OMCL 氧化医学和细胞寿命 1942 - 0994 1942 - 0900 Hindawi 10.1155 / 2021/5577634 5577634 研究文章 内皮细胞来源所以2控制内皮细胞炎症、平滑肌细胞增殖、胶原合成抑制缺氧性肺血管重塑 刘 鑫 1 张 Shangyue 1 王 14 1 王 渊源 1 首歌 靖远县 1 太阳 荸荠 1 陈 国珍 2 杨 国盛 3 道 Yinghong 3 胡 Yongyan 3 部 定芳 4 https://orcid.org/0000 - 0001 - 8346 - 3809 黄 Yaqian 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9036 - 4980 杜 君宝 1 5 https://orcid.org/0000 - 0002 - 1606 - 8988 金 Hongfang 1 Berenyiova 安德里亚 1 儿科 北京大学第一医院 北京100034年 中国 pkufh.com 2 儿科 青岛大学的附属烟台Yuhuangding医院 烟台264000 中国 qdu.edu.cn 3 实验动物设施 北京大学第一医院 北京100034年 中国 pkufh.com 4 中心实验室 北京大学第一医院 北京100034年 中国 pkufh.com 5 重点实验室的分子心脏病学 教育部 北京100091年 中国 meb.gov.tr 2021年 17 4 2021年 2021年 25 1 2021年 27 3 2021年 5 4 2021年 17 4 2021年 2021年 版权©2021年鑫刘et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

缺氧性肺血管重塑(PVR)是体内慢性阻塞性肺疾病的主要病理基础和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。肺动脉内皮细胞(PAEC)炎症,和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、肥大和胶原蛋白PVR的改造是重要的病理生理组件。内源性二氧化硫(2)被发现小说gasotransmitter心血管系统以其独特的生物学特性。这项研究的目的是探讨作用的内皮细胞(EC)派生2在PAEC炎症的恶化,PASMC增殖、肥大和胶原重塑PVR和可能的机制。EC-specific天门冬氨酸氨基转移酶1基因(EC-AAT1-Tg)老鼠 在活的有机体内。肺动脉高压是由缺氧诱导的。右心导管术和超声心动图检测小鼠血液动力学的变化。病理分析肺动脉。采用高效液相色谱法检测2内容。人类PAECs (HPAECs)慢病毒包含AAT1 cDNA或成分和人类PASMCs cocultured (HPASMCs)应用 在体外。所以2探测器和酶联免疫吸附试验检测2内容和确定p50活动,分别。缺氧引起的显著减少2内容在小鼠肺和HPAECs和增加右心室收缩压,肺动脉壁厚,muscularization,和的表达PAEC ICAM-1 MCP-1 PASMC ki - 67,胶原蛋白I, αsma ( p < 0.05 )。然而,EC-AAT1-Tg有足够2内容避免上述增加缺氧引起的( p < 0.05 )。从力学上看,EC-derived2缺乏推广HPAEC ICAM-1和MCP-1 cocultured HPASMC ki - 67和胶原蛋白表达,由andrographolide废除,p50抑制剂( p < 0.05 )。与此同时,EC-derived所以2缺陷的表达增加cocultured HPASMC αsma ( p < 0.05 )。总的来说,这些发现表明,EC-derived2抑制控制PAEC p50激活炎症以自分泌的方式和PASMC增殖、肥大、旁分泌的方式和胶原蛋白的合成,从而抑制缺氧PVR。

 中国国家自然科学基金 82070445 81770422 91439110 1。介绍

老化是多种疾病的一个重要风险因素( 1- - - - - - 3]。与全球老年人口的增加,衰老和衰老相关疾病的发病率,例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症(群)也逐渐增多 4, 5]。其中,缺氧肺动脉高压(PH)和肺血管重塑(PVR)是重要的病理基础。PVR包括肺动脉内皮细胞(PAEC)功能障碍和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、肥大,胶原蛋白积累( 6- - - - - - 9]。以前的研究报道,这种不平衡在小血管活性的分子PVR的进展中发挥了重要作用。之间的失衡protein-derived生物活性分子,活性脂质介质,小核酸,气体信号分子主要是参与了肺动脉结构变化和异常血管收缩和血管舒张 10- - - - - - 16]。然而,机制过度PAEC炎症,PASMC增殖、肥大,胶原蛋白改造仍不明朗。

