1。介绍
的螨
瓦螨负责普遍亏损的蜜蜂殖民地,特别是在北美(
1- - - - - -
4]。
诉析构函数提要血淋巴和脂肪体的宿主和传播致命的病毒(
5,
6]。殖民地上爬满了
诉析构函数与杀螨药治疗比未经处理的殖民地(生产更多的蜂蜜
7),但合成杀螨药导致的频繁使用抵制这些产品的开发在螨种群(
8]。合成杀螨药也可能污染蜂巢产品(
9]。因此,有需求的新化合物具有高miticidal活动,同时是安全的蜜蜂,环境,和不属预定目标的物种(包括蜜蜂和人类)。植物精油和这些物质的成分是有吸引力的杀螨药候选人在蜂巢控制害虫和疾病,因为他们满足这些标准(
10- - - - - -
12]。此外,许多精油及其组件表现出相当大的反对miticidal活动
诉析构函数(
10]。
杀螨药也有毒的蜜蜂在某种程度上(
13]。因此,蜜蜂也有毒农药时激活解毒机制。之一,这些机制导致产量的增加乙酰胆碱酯酶(疼痛),一种酶,这种酶调节乙酰胆碱的浓度在突触水平个人暴露于杀虫剂,如有机磷和氨基甲酸盐(
14),以及拟除虫菊酯(
15和烟碱类
16- - - - - -
18]。因此,疼痛活动被广泛用作神经毒性生物标志物。然而,这些机制的激活和疼痛的生产尚不清楚节肢动物接触精油(
19,
20.]。此外,解毒机制的激活能量要求和昂贵的蜜蜂,这可能会影响他们的生理和健康。因此,重要的是,杀螨药最低限度有毒的蜜蜂,它们不需要投入相当大的资源在解毒过程暴露在杀螨药
蜂螨控制治疗。
本研究调查了茴香脑的毒性,茴香精油的芳香化合物
(Pimpinella anisum),以及精油的柠檬草
(Cymbopogon citratus)和甜香味万寿菊
(万寿菊明星)来
蜂螨虫和蜜蜂。的主要成分
Cymbopogon citratus是monoterpenoid香叶醇,而
万寿菊最亮的星是芳香phenylpropene草蒿脑。其他研究者已经报道了农药植物化合物,我们测试的属性。例如,茴香脑显示毒性几个昆虫(
21,
22),线虫(
23),和螨虫
24]。
Cymbopogon石油可以杀死蚊子
25和螨虫
26]。
万寿菊油价已证明臭虫等杀虫剂对昆虫活动(
27)和蜱虫(
28]。此外,
万寿菊石油已经测试几个蜜蜂的病原体,包括细菌
Paenibacillus幼虫,真菌
Ascosphaera api,和螨虫
诉析构函数(
29日,
30.]。然而,这项研究是第一次评估的相对毒性和选择性茴香脑,柠檬草油
蜂螨幼虫和成年蜜蜂。的表达
疼痛、基因调节生产的解毒酶疼痛,也分析了蜜蜂对待这些化合物。
2。材料和方法
2.1。化合物
茴香脑(技术等级)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),而的精油
Cymbopogon citratus和
万寿菊最亮的星被蒸汽蒸馏从植物组织中获得按艾姆斯和马修斯(
31日]。Tau-fluvalinate,作为积极的控制,也是从Sigma-Aldrich获得。
2.2。< /斜体> <斜体>蜂螨和蜜蜂来源
圭尔夫大学的试验进行的蜜蜂研究中心在圭尔夫,加拿大。殖民地由Buckfast皇后区被用作螨和蜜蜂的来源。螨虫是获得从成年蜜蜂
32)的三个殖民地大量出没
诉析构函数,没有杀螨药治疗至少一年。其他三个殖民地提供成年蜜蜂和幼虫。对于成年蜜蜂,梳子与新兴小鸡被关在笼子里,孵化(33°C和60% RH)一夜之间获得新兴工人,和相同的殖民地为实验提供了幼虫如下所述。
2.3。毒性,<斜体>诉析构函数< /斜体>
经过初步测试,六个对数间隔每个化合物的浓度(表
1)准备在1.5毫升的高效液相色谱级丙酮。然后,根据Gashout和Guzman-Novoa [
33),0.5毫升的每个解决方案放在一个20毫升玻璃闪烁瓶(费舍尔科学有限公司,渥太华,加拿大)吸管,包括丙酮和tau-fluvalinate控制。瓶是推出分发解决方案在他们内心的墙。丙酮蒸发后(约10分钟),瓶受限。五女螨虫被引入到每个瓶用一记漂亮的画笔,在黑暗中在室温下(26°C和65% RH)。总共有280螨虫被用于每个化合物8复制。确定每个化合物的急性毒性,死螨的数量记录在4 h后处理(hpt)。一根针是用来触摸每个螨虫的尸体。如果寄生虫不动,它被认为是死亡。
