSS统计软件。执行以下测试:汇总统计的常态坑的分布区域,平均深度,和体积值; independent sample t 以及(假设不平等的平等的方差)被用来比较坑面积,平均深度和体积值砧骨和股骨之间的样本。

 2.4。EDX微量分析

本研究中使用的变量压力扫描电镜(VP-SEM,日立SU3500)配备双能量色散x射线能谱(dEDS,力量XFlash®6 | 60)探测器。这台仪器能够同时进行多通道成像和空间分布化学映射,一个真正强大的分析方法来研究生物表面的原生状态。的XFlash®6 | 60特别适合应用程序与x射线收益率相对较低,在nanoanalysis一样普遍。

 2.5。骨表面形态分类参数评估

砧骨骨地区分为吸收并形成骨表面,根据被广泛接受的形态标准中描述的文献[ 8- - - - - - 12, 14- - - - - - 17]。突起,骨表面的特点是大海湾吸收或散射吸收坑的存在(豪希普氏缺损)。这些结构扫描电镜观察到显示闪烁明亮的圆边,地板由胶原束部分软化和被狭窄的排水沟,出现暗在疯牛病成像模式。骨形成表面的特点是一个不规则的表面,与胶原束发生矿化,矿化基质小泡和浅坑(osteocytic缺损),成骨细胞和骨细胞自我禁闭。他们有一个不规则的椭圆形的大范围变化( 18]。

 3所示。结果与讨论

每个曹砧骨样本SEM低倍镜下观察到精确的扫描路径后,为了评估一般骨骼形态学和定义区域适合高放大观察。这种方法允许计算营养小孔开到表面(18日49个小孔的骨头)和识别标志的地区骨侵蚀,有趣的是,新骨形成的地区。这仍然是一个有争议的问题如果由于破骨细胞骨侵蚀行动;此外,新骨形成从未被赵砧骨骨骼中所描述的影响。得到一个有关这些发现,我们进行观察的放大从400 x 600 x,三维图像重建和EDS分析。

3.1。观察正常样本的表面

之前显示的图片和样品吸收区域,两个图像提出了正常的表面(图 1(图):正常砧骨骨表面 1(一))和正常小梁骨(图 1 (b))。两个骨头的表面都是缺乏吸收海湾。

(一)SE模式,400 x。从尸体砧骨骨表面,正常的表面。(b) SE模式,400 x。从病人没有骨质疏松,骨小梁表面正常。

 3.2。观察突起的区域

赵砧骨骨表面的图像显示,67%的营养小孔周围大型吸收海湾,似乎从营养孔开口辐射(数字 2(一个)和 2 (b))。

(一)SE模式,270 x。从曹砧骨骨营养孔。右边的图片,大量吸收海湾、扩展自入孔,是可见的。图片的左边角落,osteocytic缺损是可见的。(b) BSE-COMP模式,270 x相同的样本。深色(软化)区域对应于更深层的吸收海湾。这个字段显示骨吸收和骨形成的现象。

观察到在高放大曹砧骨骨吸收海湾和坑(图 3(一个))就像在各方面与骨质疏松股骨颈表面(图 3 (b))。

(一)FE SEM 700 x,曹砧骨骨吸收湾高倍镜下,破骨细胞蛇小道途径是可见的(箭头)。在吸收湾的中心,一个小岬上升相对耐吸收。600 (b) FE SEM、x,监测吸收湾人类股骨颈骨质疏松性(箭头),他们是破骨细胞起源的明确和不可分辨的(一个)。

绝对评估如果砧骨的破骨细胞骨吸收湾是一个产品的行动,我们使用日立MountainsMap©软件进行三维重建图像(图4疯牛病模式 4)。

三维重建在疯牛病从4图像模式。每个吸收湾包含几个坑。

小范围从3 d-reconstructed图像提取,和每一个坑小面积由软件计算分析:区域,平均深度和体积(数字 5(一个)和 5 (b))。

(a)的提取区域的吸收湾大3 d-reconstructed形象。(b)分隔的单坑的软件计算参数值。

我们分析了79个坑,为每个考虑参数值的记录和统计评估通过SPSS统计软件。首先,总结统计为每个参数进行数据收集,评估常态分布(表 1)。对所有值,数据分布是正常的,所以 t 以及执行的每个参数测量值之间砧骨和股骨评估值(表的区别 2,图 6)。两个系列的独立样本 t 以及,假设分别不平等和平等的差异,进行了比较,平均深度和体积值砧骨和股骨之间。两个系列的证明,两组之间没有差别( p > 0.05 )为每一个参数。