最近的研究表明,内皮细胞(ECs)发挥重要作用在维持血管内稳态,而电子商务功能障碍会导致各种血管疾病( 17, 18]。例如,雪等人发现过度引起的还有EC-derived自发的PH值通过促进PAEC炎症和PASMC增殖( 19]。此外,电子商务功能障碍和endothelial-to-mesenchymal细胞过渡增强胶原蛋白积累在人类纤维化疾病的发病机理 20.]。这些结果表明,ECs可能影响ECs的功能和其他邻近细胞(主要是平滑肌细胞(smc))在血管壁自分泌/旁分泌的方式,由ECs PVR的发展起着重要的作用。但是,ECs的机制影响的行为PAECs PASMCs扮演一个角色在发展PVR是复杂,尚未完全阐明。

2008年,内源性二氧化硫(2)/天冬氨酸转氨酶(AAT)通路被发现存在于血管ECs的老鼠 21]。最近,内生的生产2催化AAT1已被确认的人类PAECs (HPAECs) [ 22]。gasotransmitter,2有一系列重要优势,包括持续生产,快速扩散和自由通过细胞膜短半衰期。它运用各种心血管系统的生理功能。例如, 在活的有机体内、外生2捐赠者显示大鼠动脉粥样硬化的保护作用和sepsis-induced通过抑制炎症细胞(心脏功能障碍 23, 24]。 在体外的不足2导致细胞增殖和胶原蛋白的积累( 25]。此外,内生的不足2可能参与心肌肥厚的发病机制( 26]。这些数据表明,EC-derived2可能发挥监管作用PAEC炎症以自分泌的方式在PASMC增殖,肥大,胶原沉积以旁分泌的方式。因此,在目前的研究中,我们进一步探讨EC-derived是否如此2可能控制PAEC炎症以自分泌的方式和控制PASMC增殖、肥大,和胶原蛋白沉积以旁分泌的方式揭示新PAEC炎症和PAEC-PASMC通信机制的控制PASMC增殖,肥大,胶原重塑2。

最近的数据表明,EC炎症,SMC增殖和胶原合成的控制下核因子- κB (NF - κB) ( 27, 28]。简单地说,一些刺激,如肿瘤坏死因子 α(肿瘤坏死因子- α),导致我的激活 κB激酶复杂,允许我 κB进行磷酸化和退化,NF - κB二聚体(主要认为是p50形成)可能促使细胞核促进基因转录( 29日]。p50显然限制E-selectin表达诱导的抑制TNF - α在人类脐静脉ECs, NF - κB激活引发膀胱SMC胶原生物合成和扩散 30., 31日]。但迄今为止p50监管机制尚不清楚。有趣的是,内生所以2表现出抑制NF -保护作用 κB激活脂肪细胞和巨噬细胞。

根据这些证据,在这项研究中,我们旨在确定EC-derived的可能角色2缺氧PVR的进展及其可能的潜在机制与PAEC炎症反应,PASMC增殖、肥大,和胶原蛋白生产揭示新PAEC炎症和PAEC-PASMC通信机制的控制PASMC增殖,肥大,胶原重塑2。

 2。材料和方法 2.1。动物模型

内皮特异性AAT1转基因(EC-AAT1-Tg)和野生型小鼠(WT)同窝出生仔畜(C57BL / 6 j背景)从Cyagen购买生物科学(苏州、中国)。基因型是证实使用聚合酶链反应分析10天大的老鼠。雄性小鼠年龄在10 - 12周随机分为WT,缺氧WT (WT + H), EC-AAT1-Tg,缺氧EC-AAT1-Tg (EC-AAT1-Tg + H)组。WT和EC-AAT1-Tg组的小鼠吸入室内空气(21%啊2),而缺氧小鼠被放置在一个小动物低氧室( 9 ± 0.5 %啊2)(XBS-02B;杭州Aipu仪器有限公司,中国)8 h每天5周诱导缺氧PH值( 32]。所有机构和国家动物保健和使用指南(渔业)。动物实验是实验动物伦理委员会批准的北京大学第一医院(道德没有。201526)。

 2.2。高效液相色谱法(HPLC)定量检测所以<子> 2 < /订阅>内容在小鼠的肺部组织

如前所述,高效液相色谱法(安捷伦1200系列;美国安捷伦科技,CA)是用于检测2小鼠肺组织中的内容。简单地说,100年 μL标准亚硫酸钠和一个示例的小鼠肺组织匀浆混合着70人 μL(硼氢化钠(0.212 mol / L) Tris-HCl (0.05 mol / L, pH值8.5)。混合物在室温下培养了30分钟。接下来,5 μL (monobromobimane(70更易/ L)乙腈混合与170年 μL混合物。上述混合物是孵化后42°C 10分钟,40岁 μL(高氯酸(1.5 mol / L)补充道。去除蛋白质沉淀和中和混合物,混合物是离心机(12400克)在25°C 10分钟,和10 μL (Tris-HCl(2摩尔/升,pH值3.0)添加到上层清液。最后,高效液相色谱操作和结果进行分析(如前所述 33]。

