2。材料和方法
2.1。叶提取物的制备
的叶子
c . asiatica收集从森林研究所的托儿所(星期五),乌吉(94517年加入数量)。提取制备根据我们的早期作品中描述的协议
9]。
2.2。分析<斜体> c asiatica < /斜体>提取通过gc - ms
GC - ms分析使用跟踪执行GC ultragas色谱仪连接到一个量子XLS质谱仪(美国佛罗里达州热科学)。GC是配备TG-5MS毛细管柱(30 m×0.25×0.25毫米身份证
μ膜厚度)组成的固定相5%苯和95%甲基聚硅氧烷。少注射在CT进行分割模式的喷油器温度260°C。氦气作为载气流速为1.1毫升/分钟。烤箱温度编程如下:最初的烤箱温度举行70°C 2.0分钟,然后增加到210°C的速度20°C / min,然后增加到290°C举行10°C /分钟的速度为13.0分钟。离子源和传输线温度为220°C和290°C,分别。鉴定的化合物是由比较他们与NIST质谱库中可用的工具。
2.3。<斜体>果蝇< /斜体>股票
转基因果蝇的人类-核蛋白表达野生型(h -
α无人机控制神经元”(w (
*
];P {w (+ mC) = UAS-Hsap / SNCA。F}“5 b和GAL4”w (
*
];P {w [+ mC] = GAL4-elavL}”从布卢明顿3了
果蝇股票中心(印第安纳大学布卢明顿,)。当无人机的男性——(上游激活序列)Hsap / SNCA。F株交叉GAL4-elav的女性。L(亦然),后代将表达人类
α年代的神经元(
5]。
2.4。<斜体>果蝇< /斜体>文化和十字架
苍蝇是培养标准
果蝇食品含有琼脂、玉米粉、糖和酵母25°C (
24
±
1
)[
10]。穿过被设置为我们的早期作品中描述
11]。首先,攀登试验进行PD苍蝇和UAS-Hsap / SNCA。F(控制)。另一组苍蝇PD是允许分别以不同剂量
c . asiatica提取混合饮食中。
c . asiatica提取了饮食的最终浓度为0.25,0.50和1.0
μL /毫升。PD苍蝇也暴露在10−3L-dopamine M。UAS-Hsap / SNC。F作为控制。控制苍蝇分别允许剂量的选择上觅食
c . asiatica提取。
2.5。<斜体>果蝇< /斜体>爬化验
登山测定了所描述的彭德尔顿et al。
12]。十个苍蝇被放置在一个空的玻璃小瓶(10.5厘米×2.5厘米)。一条水平线是8厘米以上瓶的底部。苍蝇已经适应了10分钟后在室温下,控制和治疗组随机化验,共有10道。计算平均值,然后平均,得到一组平均值和标准错误。所有行为研究进行了25°C标准闪电的条件下。
2.6。<斜体>果蝇< /斜体>活动模式
从第12天苍蝇的活动(雄性)分析了所有治疗组的血压
果蝇活动监视器(美国TriTek)。活动记录每小时384 h和数据分析了动态图表J软件。结果表现为卡方检验周期图(
13]。
2.7。脂质过氧化作用分析
脂质过氧化反应测定大脑匀浆进行根据Siddique描述的过程等。
10,
11]。试剂1 (R1)是由溶解1-methyl-2-phenylindole 0.064 g为30毫升的乙腈10毫升的甲醇添加卷到40毫升。37%盐酸作为试剂的制备R2。stereozoom显微镜下苍蝇的大脑被孤立在冰冷的三羟甲基氨基甲烷HCl液(20毫米)(10大脑/组;五个复制/组)。匀浆制备三羟甲基氨基甲烷HCl液和离心机3000 g 20分钟,随后上层清液收集。1300年在一个微型离心机管
μL (R1。一个卷1
μL的上层清液添加了300
μL R2涡和孵化45°C 40分钟。孵化后,管冷却在冰和离心机在4°C 15000 g 10分钟。所有样品都在586海里。
2.8。蛋白质羰基含量估计
蛋白质羰基含量估计根据协议所描述的霍金斯et al。
14]。脑匀浆稀释的蛋白质含量约1毫克/毫升。约250
μ每个稀释的L匀浆分别摄于埃普多夫离心管。它250年
μL(10毫米2,4-dinitrophenyl肼(盐酸溶解在2.5)补充说,漩涡,在黑暗的20分钟。约125
μL 50% (w / v)三氯乙酸(TCA)补充说,混合充分,孵化−20°C,持续15分钟。在4°C管被离心10分钟9000 rpm。上层清液都被丢弃而获得的颗粒被冰冷的乙醇洗两次:乙酸乙酯(1:1)。最后球再溶解在1毫升的6 M盐酸胍和吸光度是阅读370海里。
2.9。估计谷胱甘肽(GSH)含量
的谷胱甘肽(GSH)含量估计colorimetrically使用Ellman试剂(DTNB)根据描述的过程
15]。浮在表面的沉淀与4%磺基水杨酸的比率(4%)1:1。样本保存在4°C 1小时,然后进行离心10分钟的5000 rpm在4°C。550年的试验混合物由
μ100年0.1磷酸盐缓冲剂,L
μ上层清液L, 100
