胎盘样品在本研究收集病人的书面知情同意,符合《赫尔辛基宣言》。胎盘组织收集正常女性的怀孕在8 - 9^th孕周和术语(39孕周)。我们的道德委员会(CCPRB巴黎科钦没有。18-05)批准的法定和自愿终止妊娠的胎盘怀孕的前三个月以及正常的胎盘。

如前所述( 22),五个有效的对于妊娠前三个月的胎盘获得EVCT隔离。绒毛组织冲洗和切碎的Ca^{2 +}——、镁^{2 +}无汉克斯平衡盐溶液对膜去除。单核的vct孤立使用消化trypsin-DNase和分馏的不连续Percoll梯度根据协议Kliman et al。 23)和Alsat et al。 24]。总之,绒毛组织消化在汉克斯平衡盐溶液,含有5国际单位/毫升DNase我,4.2毫米MgSO₄,0.25% (wt /卷)胰蛋白酶粉(Difco), 100国际单位/毫升青霉素,25毫米的玫瑰,100 μg / mL链霉素(生化行业),倒置显微镜下和监控。最初的消化解决方案(包括主要是红细胞)丢弃,而随后的消化方案(显然包括EVCTs)留存。不连续Percoll梯度(步骤5 - 70% 5%)用于分层消化解决方案;中间的层(包括EVCTs)保留了进一步分析。稀释了纯化EVCTs杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)、谷氨酰胺和2毫米,100国际单位/毫升青霉素、链霉素100毫克/毫升、decomplemented 10%胎牛血清(FCS),最后一个密度 0.9 × 10 6 细胞/毫升60毫米直径塑料组织培养菜(电子塑料制品、瑞士)。在准备培养、文化板块(电子塑料制品、瑞士)被涂上一层基底膜基质™(7 μ克/厘米²;协同生物医学产品,Le Pont de Claix、法国),然后用EVCTs播种密度 5 × 10 4 细胞/厘米²。保持持续的培养条件,DMEM-F12 heat-inactivated使用介质中含有10%胎牛血清(FCS) Glutamax, 100年 μg / mL链霉素和100国际单位/毫升青霉素(表达载体)。盘子被孵化2 h在37°C和5%的公司₂;然后,不依从EVCTs被冲洗掉。在这一点上,新媒介有或没有1 μM罗格列酮(开曼)溶解在乙醇1毫米(治疗)或0.1%乙醇(车辆)添加另一个24小时的潜伏期。

vct是从五项胎盘孤立使用下面的程序。胎盘和母性的一面面向朝前,和组织采样深度1.5厘米,从边缘到中心的距离的一半。绒毛组织被冲洗,剁碎、消化和纯化使用上述步骤。培养皿中包含 0.9 × 10 6 细胞/ mL被置于湿润孵化器在37°C下5%的股份有限公司₂3 h。不依从vct漂洗干净,新鲜培养基有或没有1 μM罗格列酮(开曼)溶解在乙醇1毫米(治疗)或0.1%乙醇(车辆)补充道,和菜孵化24小时。

孵化24小时后,RT-EVCTs和控制EVCTs收获了微阵列实验。细胞RNA提取使用试剂盒®试剂(表达载体)和纯化使用RNeasy®迷你包(试剂盒)。RNA的完整性和纯度检查2100与RNA生物分析仪6000 LabChip工具包(安捷伦科技)。U133A 2.0 GeneChip (Affymetrix公司)是用于基因表达检测根据制造商的手册。从22000年在基因芯片探针集,14500个基因被检测到。