 2.3。检测鼠标右心室收缩压(RVSP)变化对心脏导管插入术

老鼠的RVSP被导管直接测量。老鼠被0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.1毫升/ 10 g)。通过外部颈静脉导管插入到鼠标的右心室。提单- 420 f生物功能实验系统(成都Taimeng仪器有限公司,中国)是用来测量鼠标RVSP预测肺动脉压力的变化( 32]。

 2.4。测量小鼠肺加速时间(PAT)和肺排出期使用超声心动图(PET)

超声心动图进行使用Vevo 2100高分辨率成像系统(Visualonics,多伦多,加拿大)。老鼠最初由0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.1毫升/ 10 g)。肺血流量的脉冲波多普勒记录从胸骨旁的获得在主动脉瓣水平短轴视图。样本定位在肺动脉瓣的尖端传单和对齐最大化层流如前所述。帕特(定义为从发病的时间流峰值速度脉冲波多普勒记录)和宠物(时间从开始到终止肺动脉流)变量被确定。所有测量变量的平均3 - 5个心动周期( 34]。

 2.5。准备和小鼠肺组织形态学分析

老鼠被颈椎错位。肺部被移除和冲洗4°C磷酸盐(PBS)。肺被固定在4%多聚甲醛溶液24小时准备或冻结部分石蜡包埋的肺部组织。部分被苏木精和伊红染色(他)和哈特的形态分析方法。正如之前报道的( 35],muscularization的程度可以由nonmuscular船只的数量之比(NMV),部分肌动脉(PMA)和肌肉动脉(MA)。PVR的比例可以通过计算定量分析15—50岁 μm肺小动脉muscularization。

 2.6。免疫荧光

冻结的部分肺组织和细胞冲洗PBS和4%多聚甲醛溶液固定了20分钟。组织切片和细胞被封锁与牛血清白蛋白和孵化与主抗体在一夜之间4°C (vWF: 1: 200年,中山金桥生物技术有限公司,有限公司,中国;美国Sigma-Aldrich AAT1 1: 50;p-p50 1: 50和ICAM-1 1: 20,圣克鲁斯生物技术公司,美国;p50 1: 100和ki - 67 1: 100年,细胞信号技术公司美国;F4/80 1: 300年, αsma 1: 300年,胶原蛋白1:25和MCP-1 1: 100年,英国Abcam公司)。第二天,二次荧光抗体是在黑暗中孵化。所有部分都是复染色与核4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI;中山金桥生物技术有限公司,中国)。免疫荧光成像进行了使用共焦激光扫描显微镜(徕卡,位于德国)的观察和比较。

 2.7。主要HPAEC文化

主要HPAECs和初级电子商务文化系统从PriCells购买生物医学科技有限公司有限公司(武汉);在4 - 6代细胞用于实验。包含AAT1成分、cDNA HPAECs与慢病毒转染(Cyagen生物科学、苏州、中国)2 - 3天诱导AAT1击倒或超表达。1%啊2被用来诱导缺氧细胞炎症模型。

 2.8。基本人类Coculture PASMCs (HPASMCs)和HPAECs

主要HPASMCs和初级SMC文化系统从生命线购买电池技术(美国)。Transwell板块(康宁,中国)用于coculture HPASMCs HPAECs。我们播种HPASMCs transwell板块的下舱采用SMC文化系统。感染HPAECs被种植在上层舱与EC文化系统和微孔膜分离较低的隔间。p50 andrographolide(4的抑制剂 μ美国莱克米,穿心莲内酯)被用于实验 30.]。

 2.9。所以<子> 2 < /订阅> Probe-Based原位<斜体> < /斜体> <子> 2检测在HPAECs < /订阅>的内容

所以的2荧光探针用于分析2内容HPAECs 原位正如之前报道的( 22]。后的所以2探测器被原子核与DAPI染色,我们观察到的红色荧光强度2探测高分辨率的激光共焦显微镜下。