μDTNB L。OD阅读412海里,结果表示为
μ摩尔的谷胱甘肽/克组织。
2.10。估计Glutathione-S-Transferase(销售税)活动
glutathione-S-transferase活动由Habig等的方法。
16]。反应混合物由500
μ150年0.1磷酸盐缓冲剂,L
μL(10毫米CDNB, 200年
μL(10毫米减少谷胱甘肽,50
μ上层清液的L。OD在340海里,酶活性表达为
μ摩尔的CDNB轭合物/分钟/毫克的蛋白质。
2.11。统计分析
统计分析是通过使用Statistica软Inc .各种飞行组在统计学上的平均值相比,使用一个未配对的学生群体
t
以及。
3所示。结果
的化合物存在于丙酮提取的叶子
c . asiatica运用gc - ms法分析鉴定(图
1)。气相色谱显示8主要化合物浓度最高的存在。他们的保留时间(RT)、分子式、分子量(MW)的叶子
c . asiatica展示在表
1。gc - ms分析表明,丙酮提取主要组成的
β-elemene、苯、1,1′-oxybis, bicyclotrimethyl-8-methylene,
α蛇麻烯,
α-cadinol 2-hexadecen-1-ol 3、7、11日15-tetramethyl, neophytadiene。数据
2(一个)- - - - - -
2 (g)质谱的分裂模式和结构的化合物从叶中提取提取并通过NIST图书馆的gc - ms证实。这些峰值匹配相似性指数(SI)大于70% NIST图书馆。一些主要的山峰在植物提取物列出血或杂质。首先攀登试验进行控制和PD的苍蝇。的爬响应控制苍蝇没有改变评估的24天,但从12天,PD苍蝇的反应明显降低与控制(图
3;
P
<
0.05
)。因此治疗期间被选为24天,爬测定24天后执行不同剂量的接触
c . asiatica提取。PD苍蝇的0.25,0.50,和1.0
μL /毫升
c . asiatica提取显示存在剂量依赖的相关性显著延迟的损失上升(图的能力
4;
P
<
0.05
)。选中的剂量的
c . asiatica没有任何影响的攀爬能力控制苍蝇(图
4)。研究收集的数据模式的活动
果蝇活动监视器(坝)是由卡方分析周期图。为控制苍蝇的数量显著峰值(数据
5(一个)和
5 (b))与PD苍蝇(数字
6(一)和
6 (b))。延迟的活动模式存在剂量依赖的相关性在PD苍蝇暴露在0.25,0.50,1
μL /毫升
c . asiatica叶提取物(数据
7(一),
7 (b),
8(一个),
8 (b),
9(一个),
9 (b))。没有变化的活动模式控制苍蝇暴露在0.25,0.50,1
μL /毫升
c . asiatica提取观察(数字
10 (),
10 (b),
(11日),
11 (b),
12(一个),
12 (b))。PD果蝇接触到10−3M的多巴胺还显示推迟活动(数据的损失
(13日)和
13 (b))。脂质过氧化作用的结果(图所示
14)。存在剂量依赖的相关性显著减少脂质过氧化反应的平均吸光度值估计在PD苍蝇暴露在0.25,0.50和1.0
μL /毫升
c . asiatica提取比未经处理的PD苍蝇(图
14;
P
<
0.05
)。的曝光剂量的选择
c . asiatica提取没有任何增加的平均吸光度值估计脂质过氧化(图
14)。蛋白质羰基含量的结果PD苍蝇的大脑(图所示
15)。存在剂量依赖的相关性下降的平均吸光度值估计蛋白质羰基含量在果蝇接触到0.25,0.50和1.0
μL /毫升
c . asiatica提取比未经处理的PD苍蝇(图
15;
P
<
0.05
)。没有观察到蛋白质羰基含量增加控制苍蝇暴露剂量的选择
c . asiatica提取(图
15)。
叶提取物的活动原则
积雪草的与他们的保留时间(RT)、分子式、分子量。
| 数量 |
RT |
化合物的名称 |
分子式 |
兆瓦 |
| 1 |
7.55 |
β
-Elemene |
C15H24 |
204.35 |
| 2 |
7.64 |
苯、1,1′-oxybis |
C14H14O |
198.26 |
| 3 |
7.80 |
11 Bicyclo 7.2.0 undec-4-ene, 4日,11-trimethyl-8-methylene, [1 r - (1
R
x
4 z, 9
年代
x
)] |
C15H24 |
204.35 |
| 4 |
8.01 |
α蛇麻烯 |
C15H24 |
204.35 |
| 5 |
8.19 |
α-Cadinol |
C15H26O |
222.37 |
| 6 |
10.20 |
15-tetramethyl 2-Hexadecen-1-ol 3、7、11日- (R - (
R
x
,
R
x