RT-VCTs和控制vct同样收获后的孵化24小时微阵列实验;RNA提取、净化和质量控制进行了描述。SHDZ基因芯片(斯坦福大学)是用于基因检测中描述( 25]:对于每一个样本,MessageAmp RNA工具包(Ambion), 1 μg总RNA, RNA扩增,和3 μg放大RNA被贴上Cy-dye使用26 CyScribe第一链cDNA标签工具包(Amersham生物科学)。放大RNA从rosiglitazone-treated vct与Cy5标记,并从控制vct贴上Cy3放大RNA。一个Microcon YM 30列(微孔)是用来净化和标记混合物集中(Cy5和Cy3)与人类cot-1额外的修改后,酵母tRNA,保利的探针是变性和混合杂化在65°C在一个密封的湿润杂交,然后冲洗1 xssc 2 xssc, 0.03% SDS, 0.2% SDS解决方案2分钟。数组进行扫描GenePrix 4000芯片扫描仪(轴突仪器)。

由于基因表达在EVCTs和vct使用不同的微阵列检测平台,不同的数据处理程序。EVCT基因表达,是量化使用GeneChip (U133A 2.0, Affymetrix)应用程序中,数据处理使用以下阈值过滤:(i)缺失数据的比例不超过50%,(ii)阈值来识别和表达下调的基因统计比较将褶皱变化为1.5,(iii)最大的错误发现率(罗斯福)设置为5%,及(iv)折叠一个基因的变化等于的意思是对照组的治疗组-意思是然后除以最小值( 褶皱 改变 = 的意思是 治疗 - - - - - - 的意思是 控制 / 最低 治疗 , 控制 )[ 22]。VCT基因表达,测定使用SHDZ GeneChip /斯坦福大学(GPL21609)应用程序中,数据处理使用以下阈值过滤:(i) background-corrected数据log2-transformed并受黄土归一化法( 11),(2)差异表达基因(度)决定通过微阵列(SAM)的意义分析方法( 26)和(iii)的最大错误发现率(罗斯福)设置为1%,如果没有褶皱变化阈值对( 27]。

ClueGO Cytoscape插件应用程序的功能分类基因( 28]。我们分析使用Cytoscape版本3.7.1 (Cytoscape财团,纽约,纽约)和ClueGO 2.5.4版本(2019年2月28日)公布,同时更新的基因本体论(去)。使用ClueGO,我们恢复GO术语与数据集的度以及相关的——或者下调度;这个应用程序也用于KEGG和Reactome途径分析。去EVCTs之间的比较和vct使用R包clusterProfiler(3.9版本,同步到最新条款和通路)( 29日]。clusterProfiler术语比较,每组10类别条件选择列入图表。相反,ClueGO分析是基于大约30项每组以生成更详细的可视化。 P 值低于0.05确定重要的浓缩。

字符串数据库( https://string-db.org)是用于分析DEG-encoded蛋白质的相互作用和构造一个PPI网络。为此,明显信心得分被设置为大于0.4。Cytoscape用于可视化并组织PPI网络。蛋白质相互作用PPAR γ或RXR α显示不同的颜色,形状被用来代表不同的团体。转录因子结合位点之间的相互作用和目标基因预测的Cytoscape插件iRegulon(基于TRANSFAC数据库;版本1.3)。假定的监管区域被定义为10 kb在转录起始位点。罗斯福被设定0.1%来验证交互。生成的图表在Cytoscape修改用红色表明调节基因和蓝色表示基因表达下调。

微数组技术被用来描述基因表达在EVCTs和vct有或没有罗格列酮治疗。我们的微阵列基因表达数据被存入综合公共存储库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;EVCT微阵列数据加入GSE28426数量,VCT微阵列数据加入GSE137434)。基因表达谱的rosiglitazone-treated (TRT)样本EVCTs和vct规范化(图 2(一个))。四个五个独立RT-EVCT样本取得了一致的结果,用一个样本出现略有不同;相反,所有五个独立RT-VCT样本产生了类似的结果。接下来,度检测基于阈值对褶皱的变化表达水平和罗斯福。在RT-EVCTs,共有139个基因被确定为度( P < 0.05 ),其中114基因调节(红色)和25个基因表达下调(蓝色)。在RT-VCTs,共有197个基因被确定为度( P < 0.05 ),其中181基因调节(红色)和16个基因表达下调(蓝色)(图 2 (b))。