 2.10。免疫印迹

肺组织或细胞裂解缓冲获得总蛋白细胞溶解。变性蛋白质分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到硝化纤维素膜(美国Amerisco)。膜是孵化与特定的初级抗体(GAPDH 1: 4000年, β肌动蛋白1:4000年,AAT1 1: 1000年,ICAM-1 1: 400年,MCP-1: 1000年,ki - 67 1: 500年,胶原蛋白我1:1000年, αsma 1: 1000和p-p50 1: 1000)和二次抗体(1:2000)和辣根过氧化物酶共轭。FluorChem M MultiFluor系统(美国Proteinsimple)是用来扫描灰度的蛋白带。ImageJ软件被用于定量分析每一个乐队,每个蛋白质带与自己的内部参考GAPDH或纠正 β肌动蛋白灰度( 33]。

 2.11。p50 dna结合活性检测到活跃Motif-Enzyme-Linked免疫吸附试验(ELISA)

活跃motif-ELISA(活动主题,美国)是用来确定p50 HPAEC核dna结合活性的蛋白质。最初执行核蛋白质提取步骤如前所述[ 14]。dna结合活性p50当时评估根据制造商的指示。简而言之,绑定缓冲,样本稀释溶解产物,1 x洗缓冲区,p50主要抗体(1:1000年,准备1 x抗体绑定缓冲),二级抗体和彩色显影液依次添加。在实验中我们观察到的颜色变化。实验时停止转向温和的深蓝色颜色通过添加停止解决方案,然后,颜色变黄。最后,我们测量吸光度值在450 nm尽快。

 2.12。附着力测试THP-1单核细胞系和HPAECs

诱导HPAEC炎症反应后,THP-1单核细胞最初沾染了红色荧光迪勒(Beyotime生物技术、中国)被添加到HPAECs。HPAECs THP-1细胞孵化在37°C 1 h。PBS被用来去除unadhered THP-1细胞。随后,我们与4%多聚甲醛固定细胞20分钟的解决方案。最后,包含DAPI添加安装介质,荧光免疫荧光显微镜下观察。

 2.13。数据分析

与SPSS 21.0统计分析软件SPSS Inc .)、美国)。数据表示为 的意思是 ± 扫描电镜 用单向方差分析和分析。 p 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。缺氧导致减少EC-Derived所以<子> 2 < /订阅>

免疫荧光法和高效液相色谱法显示在PAECs AAT1蛋白表达减少2内容在WT小鼠的肺组织缺氧而控制WT老鼠(数据 1(一)和 1 (b))( p < 0.05 )。通过免疫印迹分析和2荧光探针方法,我们进一步确认与控制车辆组相比,所以AAT1蛋白质的水平2在缺氧HPAECs表达下调,而过度的AAT1显著提高内生2水平ECs和防止EC-derived下降2缺氧引起的(数据 1 (c)和 1 (d))( p < 0.05 )。

增加EC-derived所以2改善低氧诱导博士(a)免疫荧光 原位检测AAT1鼠标PAECs蛋白表达。绿色荧光代表AAT1蛋白质,和红色荧光代表vWF ECs的标志;细胞核与DAPI染色。(b)高效液相色谱法进行检测2内容在小鼠肺组织( n = 5 − 17 )。(c)进行免疫印迹分析检测HPAECs AAT1蛋白质的表达水平( n = 10 )。红色(d)2荧光探针法来确定2水平HPAECs,细胞核HPAECs与DAPI染色。(e, f)导管法进行检测鼠标右心室收缩压(RVSP) ( n = 6 − 8 )。(g h)肺加速度的比值(PAT)肺射血时间(PET)鼠标肺动脉血流测量使用超声波( n = 8 )。(i, j)他和哈特的方法被用来检测PVR的老鼠。哈特(k)的方法进行了分析muscularization小老鼠肺血管的程度( n = 8 );NMV: nonmuscular船只;PMA:部分肌肉动脉;马:肌肉动脉。数据被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 酒吧、规模:20 μm。

 3.2。增加EC-Derived所以<子> 2 < /订阅>改善低氧诱导PVR和体内PH <斜体> < /斜体>

揭示EC-derived这样的角色2在缺氧PVR的发病机制,我们构造EC-AAT1-Tg老鼠增加2在鼠标PAECs(图的水平 S1),我们发现一个在PAECs所以AAT1蛋白的表达增加2内容的肺EC-AAT1-Tg老鼠,老鼠相比WT组(数字 1(一)和 1 (b))( p < 0.05 )。间歇性低氧暴露5周后,无论是RVSP检测到正确的心脏导管和帕特/宠物比在这个实验中表明缺氧WT (WT + H)小鼠相比发达国家重要的PH值控制WT老鼠。我们也观察到,PVR的标记,肺动脉壁的厚度,和muscularized动脉的比例显著增强小鼠WT + H组的他和哈特的方法。然而,相比之下,老鼠与增加EC-SO EC-AAT1-Tg组2内容,缺氧并没有引起重大PVR和PH值在老鼠EC-AAT1-Tg + H组(数字 1 (e)- - - - - - 1 (k))( p < 0.05 )。上述结果表明,减少2在ECs导致血管重塑和缺氧小鼠的PH值增加。