对数间隔浓度的化合物用于确定致死浓度(LC<年代ub>50(LD)或剂量<年代ub>50)
瓦螨雌螨和工人或幼虫
的蜜蜂,分别。实际浓度如表所示。
| 产品 |
浓度(
μg / ml) |
| 螨 |
工人 |
幼虫 |
| 茴香脑 |
100,150,230,350,530,800 |
25000,29400,34000,40000,47000,55000 |
5000,7200,10200,14600,21000,30000 |
|
Cymbopogon石油 |
160,230,340,500,720,1050 |
7000,11600,20000,34000,60000,100000 |
4000,7000,12000,20000,35000,60000 |
|
万寿菊石油 |
200,320,500,800,1300,2000 |
10000,18000,34000,60000,110000,200000 |
3000,4000,5500,7700,10300,14000 |
| Tau-fluvalinate |
20、40、70、140、260、500 |
20、50、110、220、460、960 |
50、110、220、460、960、2000 |
2.4。对蜜蜂毒性工人和幼虫
植物化合物和tau-fluvalinate溶解在96%乙醇上面获得相同的浓度和局部分析是用来治疗新出现的人员如下。每一个蜜蜂收到5
μl(解决方案的治疗集中在她的前胸借助微量吸液管。总共25蜜蜂治疗/每个化合物浓度和控制蜜蜂与乙醇治疗。治疗组25蜜蜂引入囤积笼子(12.7×8.5×14.5厘米)配备两个20毫升重力喂,一个含有50% (w: v)糖:蒸馏水溶液和其他含蒸馏水。然后,笼子在孵化器举行33°C和60% RH。死去的蜜蜂在24和48 hpt数。三个试验进行了复制。
蜜蜂幼虫为食,梳子含有丰富的第三或第四龄幼虫被从源殖民地将他们视为每Gashout Guzman-Novoa [
33]。简单地说,25幼虫被单独处理5组
μl每个每个化合物浓度的解决方案通过将解决方案与微量吸液管底部的每一个细胞。外缘的细胞包含实验幼虫与无毒涂上不同的颜色标记(L551P2亨特Int,米西索加,,加拿大)来确定治疗方法。包含幼虫的梳子都回到各自的荨麻疹治疗后。死亡率在24和48 hpt决定。珍珠白色幼虫被假定为活着而幼虫与褐色的颜色或细胞由于缺少卫生行为的蜜蜂被认为是死亡。三个试验进行了复制。
2.5。相对选择性比率
评估安全的蜜蜂的天然化合物,相对选择性比率(
34计算)除以的毒性值主机(LD<年代ub>50职工或幼虫)的害虫(LC<年代ub>50的
诉析构函数)。这些比率允许比较的测试化合物相对于彼此,tau-fluvalinate。
2.6。乙酰胆碱酯酶基因表达
实时定量PCR (RT-qPCR)被用来衡量的表达
疼痛工蜂的样本。大约15蜜蜂收集每治疗和复制在0和48 hpt。蜜蜂被放置在塑料袋和保持冷冻后RNA提取的−70°C。
在分析化合物的毒性,控制蜜蜂和蜜蜂处理浓度接近和95%置信区间内的LD<年代ub>5048 hpt被用来衡量价值的表达
疼痛(蜜蜂处理110
μ克/毫升tau-fluvalinate, 34000年
μ克/毫升的茴香脑,60000
μ克/毫升
Cymbopogon或
万寿菊油)。总RNA提取了均质化每个复合试样每治疗15蜜蜂提取缓冲按照陈et al。
35]。的数量和浓度的分光光度法测定RNA (Nanovue通用电气医疗集团,剑桥,英国)和RNA的互补脱氧核糖核酸合成利用cDNA合成装备(恢复援助,Fermentas生命科学、伯灵顿,加拿大)根据制造商的协议。
每20个PCR反应
μL由2
μL (cDNA模板,10
μL SYBR绿色/火箭/ qPCR超级混合(热科学,米西索加、加拿大),0.6