汇总统计的区域,平均深度和体积值。

坑 分布 区域 μ米2 算术 的意思是 ± ds 平均深度 μ米算术 的意思是 ± ds 体积 μ米3 算术 的意思是 ± ds
砧骨 正常的 120.48 ± 8.54 0.799 ± 0.10 96.48 ± 13.16
股骨颈 正常的 121.34 ± 23.2047 0.784 ± 0.16 94.99 ± 23.65

独立样本 t 以及在区域,平均深度和体积值。

区域 平均深度 体积
砧骨 股骨 砧骨 股骨 砧骨 股骨
样本大小 79年 79年 79年 79年 79年 79年
算术平均值 120.48 121.34 0.799 0.784 96.48 94.99
95%可信区间的意思 118.57到122.39 116.15到126.54 0.77到0.82 0.74到0.82 93.51到99.45 89.69到100.28
方差 72.95 538.45 0.011 0.025 173.31 559.32
圣偏差 8.54 23.20 0.10 0.16 13.16 23.65
圣错误的意思 0.96 2.61 0.011 0.018 1.49 2.66
F 以及平等的方差 p < 0.001 p < 0.001 p < 0.001
t 以及平等的方差 t 156年 = 0.310 p = 0.7568 t 155年 = − 0.688 p = 0.4922 t 156年 = − 0.489 p = 0.6258
列文 t 以及不平等的方差 t 98.76 = 0.310 p = 0.7570 t 122.43 = − 0.688 p = 0.4924 t 134.18 = − 0.489 p = 0.6249

图代表坑的分布测量数据(从左到右):砧骨面积与股骨;砧骨平均深度与股骨平均深度;砧骨体积与股骨体积。

 3.3。观察新骨形成的区域

详细的砧骨表面观察允许另一个有趣的发现,砧骨表面上观察新骨形成的区域。我们的SEM图像是第一个显示砧骨的这个过程。在胶原矿化囊泡释放其内容包数据所示 7(一)和 7 (b)。SE模式允许详细的可视化胶原纤维网络而疯牛病模式明确指出基质小泡充满了高分子量的内容和胶原包有不同的矿化程度(轻或较暗的区域)。

SE, BSE comp 5000 x,新骨形成在曹砧骨骨表面。(a) SE矿化基质小泡释放其内容在胶原束(箭头)。(b) BSE comp矿化基质小泡(箭头)显示为明亮的和粗糙的领域。胶原纤维和包变量矿化程度是可见的。矿化区域出现轻疯牛病模式。

这些领域也裸样本变量压力SEM分析了dEDS的分析。变压SEM允许裸的观测样本,避免金属镀层在元素分析扰动。区域包含钙化基质小泡(图 8(一个)dEDS)进行了分析。元素的映射(图 8 (b))清楚地显示中钙的存在矩阵囊泡,而硫、矩阵中包含的蛋白聚糖,只存在于周围的细胞外基质。钙和磷是bioapatite的特征元素( 19- - - - - - 21]。矩阵元素映射显然表明囊泡具有磷酸钙含量。

疯牛病Comp, 3000 x, dEDS分析,确认新骨形成曹砧骨骨头。(一)副总裁SEM BSE图像显示矩阵囊泡(箭头)。(b)元素分布(dEDS分析)允许识别的化学物种,矩阵中的钙在细胞外基质小泡(黄色)和硫(红色)。

后期新骨形成是由骨细胞self-immuring形成骨区域。在图 9、详细的图像osteocytic脱漏了第一次的骨细胞自我禁闭在砧骨表面。在这里,他们完全重合osteocytic裂陷在股骨颈样本。Osteocytic缺损出现被完全矿化胶原束。高倍镜示(图 8 (b)osteocytic腔隙),在地板上,没有完全矿化胶原纤维和深孔可见骨细胞细胞过程雀巢。

新骨形成曹砧骨骨表面(a), FE SEM、250 x, osteocytic缺损(箭头)由self-immuring骨细胞。(b), 5000 x、高放大倍数的osteocytic腔隙,地上似乎更少的矿化和被深孔容纳骨细胞细胞过程。