 3.3。增加EC-Derived所以<子> 2 < /订阅>改善低氧诱导PAEC炎症,PASMC增殖、肥大,胶原蛋白的生产

我们下一个试图确定EC-derived这样的角色2在PAEC炎性反应,PASMC增殖、肥大和胶原蛋白的合成,这大大有助于PVR。 在活的有机体内通过免疫荧光 原位检测ICAM-1 MCP-1表达式和巨噬细胞浸润在肺血管,我们发现与WT老鼠相比,缺氧急剧增加的表达ICAM-1 MCP-1,已知的标记EC鼠标PAECs,炎症过程和巨噬细胞浸润的肺动脉WT + H老鼠。此外,免疫印迹ICAM-1蛋白质的定量测定小鼠肺显示类似的结果(数据 2(一个)和 2 (b),图 S2一个和 S2b) ( p < 0.05 )。但EC-AAT1-Tg治疗增加2级成功压抑的低氧诱导蛋白表达的增加ICAM-1 MCP-1,和小鼠肺组织中巨噬细胞浸润(数据 2(一个)和 2 (b),图 S2一个和 S2b) ( p < 0.05 )。符合 在活的有机体内结果,我们发现AAT1过度增加EC-derived的内容2明显抑制低氧诱导增加ICAM-1和MCP-1 HPAECs THP-1 HPAECs细胞粘附 在体外(图 S2c - S2f) ( p < 0.05 )。这些数据表明,增加2ECs可能抑制缺氧性血管炎症以自分泌的方式。

增加EC-derived所以2改善低氧诱导PAEC炎症,PASMC增殖、肥大和胶原蛋白的生产 在活的有机体内。(一)免疫荧光 原位检测ICAM-1鼠标PAECs蛋白表达;绿色荧光代表ICAM-1蛋白质。(b)免疫印迹分析检测ICAM-1蛋白质的表达水平在小鼠肺组织( n = 10 )。免疫荧光(c, d) 原位检测ki - 67, α在鼠标PASMCs sma,胶原蛋白表达;绿色荧光代表ki - 67和胶原蛋白,和红色荧光代表 αsma。数据被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 酒吧、规模:20 μm。

然后我们评估EC-derived如此的影响2在缺氧PASMC增殖、肥大和胶原沉积 在活的有机体内。与WT组的小鼠相比,免疫荧光显示增强ki - 67染色的肺动脉WT + H组。而与EC-AAT1-Tg组的小鼠相比,没有发现显著增加在ki - 67的表达缺氧诱导的小鼠EC-AAT1-Tg + H组(图 2 (c))。此外,免疫荧光显示增加 αsma表达,SMC肥大的标记,在WT小鼠在缺氧肺动脉与WT normoxia下老鼠相比,而没有显著差异 αsma表达EC-AAT1-Tg老鼠之间,没有低氧暴露(数字 2 (c)和 2 (d))。我们也观察到,增加胶原蛋白我PASMCs EC-AAT1-Tg小鼠缺氧成功压抑下的老鼠有足够2(图 2 (d))。上述结果表明,增加EC-derived2改善低氧诱导PASMC增殖、肥大和胶原蛋白积累以旁分泌的方式。

 3.4。EC-Derived所以<子> 2 < /订阅>缺乏激活HPAEC炎症,HPASMC增殖、肥大和胶原蛋白合成体外<斜体> < /斜体>

直接识别EC-derived的作用2在HPAEC炎症过程中,HPASMC增殖、肥大和胶原蛋白的生产,我们用慢病毒感染HPAECs包含AAT1成分减少的关键酶AAT1的表达2生产。通过免疫印迹分析和2荧光探针的方法,所以我们证实AAT1蛋白质水平2探针染色显著降低AAT1-knockdown HPAECs (AAT1成分)。然而,治疗2捐赠者恢复所以2水平HPAECs(数字 3(一个)和 3 (b))( p < 0.05 )。