度的整套RT-EVCTs RT-VCTs是分开独立起源的细胞类型和提交ClueGO使用默认参数。去建立通路富集分析。度分类的三种方式:通过生物过程,分子功能,细胞成分。丰富通路被确定通过Reactome和KEGG数据库的搜索。结果显示在图 3。

RT-EVCTs度识别中,主要生物过程代表的是“负调节上皮细胞凋亡过程,”“长链fatty-acyl-CoA生物合成过程,”和“磷脂酰胆碱生物合成的过程。“对于同一组度,分子功能主要是归类为“alpha-tubulin绑定,”“宽孔隙通道活动,”“诱使生热作用的积极监管,”“谷胱甘肽转移酶的活动,”“长链脂肪酸绑定,”“调节细胞粘附由整合素,”和“积极的监管non-motile纤毛组装。“最后,蜂窝组件,这些度与大多数是“细胞桥粒。“在RT-EVCTs的通路富集分析,度主要是与“HIF-1信号通路,”“p53信号通路,”“谷胱甘肽代谢,”“NRAGE信号通过物死亡,”“PPAR信号通路,”“血浆脂蛋白大会,”和“改造和间隙”。

在分析方面与RT-VCT相关数据集,度主要是参与以下生物过程:“受体生物合成过程的监管,”“负调节核苷酸代谢过程,”“环核苷酸生物合成的过程,”和“负调节B细胞凋亡过程。”同样的分子功能群度主要是与“负调控DNA复制,”“调节蛋白脱乙酰作用,”“ubiquitin-like蛋白质接合酶活动,”“一半蛋白结合,”“负调控细胞内蛋白质的运输,”和“积极的调节磷蛋白质。“对去细胞组件,度主要是相关的术语“卑微的人复杂,”“细胞代谢化合物打捞,”和“免疫突触。”最后,RT-VCTs的通路富集分析表明度主要是参与“紧密连接,”“监管的低氧诱导因子的氧气,”“展开的蛋白质反应,”“HIF-1信号通路,”“核受体转录途径”和“血浆脂蛋白改造”。

度,调节RT-EVCTs和RT-VCTs是分开提交ClueGO遵循同样的步骤如上所述。结果显示在图 4。RT-EVCTs,调节度与去生物过程相关的主要是“脂肪酸衍生生物合成的过程”和“负调节上皮细胞凋亡过程,“和的分子功能“积极调节胰岛素分泌,”“温度体内平衡,”“宽孔隙通道活动,”“核受体活动”和“调节血浆脂蛋白颗粒的水平。“主要细胞成分参与这些度的活动是“细胞桥粒”和“线粒体膜的内在组成部分。”最后,通路富集分析表明RT-EVCTs主要是参与调节度”p53信号通路,”“HIF-1信号通路,”“肽激素代谢,”“PPAR信号通路,”“p57正常受体介导信号、关系”和“维甲酸信号”。

相反,在RT-VCTs的度调节,没有明显的生物过程被确认。在去分子功能的分类,这些度主要是与“积极调节细胞周期”和“有丝分裂DNA损伤检查点,”和最重要的细胞组件”转录因子复杂。“通路富集分析,调节度RT-VCTs主要是与“mTOR信号通路,”“细胞周期检查点,”“DNA修复,”“发育生物学,”“新陈代谢,”和“vesicle-mediated运输”。

度中表达下调RT-EVCTs和RT-VCTs控制提交ClueGO使用相同的程序如上所述。结果显示在图 5。RT-EVCTs,表达下调度主要是与生物过程相关的“积极调控小分子代谢过程;”的分子功能“膜融合,”“调节上皮细胞的迁移,”“对雌三醇的反应,”和“蛋白激酶绑定;”和“磷酸化酶激酶复杂细胞组件。“通路富集分析的基于Reactome和KEGG数据库,表达下调度在RT-EVCTs似乎主要与通路与“糖原分解,”“流感感染,”“蛋白质在内质网处理,”和“调节肌动蛋白细胞骨架”。