μL(每个特定引物浓度300海里,和6.8
μL nuclease-free H<年代ub>2o .存在反应进行96 -孔板(直径®,米西索加,,加拿大)与BioRad CFX96 (Bio-Rad实验室,米西索加、加拿大)thermocycler。本研究中使用的目标基因引物设计与Primer-BLAST工具,然后验证发夹环和二聚体基因跑步者(黑斯廷软件有限公司,纽约,美国)在获得和调整
疼痛从NCBI(加入NC_007077.3)序列。正向和反向引物用GGACATAATGGCGGCTACGA CTCCTCGCTGTTCGTGAAGT,分别。是使用的参考基因
RpS5(
36]。引物被命令从圭尔夫大学的实验室服务(加拿大圭尔夫,)。
所有反应都设置为每个三个生物复制一式三份。两步循环协议之后,使用Uracil-DNA糖基化酶预处理在50°C 2分钟,一个初始变性为10分钟在95°C,和40周期15在95°C和60年代60°C。消极的控制使用nuclease-free H<年代ub>20而不是cDNA和积极的控制被包含在每个存在运行。引物的效率优化qPCR条件接近100%,与标准曲线确定使用300个基点从串行稀释10倍合成基因片段(gBlocks、集成DNA技术,爱荷华州,美国),其中包括序列的引物,扩增子序列和反向引物。
疼痛转录丰度是相对于参考基因根据量化
2
- - - - - -
Δ
Δ
(Livak)方法(
37使用控制作为校准器。的Bio-Rad大型Manager®软件CFX (Bio-Rad实验室,米西索加、加拿大)比率是用来计算表达式。
2.7。统计分析
数据螨、工人和幼虫死亡率受到使用PoloPlus probit分析软件(
38致死浓度(LC)估计50%<年代ub>50螨)和50%致命剂量(LD<年代ub>50)的工人和幼虫,以及斜坡和95%置信区间的不同的化合物。PoloPlus程序也用于比较的剂量反应的化合物。丰富的数据
疼痛成绩单是
日志
10
转换,然后进行方差分析和LSD测试时发现意义。
3所示。结果
3.1。毒性,<斜体>诉析构函数< /斜体>
茴香脑LC最低<年代ub>50(304.9
μg / ml)的自然化合物测试
诉析构函数,虽然其毒性不明显不同
Cymbopogon石油。
Cymbopogon和
万寿菊油分别排名第二和第三,和不同的毒性
诉析构函数从对方。Tau-fluvalinate更有毒
诉析构函数估计比三个天然化合物与LD<年代ub>5080.44
μ克/毫升(表
2)。
致死浓度(LC<年代ub>50)和95%置信区间估计(CL)
瓦螨雌螨4 h后接触到0.5毫升/瓶6的精油产品和tau-fluvalinate浓度。
| 化合物 |
N
|
信用证<年代ub>50(
μg / ml) |
95%氯 |
斜率±SE |
拦截 |
X
2
|
df |
| 茴香脑 |
280年 |
304.94 |
225.24 - -357.87 |
3.35±0.86 |
- - - - - -
3.31
|
26.70 |
46 |
|
Cymbopogon石油 |
280年 |
474.13 |
349.86 - -592.17 |
2.98±0.39 |
- - - - - -
2.97
|
59.65 |
46 |
|
万寿菊石油 |
280年 |
1256.27 |
1018.54 - -1578.25 |
1.92±0.27 |
- - - - - -
0.97
|
32.89 |
46 |
| tau-fluvalinate |
280年 |
80.43 |
55.76 - -106.42 |
1.71±0.24 |
1.75 |
28.23 |
46 |
平行比较的山坡上的剂量反应行显示茴香脑,之间没有显著差异
Cymbopogon油(
X
2
=
0.28
df = 1,
p
=
0.599
),但茴香脑有剂量反应显著高于
万寿菊油(
X
2
=
5.49
df = 1,
p
=
0.019
)和tau-fluvalinate (
X
2
=