突出理论在赵破骨细胞是骨吸收的激活;压力坏死;和酸裂解酶的中介,中介(炎症 22]。在中耳胆脂瘤骨侵蚀的机理仍然还不清楚,尽管其组织病理学已被深入研究。

在一些研究 2, 3),破骨细胞突起没有观察到骨与曹砧骨的领域;在别人 4- - - - - - 7),他们报道。这可能是由于破骨细胞的瞬态特性;他们有一个相对较短的生命,在手术完成后炎症控制,他们可能不出席时间的恢复和固定样本。

我们的研究结果表明,区域之间不存在差别,意味着深度、砧骨和股骨之间吸收坑和体积值,让我们国家表面侵蚀砧骨是由于破骨细胞的作用。

破骨细胞是多核细胞,他们从monocyte-lineage造血前体细胞分化( 23]。巨噬细胞集落刺激因子(csf)和核转录因子受体激活 κB配体(RANKL)调节破骨细胞的分化和激活( 24]。在几个炎性疾病,如风湿性关节炎,病理观察骨质流失,加上RANKL生产过剩( 25, 26]。免疫细胞如淋巴细胞和巨噬细胞渗透到受损区域是RANKL的主要来源( 27,成纤维细胞在胆脂瘤perimatrix RANKL表达( 28]。焦骨质溶解是破骨细胞的效应细胞,但细胞因子炎症骨质溶解的关键调节因素( 29日]。il - 1、il - 6、TNF - α和前列腺素E2 (PGE2)调查作为胆脂瘤进展的炎症介质。他们认为增强骨吸收通过激活破骨细胞( 30.- - - - - - 32],炎症已经确认是必不可少的胆脂瘤形成,增长和扩张,包括骨吸收过程( 22, 33, 34]。炎症细胞中观察到我们的样品;在图 10,这是一种罕见的巨噬细胞(蓝色)的共存,淋巴细胞(红色),提出了一个破骨细胞( 35- - - - - - 37]。

炎症细胞和破骨细胞砧骨受赵表面,FE SEM 3000 x。活跃的巨噬细胞(蓝色),淋巴细胞(红色),破骨细胞(黄色)。

骨内稳态维持平衡微破骨细胞和成骨成骨细胞活动,改变这种平衡会导致骨质流失,没有恢复的新骨形成。事实上,在炎症、地域性的RA骨侵蚀的结果过多的骨吸收和骨形成明显有限 38]。我们观察到典型的形态标记的新骨形成砧骨秋,但这种现象可能会发生以较慢的速度比骨吸收,这样不compensed骨质流失。

 4所示。结论

创新的量化方法用于本文实现了经典的表面形态特征,使我们国家的表面侵蚀砧骨是由于破骨细胞的作用。此外,我们的观察和处理图像工作流在文献中是第一个显示的存在不仅骨质流失,而且在胶原基质小泡释放其内容包和self-immuring骨细胞,砧骨骨表面上所有标记的新骨形成。最近的文献的基础上( 22- - - - - - 34),假设引起的炎性环境赵可能触发破骨细胞活动,诱发骨侵蚀;我们可以提供图形态这一假说的证据 9;事实上,早期、巨噬细胞和破骨细胞附近拍摄一个;这张照片给人的印象目睹这些细胞的旁分泌分子之间的对话( 22- - - - - - 34]。观察到的新骨形成可能发生以较慢的速度在正常的骨代谢,过程是分开(最近演示了几个炎性疾病,促进骨质疏松)从而导致整体骨质流失。小说扫描表征方法用于这项研究首次允许3 d成像砧骨骨侵蚀及其定量测量,打开一个新时代的生物定量SEM形貌。将所有因素加起来,我们的形态学结果让我们假设胆脂瘤产生慢性感染的环境特有的生化特征改变正常的骨代谢砧骨骨头。针对炎症微环境的细胞群(产生分子刺激破骨细胞活动)将打开新的治疗选择,在特定的领域的非侵入性的治疗手段,可以抑制骨侵蚀发展获得了中耳胆脂瘤。

 数据可用性

数据存储在计算机的机构,可按照客户要求定制。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项研究是由罗马Sapienza大学的研究项目的资助。

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