相反,度中表达下调RT-VCTs主要是参与的生物学过程“环核苷酸生物合成的过程,”“负调节核苷酸代谢过程,”“ncRNA 3 '端处理,”和“O-glycan加工;“分子功能”核受体的活动,”“组蛋白脱乙酰作用,”“监管TOR信号,”“一半蛋白结合,”“离子通道调节活动,”“核被膜组织,”和“peptidyl-threonine修改;“和蜂窝组件”organellar核糖体。“在RT-VCTs的通路富集分析,表达下调度主要是与“HIF-1信号通路,”“转移的泛素E1 E3,”“信息交流,”“RUNX3转录调控,”和“形成NR-MED1共激活剂复杂”。

接下来,我们想确定细胞过程的程度受到罗格列酮治疗EVCTs或vct需要具体问题具体分析,而这出现在两种组织类型。要做到这一点,我们的特点,和表达下调RT-EVCTs度和RT-VCTs单独使用clusterProfiler,使用信息和KEGG数据库,以及疾病本体(做)和疾病基因网络(DisGeNET)数据库。术语出现在至少三列在这两个被认为重要,而术语出现只有RT-EVCT或RT-VCT数据集被贴上的修复;意义是由 P 值小于0.05。

RT-EVCTs和RT-VCTs,去生物过程“调节内皮细胞迁移,”“非规范Wnt信号通路,”“受体代谢过程,”“负调控的蛋白质磷酸化,”和“新陈代谢过程”似乎扮演了一个重要的角色。相反,流程具体RT-EVCTs包括“糖原分解过程,”“细胞碳水化合物分解过程,”“胚胎植入,”“脂肪酸衍生生物合成的过程,”和“长链fatty-acyl-CoA生物合成的过程中,“而这些特定于RT-VCTs“细胞质mRNA加工组装,”“核糖核蛋白复杂的生物起源,”“积极的磷蛋白质磷酸酶活动的监管,”和“负调节核苷酸代谢过程”(图 6(一))。

的分子功能“核激素受体结合,”“长链脂肪酸绑定,”“脂肪酸绑定,”“核活动”和“转录因子活动”在RT-EVCTs和RT-VCTs似乎是重要的。功能具体包括RT-EVCTs“类固醇激素受体结合,”“类二十烷酸受体的活动,”“磷酸磷脂酰肌醇激酶活动”和“脂肪酸连接酶的活动,”,而这些特定于RT-VCTs“Wnt-activated受体的活动,”“细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶活动”“转移酶的活动,”和“ubiquitin-specific蛋白酶活动”(图 6 (b))。

两个组织类型共享的重要细胞组件”光滑型内质网”,“皱褶”,“转录因子复杂,”“顶端质膜”,“腔”和“信息连接。“相反,组件“β-连环蛋白破坏复杂,”“M乐队,”“积分腔内内质网的膜的组成部分,”和“乐队”只在RT-EVCTs发现,“spliceosomal复杂,”“Wnt signalosome”“原核,”“微管,”和“自噬体膜”似乎是针对RT-VCTs(图 6 (c))。

通过搜索KEGG数据库,以下途径似乎是重要的在这两种组织类型:“蛋白质在内质网处理,”“胰高糖素信号通路”,“巴尔病毒感染,”“PPAR信号通路”,“HIF-1信号通路”,“progesterone-mediated的卵母细胞成熟,”和“mTOR信号通路。特有的“通路RT-EVCTs包括“原发性免疫缺陷”和“脂肪酸代谢,“虽然这些特定于RT-VCTs与“细菌入侵上皮细胞”和“甲状旁腺激素合成、分泌,行动”(图 6 (d))。