7.78
df = 1,
p
=
0.005
)。没有发现不同的剂量反应
万寿菊石油和tau-fluvalinate (
X
2
=
0.37
df = 1,
p
=
0.544
;图
1(一))。
剂量反应的植物产品或tau-fluvalinate (a)
瓦螨雌螨当暴露4 h到0.5毫升的植物化合物,使用一个小瓶试验,(b)
的蜜蜂工人24小时后局部治疗5
μl的植物化合物,(c)
的蜜蜂幼虫局部治疗后24 h 5
μl的植物化合物。
![]()
![]()
![]()
3.2。对蜜蜂毒性工人和幼虫
最高和最低的有毒新兴工人茴香脑和天然化合物
万寿菊油,分别
l
D
50
年代
不同的显著24和48 hpt。的毒性
Cymbopogon石油对蜜蜂不是茴香脑或明显不同
万寿菊石油,而毒性工蜂tau-fluvalinate明显超过三个天然化合物(表至少207次
3)。相反,幼虫,
万寿菊石油是最天然化合物的毒性,而茴香脑是最有毒的24和48 hpt。LD的<年代ub>50值
Cymbopogon石油是茴香脑和之间的中间
万寿菊石油,但没有与任何的毒性不同蜜蜂幼虫。然而,tau-fluvalinate有毒的幼虫明显多于三个天然化合物在两个时间点(表
3)。蜜蜂幼虫的毒性高于近11倍
万寿菊石油。
致死量(LD<年代ub>50)和其他相关参数估计的工人和幼虫
蜜蜂在24小时或
48小时治疗后5
μl /个人六个浓度的植物产品或tau-fluvalinate。
| 增长阶段 |
化合物 |
时间治疗后(h) |
N
|
LD<年代ub>50(
μg / ml) |
95%氯 |
斜率±SE |
拦截 |
X
2
|
df |
| 工人 |
茴香脑 |
24 |
525年 |
35942.0 |
27984.0 - -44810.0 |
5.69±0.52 |
- - - - - -
20.90
|
23.91 |
16 |
|
48 |
525年 |
35520.0 |
27553.0 - -44249.0 |
5.74±0.52 |
- - - - - -
21.10
|
24.11 |
16 |
|
Cymbopogon石油 |
24 |
525年 |
54844.0 |
40701.0 - -71227.0 |
2.96±0.43 |
- - - - - -
9.05
|
23.88 |
16 |
|
48 |
525年 |
53304.0 |
36493.0 - -72285.0 |
2.92±0.43 |
- - - - - -
8.78
|
22.97 |
16 |
|
万寿菊石油 |
24 |
525年 |
85381.0 |
56652.0 - -11129.0 |
2.96±0.45 |
- - - - - -
9.58
|
26.74 |
16 |
|
48 |
525年 |
83297.0 |
52116.0 - -108460.0 |
3.12±0.48 |
- - - - - -
10.35
|
25.27 |
16 |
| Tau-fluvalinate |
24 |
525年 |
173.49 |
120.20 - -225.60 |
2.59±0.24 |
0.81
|
19.39 |
16 |
|
48 |
525年 |
139.70 |
107.73 - -173.52 |
2.27±0.21 |
0.13
|
18.97 |
16 |
|
| 幼虫 |
茴香脑 |
24 |
525年 |
14518.0 |
11853.0 - -17661.0 |
3.81±0.32 |
- - - - - -
10.85
|
19.03 |
16 |
|
48 |
525年 |
14143.0 |
11441.0 - -17085.0 |
3.89±0.34 |
- - - - - -
11.16
|
18.72 |
16 |
|
Cymbopogon石油 |
24 |
525年 |
12900.0 |
8562.6 - -18093.0 |
1.87
±0.19 |