EC-derived所以2缺乏激活HPAEC炎症、HPASMC增殖和胶原蛋白合成 在体外。(一)免疫印迹分析检测HPAECs AAT1蛋白质的表达水平( n = 12 )。(b)的红色2荧光探针法检测2在HPAECs水平;细胞核与DAPI染色。(c)免疫印迹分析用于检测ICAM-1和MCP-1蛋白质的表达水平HPAECs ( n = 12 )。(d)免疫荧光法检测HPAECs ICAM-1蛋白的表达水平 原位。紫色荧光代表ICAM-1蛋白质。(e)荧光方法进行检测THP-1细胞的粘附和HPAECs。红色的迪勒颜色标志着THP-1细胞,DAPI颜色标志着HPAECs的细胞核。的(f)图transwell coculture系统使用 在体外。(g)免疫印迹分析方法来检测ki - 67的表达水平和胶原蛋白在HPASMCs cocultured HPAECs ( n = 10 )。数据被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 酒吧、规模:20 μm。

与对照组的争夺中,我们进一步验证的蛋白表达ICAM-1 MCP-1和单核细胞粘附的数量HPAECs AAT1成分组都明显增加。然而,补充2捐赠成功抑制这些增加AAT1 shRNA HPAECs(数字 3 (c)- - - - - - 3 (e))( p < 0.05 )。此外,HPASMCs cocultured AAT1 HPAECs的shRNA集团ki - 67的表达增加,胶原蛋白I, αsma,也抑制了补充2捐赠者在HPAECs(数字 3 (f)和 3 (g),图 S3一个和 S3b) ( p < 0.05 )。上述研究直接建议2来自ECs监管HPAECs和HPASMCs的功能。此外,EC-derived的不足2激活的炎症反应HPAECs以自分泌的方式,和增生,胶原蛋白的生物合成,HPASMCs肥大以旁分泌的方式。

 3.5。EC-Derived所以<子> 2 < /订阅>抑制p50激活镇压PAEC炎症,PASMC增殖和胶原沉积

考虑到NF - κB(特别是p50)形成中起关键作用细胞炎症、增生,胶原代谢,我们进一步观察p50激活HPAECs和HPASMCs揭示EC-derived的机制2起到了保护作用。p50显著增强的核易位的HPAECs AAT1 shRNA集团与集团的争夺,但这种效应被治疗逆转2供体(图 4(一))。

EC-derived所以2抑制p50激活镇压PAEC炎症,PASMC增殖和胶原沉积。(一)免疫荧光 原位检测HPAECs p50蛋白质分布的。红色荧光代表p50蛋白质,DAPI染色标签HPAEC核。(b)免疫荧光 原位检测p50蛋白质分布HPASMCs cocultured HPAECs。绿色荧光代表p50蛋白质,DAPI染色标签HPASMC核。(c)免疫印迹分析用于检测ICAM-1和MCP-1蛋白质的表达水平HPAECs ( n = 12 )。免疫荧光(d, e) 原位检测ki - 67和胶原蛋白表达在HPASMCs cocultured HPAECs。绿色荧光代表ki - 67和胶原蛋白。穿心莲内酯:andrographolide p50的抑制剂。数据表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 规模:20 μm。

此外,在低氧诱导HPAEC炎症反应、磷酸化、核易位,p50活动明显增加HPAECs缺氧的车辆(车辆+ H)组车辆与常氧组。然而,没有发现显著差异在AAT1-overexpressed HPAECs常氧和缺氧的治疗组之间(图 S4a - S4c) ( p < 0.05 )。此外, 在活的有机体内EC-AAT1-Tg废除低氧诱导p50激活(图 S4d)。

与此同时,我们发现,抑制内源性2代在HPAECs核易位的p50 HPASMCs cocultured与HPAECs显著激活,压抑的治疗2供体(图 4 (b))。这些结果表明,p50可能的分子目标2。

调查是否HPAECs的炎症反应和扩散和胶原蛋白积累HPASMCs被p50介导,干预与穿心莲内酯,p50的抑制剂,表明,穿心莲内酯成功阻止核易位p50 EC-derived的减少所致2在HPAECs和HPASMCs(数字 4(一)和 4 (b))。同时,增强表达水平ICAM-1和MCP-1 HPAECs AAT1shRNA组显著地抑制的穿心莲内酯治疗(图 4 (c))( p < 0.05 )。同意HPAECs的结果,ki - 67和胶原表达的增加我在HPASMCs cocultured与HPAECs AAT1shRNA集团也抑制了穿心莲内酯(数字 4 (d)和 4 (e))。上述结果表明,穿心莲内酯完全封锁了增加HPAEC炎症,HPASMC增殖和胶原蛋白生产EC-derived下降造成的2和p50 PAEC的关键分子目标控制炎症,PASMC增殖和胶原重塑2。