——(E)]] |
C20.H40O |
296.531 |
| 8 |
10.36 |
Neophytadiene |
C20.H38 |
278.515 |
叶的GC色谱提取(丙酮)
积雪草的。
![]()
(一)——(g)质谱的丙酮提取,其产品具有高浓度与NIST图书馆。
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
攀爬能力在帕金森病(PD)苍蝇和控制一段24天。五化验值的均值(
一个
重要的控制
P
-0.01)。控制苍蝇:UAS-alpha-syn;PD苍蝇:elav-GAL4;UAS-alpha-syn。
![]()
的影响
积雪草的提取(CAE)攀爬能力。苍蝇被允许在饮食补充喂养
积雪草的提取(CAE) 24天,然后化验攀爬的能力。五化验值的均值。(
一个
重要的控制,
P
-0.01;
b
重要的苍蝇对PD模型,
P
-0.05)。左旋多巴= 10−3M;控制苍蝇:UAS-alpha-syn;PD苍蝇:elav-GAL4;UAS-alpha-syn。
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别控制苍蝇(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为PD苍蝇(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为PD果蝇接触到10−3摩尔在饮食多巴胺(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为PD苍蝇暴露于0.25
μL /毫升
积雪草的叶提取饮食(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为PD苍蝇暴露于0.50
μL /毫升
积雪草的叶提取饮食(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为PD苍蝇暴露于1.0
μL /毫升
积雪草的叶提取饮食(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为控制苍蝇暴露于0.25
μL /毫升
积雪草的叶提取饮食(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为控制苍蝇暴露于0.50
μL /毫升
积雪草的叶提取饮食(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
(a)和(b)显示的平均活动模式和卡方检验周期图,分别为控制苍蝇暴露于1.0
μL /毫升
积雪草的叶提取饮食(
N
=
20.
)。
![]()
![]()
的影响
积雪草的提取(CAE)脂质过氧化作用以转基因的大脑
黑腹果蝇后各治疗组(24天的接触
一个
重要的控制,
P
-0.01;
b
重要的苍蝇对PD模型,
P
-0.05)。左旋多巴= 10−3M;控制苍蝇:UAS-alpha-syn;PD苍蝇:elav-GAL4;UAS-alpha-syn。
![]()
的影响
积雪草的提取(CAE)蛋白质羰基含量以转基因的大脑
黑腹果蝇经过24天的暴露在各种治疗组(
一个
重要的控制,
P
-0.01;
b
重要的苍蝇对PD模型,
P
-0.05)。左旋多巴= 10−3M;控制苍蝇:UAS-alpha-syn;PD苍蝇:elav-GAL4;UAS-alpha-syn。
![]()
获得的结果为总谷胱甘肽(GSH)含量(图所示
16)。谷胱甘肽含量的增加存在剂量依赖的相关性在PD苍蝇暴露在0.25,0.50,1
μL /毫升
c . asiatica提取(图
16)。控制果蝇接触到0.25,0.50,1
μL /毫升
c . asiatica提取物也表现出剂量依赖性增加谷胱甘肽含量比未经处理的控制苍蝇(图
16)。估计的结果glutathione-S-transferase (GST)活动(图所示
17)。显著增加销售税的活动在PD苍蝇(图
17)。PD苍蝇的0.25,0.50,1
μL /毫升
c . asiatica提取显示剂量依赖性降低消费税活动(图
17)。没有销售税增加活动在控制苍蝇暴露在0.25,0.50,1
μL /毫升
c . asiatica提取(图
17)。
的影响
积雪草的提取(CAE)谷胱甘肽(GSH)含量以转基因的大脑
黑腹果蝇经过24天的暴露在各种治疗组(
一个
重要的控制,
P
-0.01;
b
重要的苍蝇对PD模型,
P
-0.05)。左旋多巴= 10−3M;控制苍蝇:UAS-alpha-syn;PD苍蝇:elav-GAL4;UAS-alpha-syn。
![]()