- - - - - -
2.67
|
15.92 |
16 |
|
48 |
525年 |
12359.0 |
8091.7 - -17389.0 |
1.92±0.19 |
- - - - - -
2.84
|
14.28 |
16 |
|
万寿菊石油 |
24 |
525年 |
9580.7 |
7024.2 - -11083.0 |
4.70
±1.01 |
- - - - - -
13.69
|
21.99 |
16 |
|
48 |
525年 |
9423.0 |
6886.9 - -10953.0 |
4.58±0.94 |
- - - - - -
13.21
|
20.57 |
16 |
| Tau-fluvalinate |
24 |
525年 |
875.20 |
581.73 - -1430.21 |
1.15±0.16 |
1.63
|
23.33 |
16 |
|
48 |
525年 |
666.21 |
415.76 - -1046.72 |
1.28±0.18 |
1.39
|
23.18 |
16 |
工蜂,茴香脑有剂量反应显著高于
Cymbopogon油(
X
2
=
28.46
df = 1,
p
<
0.001
),
万寿菊油(
X
2
=
24.89
df = 1,
p
<
0.001
)和tau-fluvalinate (
X
2
=
44.53
df = 1,
p
<
0.001
)。然而,没有发现差异之间的剂量反应的斜坡线
Cymbopogon和
万寿菊油(
X
2
=
0.01
df = 1,
p
=
0.91
)或之间
Cymbopogon石油和tau-fluvalinate (
X
2
=
0.86
df = 1,
p
=
0.354
;图
1 (b))。幼虫,茴香脑有剂量反应显著高于
Cymbopogon油(
X
2
=
32.84
df = 1,
p
<
0.001
)或tau-fluvalinate (
X
2
=
54.05
df = 1,
p
<
0.001
),但是没有发现显著差异之间的斜坡茴香脑和剂量反应行
万寿菊油(
X
2
=
1.56
df = 1,
p
<
0.211
;图
1 (c))。
3.3。相对选择性比率
茴香脑相对选择性比率计算,
Cymbopogon油,
万寿菊油和tau-fluvalinate分别为117.9,115.7,68.0,和2.2,分别在成年蜜蜂和47.6,27.2,7.6,和10.9,分别在蜜蜂的幼虫。
3.4。乙酰胆碱酯酶基因表达
的相对丰度
疼痛成绩单在48 hpt明显高于tau-fluvalinate治疗蜜蜂(
27.34
±
13.4
褶皱变化)比蜜蜂从其他治疗方法。表达水平没有明显差异的蜜蜂之间的这种基因控制,茴香脑,
Cymbopogon,
万寿菊油治疗在0 hpt或48 hpt,表明只有tau-fluvalinate与表达升高有关
疼痛(
F
5、12
=
4.27
,
p
<
0.01
;图
2)。
相关基因的表达
疼痛使用中存在
的蜜蜂工人在0和48 h后治疗5
μl tau-fluvalinate (110
μg / ml)、茴香脑(34200
μ克/毫升),
Cymbopogon石油(60000
μg / ml)
万寿菊石油(60000
μg / ml)。控制蜜蜂处理溶剂(乙醇)。不同的字母表示显著差异意味着基于方差分析和LSD费舍尔保护测试
(
n
=
45
)
执行与对数转换数据。
![]()
4所示。讨论
本研究进行了测试潜在的一些植物化合物的控制
蜂螨虫以及来确定它们的相对毒性蜜蜂工人和幼虫。茴香脑和
Cymbopogon石油对螨虫的影响,同时高选择性和安全蜜蜂的利润率。茴香脑的miticidal效果(之前已经被证明
24),但其相对毒性和选择性从来没有确定
诉析构函数和蜜蜂幼虫和成年人。在这项研究中,茴香脑的剂量反应和毒性
诉析构函数明显高于
万寿菊油(4.1倍)和类似的
Cymbopogon石油。其毒性工蜂也显著高于
万寿菊石油(2.4倍),但不是不同的