 4所示。讨论

我们证明了EC-derived2是一个重要的内生缺氧PVR的控制器。它抑制PAEC炎症过程以自分泌的方式和PASMC增殖、肥大,胶原蛋白积累以旁分泌的方式。NF - κB p50信号可能调解EC-derived上述效应2。

PVR的主要病理特点是体内慢性阻塞性肺病和群 6, 7]。PAEC炎症的关键角色,PASMC增殖、肥大,胶原蛋白沉积在PVR的发病机制已经被先前的研究表明( 8, 9, 11, 25, 36]。然而,该机制的内生控制PVR尚未确定。证据支持,ECs PVR的发病机制中发挥重要作用[ 18, 19]。然而,PAEC炎症是如何监管和是否PASMC增殖,肥大,胶原蛋白合成控制通过PAEC-PASMC交流在PVR并不完全清楚。

最近,gasotransmitter2具有一系列特性,包括持续生产,快速扩散,产生广泛的功能已被证明是开在HPAECs [ 21, 22]。以前,我们的实验室和其他显示的关键角色2捐赠者在控制细胞胶原代谢、炎症、增生、肥大在心血管疾病的发病机制 23- - - - - - 26]。在目前的研究中,我们发现,减少内源性2与重要的PVR和HPAECs缺氧小鼠PH值,和低氧暴露导致鼠标PAECs AAT1蛋白质的表达下调表达,HPAECs。这一发现表明,内生2/ AAT1 ECs的途径可能是与缺氧PH值和PVR有关。

调查EC-derived的监管效果2在缺氧PH值和PVR的发展,机制,EC-AAT1-Tg小鼠强迫AAT1在使用ECs的表情 在活的有机体内实验,AAT1 cDNA与慢病毒载体转染AAT1表达 在体外实验。与WT老鼠,EC-AAT1-Tg老鼠没有回应低氧刺激,结果表明,低氧暴露诱导增加RVSP PVR WT老鼠,但常氧EC-AAT1-Tg小鼠表现出类似RVSP EC-AAT1-Tg老鼠暴露在缺氧和血管结构。此外,低氧诱导炎性因子的表达ICAM-1和MCP-1 PAECs和巨噬细胞浸润在肺动脉缓解EC-AAT1-Tg老鼠。按照结果 在活的有机体内,AAT1超表达了ICAM-1 hypoxia-stimulated表达式和MCP-1 HPAECs HPAECs和单核细胞粘附。众所周知,PVR增厚板产生的主要媒体由于增加PASMC增殖,肥大,胶原沉积 8, 11, 25, 36]。尤其是细胞肥大是一个著名的细胞衰老标志( 2, 37]。因此,我们观察到EC-derived的效果2PASMC的行为 在活的有机体内。数据显示缺氧刺激增殖标志物表达的增加ki - 67,肥大的标记 αsma,古典胶原蛋白我在PASMCs WT老鼠,但不是在EC-AAT1-Tg老鼠。上述结果表明EC-derived这样一个重要的角色2在缺氧PVR的规定。

相反,直接调查EC-derived的效果2HPAEC炎症,HPASMC增殖、肥大,胶原沉积,HPAECs转染人类AAT1 shRNA慢病毒减少EC-derived的水平2,所以2捐赠用于拯救AAT1击倒的效果。正如我们所料,内生的不足2导致HPAECs自发过度ICAM-1和MCP-1 ECs和HPAECs单核细胞粘附。最近,内生的不足2在脂肪细胞和巨噬细胞被发现产生自发的炎症反应,加强内生的保护作用2在心血管系统( 38, 39]。有趣的是,HPASMCs cocultured与AAT1 shRNA HPAECs了PH表型特点是ki - 67和增加 αsma表达,胶原蛋白的积累我在协会因此下降2HPAECs中的内容。这些结果进一步支持EC-derived如此2是一个重要的内生PVR的控制器。EC-derived所以2抑制PAEC炎症过程以自分泌的方式,和coculture HPAECs HPASMCs进一步证实EC-derived2抑制PASMC增殖、肥大和胶原蛋白积累以旁分泌的方式。