从疾病本体数据库,术语“子痫前期,”“临床上妊娠综合症,”“脊髓小脑的共济失调”,“家族性高脂血症”,“脂质代谢紊乱,”和“肌肉骨骼系统癌症”EVCTs和vct很重要。特定条款RT-EVCTs包括“乳房良性肿瘤,”“胸良性肿瘤,”“脂肪瘤的癌症,”“淀粉样变,”和“静脉疾病”而特定于RT-VCTs是“肺泡横纹肌肉瘤,”“骨硬化病”,“骨巨细胞瘤,”和“生殖细胞和胚胎性癌”(图 6 (e))。

从DisGeNET数据库的搜索,术语“子痫前期,”“肥厚性心肌病,”“免疫缺陷综合症”,“糖尿病”,“血管炎症,”“造血肿瘤”,“非酒精脂肪肝疾病,”“血管疾病,”“缺血性心肌病,”和“三倍性综合症”是重要的组织类型。相反,“慢性中性粒细胞白血病”,“糖原存储疾病”和“骨髓、慢性、非典型和bcr - abl负白血病”RT-EVCTs需要具体问题具体分析,“alport综合征”和“激进的非霍奇金淋巴瘤”是特定于RT-VCTs(图 6 (f))。

因为我们观察到的基因表达的变化是由于PPAR的激活 γ罗格列酮,我们下一个试图预测(i) PPAR的蛋白质-蛋白质之间的关系(PPI) γDEG-encoded蛋白质和(2)转录基因因素指标(TF-TG) PPAR的相互作用 γ度推动者。在RT-EVCTs(图 7(一)),下面的蛋白质似乎与PPAR直接交互 γ复杂:MGLL、FABP5 HMOX1、SERPINE1 ABCG2, PHC1, VLDLR, INSIG1, DPP4, ANGPTL4, FAPB4 ACSL1, CPT1A。相反,ACSL5 PFKP AKR1B1,液态氧,GXTA4, SOWAHC, GJA1, SLC19A1, RUNX1、补,ENPEP, SLFN12, CDC42EP, LIPG参与二次交互。在RT-VCTs(图 7PPAR (b)) γ复杂的相互作用,直接与MYOD1 MAPK8、HDAC2 GAPDH,飞机观测,ANGPTL4, PDCD4和其次PDIA3, MAPK8IP2, NR4A1 GNG2, CCR1。我们在RT-EVCTs TF-TG交互(图的分析 7(c))预测,PPAR的目标基因 γ复杂的调节度DLC1、SEMA3C ARL6IP5, PCTP, ISL1, ZNF395, SR1, DPP4, ALOX5AP, ANGPL4, CDC42EP4, GKN1, ATXN1, CAPN2, LPCAT3, SERPINE1, NET1, LPCAT3, CPT1A, RAB30, GADD45A, MMP19, FHL1,多党民主运动,CCNE1, ESRRG,以及表达下调度ADAM12, GSTA4 PSG5, DACT1。相同的RT-VCTs分析(图 7(d))预测,PPAR的目标基因 γ复杂的调节度CLIP1、GAPDH和垂直距离,以及表达下调度CELF2, ZNF512B, SLC39A10, WDR7, FURIN, RRBP1, ATXN1, MRPL4, INNPP4B, ZMYND8, BCL6, ASAP1, UBE2K, RORC, RGL2, ADCY3, FUT8, ANKRD11 SPTAN1, BAZ2B。

我们下一个过滤数据集来检查只有度目标由PPAR直接 γ复杂,基于上述TF-TG预测。过滤RT-EVCT数据库包含26日调节和4表达下调度(图 8(一)),而过滤RT-VCT数据库包含3调节和21度使之抑制(图 8(b))。ATXN1,只有一个目标基因是目前在这两个数据集;这是RT-EVCTs调节和表达下调RT-VCTs(图 8)。