Cymbopogon石油。相反,茴香脑是有毒的比
万寿菊对蜜蜂幼虫和石油
Cymbopogon石油有中等毒性。相比之下,tau-fluvalinate是3.8倍的毒性
蜂螨虫比茴香脑,但也导致了17倍的有毒幼虫和至少207倍比茴香脑对成年蜜蜂有毒。此外,茴香脑的选择性比率最高的所有化合物的测试。从上面的结果,可以得出结论,茴香脑潜力最高varroacide化合物中测试和演示了大型安全边际的蜜蜂。因此可以在荨麻疹建议进行进一步的测试。
茴香脑目前用作调味品或芳香剂在食品工业和对人类健康没有安全问题
39]。然而,它可能影响蜂蜜的气味或味道应该考虑。茴香脑从八角茴香精油是孤立的,也产生了从硫酸盐松节油合成油。八角茴香精油的年产量隔离茴香脑(超过3000吨
40]。因此,它可以假定为经济提供一个新的市场应该由于varroacidal创建活动。
的毒性
Cymbopogon石油
诉析构函数和蜜蜂工人和幼虫是茴香脑的相似。然而,它比茴香脑相对选择性比例略低。尽管如此,它比的比率高得多
万寿菊石油和tau-fluvalinate,也使其成为潜在的有效和安全varroacidal候选人在蜂巢级别进行测试。进一步纯化
Cymbopogon石油和分离的活性成分可能会增强其varroacidal效果。在以前的研究中,
Cymbopogon石油被发现miticidal活动(
26),众所周知,柠檬醛,它的主要组件,可能杀死
蜂螨虫(
41]。然而,这是第一次研究证明其varroacidal活动和低毒性的成年蜜蜂幼虫。
万寿菊石油是大大减少有毒
蜂比tau-fluvalinate螨虫,其他两个植物化合物,在本研究中进行了测试。也是最有毒的成年蜜蜂的化合物,但相反,第二tau-fluvalinate,
万寿菊石油是最有毒化合物的幼虫。此外,它是选择性的植物化合物,当毒性测试结果幼虫被用于计算。因此,将等级低于茴香脑
Cymbopogon石油作为潜在varroacidal化合物。这很让人困惑的原因
万寿菊石油特别有毒的蜜蜂幼虫。然而,在其他昆虫的研究表明组织的
万寿菊植物含有(5 e) ocimenone和
α-terthienyl,显示有效的杀灭幼虫的影响对蚊子(
25]。的行动方式
α-terthienyl有关其幼虫抗氧化防御系统的干扰生物体暴露于这种植物杀虫剂(
42]。精油的毒性
t . minuta来
蜂螨虫和成年蜜蜂被Eguaras之前评估等。
29日波特塔下。他们估计一个信用证<年代ub>504.37毫克/笼
蜂螨虫和13.6毫克/笼工蜂。然而,由于不同的评估方法,是不可能直接比较他们与我们的结果,尽管研究显示成年蜜蜂的选择性的石油。
我们发现的高表达
疼痛蜜蜂在接受治疗后48 h与tau-fluvalinate但不是植物化合物(图
2)。基因表达的增加可以解释为一种自适应机制的蜜蜂抵消tau-fluvalinate的疼痛的抑制作用。类似的结果被巴迪欧等报道。
15)当他们暴露蜜蜂到另一个拟除虫菊酯,溴氰菊酯。我们的结果用于tau-fluvalinate公开同意的观点
疼痛很可能与应激反应有关。
疼痛当工蜂压力增加,例如,贫穷的条件下花粉可用性和抑制花粉时是可用的和小鸡饲养是诱导
43]。因此,它是可能的,只有蜜蜂tau-fluvalinate造成压力。低毒性的植物化合物,相对于tau-fluvalinate成年蜜蜂发现在这项研究可能也缺乏相关的变化
疼痛表达蜜蜂接触,因此只有蜜蜂接触tau-fluvalinate显示大量的高
疼痛记录。另外,没有反应
疼痛表达式的植物化合物,可能是由于缺乏这些化合物乙酰胆碱受体的特异性。众所周知,萜类化合物如麝香草酚绑定到章鱼胺或GABA受体(
44,
45),尽管其他的研究也发现,精油成分麝香草酚和芳樟醇等改变的表达
疼痛(
19,
20.,
27,
46]。另一个潜在的假设来解释缺乏植物化合物的影响
疼痛表达式是化合物可能是迅速代谢,因此没有任何明显影响的表达
疼痛在48 hpt。在任何情况下,进一步调查才能发现为什么这里的植物化合物,测试没有影响
疼痛在成年蜜蜂表达式。