演示EC-derived的机制2控制PAEC炎症、PASMC增殖和胶原蛋白积累,治疗基因击倒,所以2捐赠者在HPAECs表明EC-derived的不足2促进核易位的p50 HPAECs和HPASMCs显著增强PAEC炎症,PASMC增殖和胶原重塑。相比之下,EC-derived的增加2由AAT1超表达明显抑制低氧诱导激活p50 PAECs,从而衰减缺氧PAEC炎症,PASMC增殖和胶原重塑 在体外和 在活的有机体内。更有趣的是,穿心莲内酯治疗,p50抑制剂,明显核易位p50阻塞,以及随后PAEC炎症,PASMC增殖和胶原蛋白积累EC-derived下降引发的2在HPAECs和HPASMCs。因此,这些发现澄清EC-derived2抑制p50 PAECs激活控制炎症,PASMC增殖和胶原蛋白的积累。

这样的机制2抑制p50激活尚未阐明。dna结合活性p50受氧化还原反应,并没有nitrosylates半胱氨酸巯基p50并显著抑制其dna结合活性组( 40, 41]。有趣的是,所以2也涉及氧化还原蛋白质改性,如AAT1 p65,调节蛋白质功能与半胱氨酸巯基组( 42, 43]。此外,先前的研究还表明,TGF - β/ Smad Raf-1 / MEK-1 / Erk / MAPK AE2和Dkk1 / Wnt信号通路被卷入的规定2对PASMC增殖、肥大和胶原沉积( 35, 44- - - - - - 49]。在未来,进一步调查的机制2调节p50和暴露的潜在临床应用价值2气体治疗缺氧的PH值是必要的。

 5。结论

获得的数据阐明内生2ECs施加自分泌和旁分泌作用控制PAEC炎症,PASMC增殖、肥大和胶原蛋白抑制PVR缺氧引起的改造。研究结果揭示了小说PAEC-PASMC通信机制内生控制缺氧EC-derived PVR的2。此外,本研究发现了一个潜在的目标治疗体内缺氧PVR的心肺疾病。

 数据可用性

所有数据需要评估的结论存在于纸和/或补充材料。可能会被要求提供额外的数据与本文相关的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

我们感谢黄潘博士,温家宝Yu Zhizhou沈,Mengxiang太阳,羌族沈,和姚歌的专家技术咨询和Editage ( http://www.editage.cn)英语编辑。这项工作得到了国家自然科学基金(格兰特数字91439110,81770422,81770422)。

 补充材料

图S1:检测老鼠的基因型。老鼠数字1 - 9。数字1,3,7代表野生型小鼠(WT)。数字2、4 - 6和8 - 9代表内皮特异性AAT1转基因小鼠(EC-AAT1-Tg)。

图S2: EC-derived因此增加2改善低氧诱导PAEC炎症 在活的有机体内和 在体外。(一)免疫荧光 原位检测MCP-1鼠标PAECs蛋白表达。红色荧光代表MCP-1蛋白质和绿色荧光代表内皮细胞CD31标志。(b) 原位检测巨噬细胞的免疫荧光渗透鼠标左右肺动脉。绿色荧光代表老鼠巨噬细胞标记F4/80和红色荧光代表血管平滑肌标记 αsma。(c, d)免疫印迹分析( n = 9 )和免疫荧光方法被用来检测在HPAECs ICAM-1蛋白的表达水平。黄色荧光代表ICAM-1。(e)免疫印迹分析是用来检测在HPAECs MCP-1蛋白质的表达水平( n = 9 )。(f)荧光方法进行检测THP-1细胞的粘附和HPAECs。红迪勒染色标记THP-1细胞和DAPI颜色标志着HPAECs的细胞核。数据被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 规模:20 μm。

图S3: EC-derived2缺乏刺激HPASMC肥大 体外。(一)的表达水平 αsma蛋白质、平滑肌细胞肥大的一个标志,在HPASMCs cocultured与HPAECs检测到免疫印迹法( n = 9 )。(b)的表达水平 αsma蛋白质HPASMCs cocultured HPAECs 原位被免疫荧光法观察。红色荧光代表 αsma蛋白质和蓝色DAPI标记HPASMCs的细胞核。数据被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 酒吧、规模:20 μm。

图S4: AAT1过度抑制低氧诱导激活p50 PAECs。(一)免疫印迹分析用于检测在HPAECs p50蛋白的磷酸化水平( n = 9 )。(b)的分布p50蛋白质HPAECs被免疫荧光检测 原位。绿色荧光代表p50蛋白质。(c)活跃motif-ELISA进行检测的dna结合活动p50 HPAECs ( n = 9 )。(d)免疫荧光被用来 原位检测p-p50蛋白表达在鼠标PAECs,绿色荧光代表p-p50蛋白质。数据被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 , ∗ p < 0.05 规模:20 μm。

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