的影响
积雪草的提取(CAE) glutathione-S-transferase(销售税)内容以转基因的大脑
黑腹果蝇经过24天的暴露在各种治疗组(
一个
重要的控制,
P
-0.01;
b
重要的苍蝇对PD模型,
P
-0.05)。左旋多巴= 10−3M;控制苍蝇:UAS-alpha-syn;PD苍蝇:elav-GAL4;UAS-alpha-syn。
![]()
4所示。讨论
本研究的结果表明,叶中提取的
c . asiatica是有效的减少PD症状表达转基因果蝇。
c . asiatica提取在100、200和300毫克/公斤显示存在剂量依赖的相关性对氧化应激的保护作用
17]。Asiaticoside,萜类化合物皂素
c . asiatica发现保护多巴胺能神经元,得罪1-methyl-4-phenyl 1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物)。MDA含量显著降低,治疗后的谷胱甘肽水平显著增加asiaticoside [
4]。在一项研究中,
c . asiatica粉被发现降低低密度脂蛋白的水平相比,控制大鼠(
2]。积雪草酸也被报道是预防鱼藤酮或H2O2SH-SY5Y诱导细胞损伤和已经提出开发代理PD治疗(
7]。
丰富的突触前终端相关联
α-核蛋白聚集负责突触病理学和神经退化
18]。破坏神经元(PD患者)已报告生成过氧化氢和自由基(
19]。在我们目前的研究转基因模型
果蝇表达人类
α-核蛋白,显著减少脂质过氧化反应和蛋白质羰基含量观察果蝇不同剂量的接触
c . asiatica。获得的结果在我们的研究结果支持了Haleagrahara和Ponnusamy
8)的补充
c . asiatica提取了脂质过氧化反应和蛋白质羰基含量大鼠的纹状体和海马。治疗干预,能有效地减速的速度退化在黑质致密部可以添加多年的流动性和降低发病率与PD (
19]。因此,人们一直注意识别α-核蛋白聚合或自由基抑制剂的拾荒者(
20.]。
c . asiatica提取报道减少脂质过氧化反应和蛋白质羰基含量老龄大鼠的大脑(
21]。分离出的化合物之一
c . asiatica,madecassoside,有效恢复MPTP-induced PD症状的神经保护效应包括换向抗氧化活性的损耗,增加的比率bcl - 2 /伯灵顿,和BDNF蛋白表达的增加
22]。我们以前的研究
桉树citriodora和
Salvadora persica叶提取物显示出PD模型中的保护作用果蝇表达人类
α-核蛋白(
23,
24]。天然抗氧化剂如芹黄素(
25),姜黄素(
11),抗坏血酸(
26),姜辣素(
27),和葡萄中提取
28)的延迟的损失攀爬能力和减少氧化应激在PD模型苍蝇的大脑。在我们的gc - ms分析
β-elemene报道为某些肿瘤细胞有抗增殖作用(
29日]。蛇麻烯报道产生抗炎效果,还对肿瘤坏死因子-抑制的影响
α- / (TNF -
α)和interleukin-1
β(IL1B) [
30.]。
α-Cadinol是一种抗真菌(
31日和王亚南
32]。C14H14O是花生酸,饱和脂肪酸(
33],C20.H40O2植烷酸,支链脂肪酸,其代谢产物已报告绑定或激活转录因子(
34]。
实验模型上的各种研究表明,氧化应激在神经退行性疾病中起着重要作用[
35]。因此,脂质过氧化作用和蛋白质羰基(PC)含量测定的大脑
果蝇氧化应激的标记。法律流程外包代表一个可靠的自由基生成和标记表明膜损伤(
36]。氧化应激导致的损伤脂质、蛋白质和DNA (
37]。在我们目前的研究中,重大的变化活动的销售税和谷胱甘肽和MDA的内容证实了氧化应激在PD苍蝇由于-核蛋白聚集或路易小体的形成。MDA含量表明活性氧的生成和显著增加消费税活动中观察到PD苍蝇,响应减轻自由基可能产生的不利影响疾病的发展。谷胱甘肽的耗竭内容在PD苍蝇。谷胱甘肽含量的减少由于氧化应激产生的α-核蛋白的聚合。控制苍蝇的治疗
c . asiatica提取谷胱甘肽含量的增加。不同剂量的PD苍蝇的接触
c . asiatica提取导致谷胱甘肽含量的增加和减少销售税和MDA含量。在我们目前的研究结果的基础上防止帕金森病症状的可能机制
c . asiatica提取(图所示
18)。这些研究结果与发现并发的其他工人
c . asiatica提取已报道降低MDA水平;增加SOD,谷胱甘肽水平在不同实验模型(
38]。类黄酮的膳食补充显示改善认知功能可能通过保护脆弱的神经元,增强现有神经元函数或通过刺激神经再生(
39]。复杂的大脑
果蝇学习和记忆的能力。几乎所有主要的类的离子通道受体和神经递质类似于人类由专门的细胞类型中发现
果蝇大脑(
40]。
可能的保护机制
积雪草的叶提取物在帕金森病模型转基因果蝇。
![]()