这个 Sm22α^-/- 鼠标线(B6.129S6 - tagln.^{tm2 (cre)公司}/J） 携带Cre重组酶基因插入内源性SM22 α轨迹是从杰克逊实验室购买的。所有动物程序均符合 实验动物的护理和使用指南由美国国立卫生研究院出版，并由河北医科大学机构动物护理和使用委员会批准。

从野生型和 Sm22α^-/- 在4°C下收集VSMC，并将蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏公司）添加到总条件培养基中以防止蛋白质降解。使用Bradford分析法（Bio-Rad）测定每个样品的蛋白质浓度。200  μG蛋白样品进行质谱分析。样品制备采用过滤器辅助样品制备(FASP)蛋白消化方案[ 11，并在10 kDa的MWCO过滤器(UFC500396, Amicon Ultra)上进行反应。蛋白质烷基化、消化、iTRAQ标记、离线2D LC-MS/MS分析、蛋白质组数据和生物信息学分析如前所述进行[ 12］.在WT和WT和H的VSMC介质中筛选粘附相关的差异蛋白 Sm22α^-/- ，通过基因本体（GO）分析鉴定显著富集的蛋白质。

原始测序reads可从GEO登录号GSE99811下的基因表达集获得，数据分析如前所述[ 13］.为了筛选与凋亡相关的差异基因，我们在circrasgef1b基因敲低的细胞中，确定了相对于控制的上调和下调的基因组中显著富集的氧化石墨烯功能类别。

10到12周大的雄性 Sm22α^-/- 实验中使用了WT小鼠。渗透微型泵（ALZET，2004型）以1000的剂量注入生理盐水或血管紧张素（Ang）II（A9525，Sigma-Aldrich） ng/kg/min溶解于盐水中。将泵放入皮下空间4周。处死小鼠后，将主动脉从周围结缔组织中分离出来。使用数码相机拍摄照片，并用于测量肾上腺主动脉的外径，如前所述[ 14］.在最后一对肋间动脉和右肾分支之间鉴定了腹主动脉的急性区域。使用图像Pro加软件在通过主动脉图像中的标尺调整尺度后，使用图像Pro加软件分析腹主动脉的最大宽度。使用三种测量的平均值。与来自对照的主动脉相比，小鼠中的AAA定义为Suprarenal主动脉外部宽度的50％或更高增加[ 15］.

免疫组化染色，冰冻切片用3%双氧水孵育，然后用3%正常阻断血清阻断。切片用抗CD14(1:50 0稀释，ab182032, Abcam)或SM的一抗孵育 α-actin(1: 500稀释，ab124964, Abcam)， 4℃过夜，然后用二抗，然后用DAB试剂盒(ZSGB-BIO，北京，中国)染色。细胞核用苏木精反染。与同种匹配的IgG单独孵育的切片作为阴性对照。

免疫荧光染色，冰冻主动脉切片用抗CD68抗体(1:500稀释，ab955, Abcam)孵育，然后用tritc结合的二抗。使用共聚焦激光扫描显微镜(瑞士徕卡SP5)监测荧光信号。

来自WT的主动脉的主要VSMC或 Sm22α^-/- 采用胶原酶消化法分离小鼠(8 ~ 12周龄，雄性)。分离细胞在低糖Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM;Invitrogen)，含10%胎牛血清(FBS;青霉素100 U/mL，青霉素100 μg / mL链霉素( 16, 17]通过SM的免疫荧光染色证实了VSMC的纯度 α-肌动蛋白。第3代至第5代的细胞仅用于进一步的实验。小鼠VSMC系MOVAS购自ATCC（CRL-2797），并在含有10%FBS和0.2%葡萄糖的高糖DMEM中培养 mg/mL G-418。在接受不同刺激之前，所有VSMC均在无血清培养基中培养24小时 HRAW264.7细胞购自ATCC（TIB-71）™) 在含10%FBS的低葡萄糖DMEM中培养，100 U/mL青霉素和100  μ克/毫升链霉素。

SM22的全长cDNA α克隆到pCMV-FLAG®-MAT-Tag™-1表达载体(C5864;Sigma-Aldrich)。用pAdeno-MCMV-HA-P2A-EGFP包装绿色荧光蛋白(GFP-)标记的腺病毒(pAdeno-MCMV-Flag-SM22) α-Mat-P2A-EGFP，Ad-SM22 α短)。用10¹⁰ pfu/mL adenovirus for 24 h, washed, maintained in serum-starved medium for 24 h, and then treated with indicated stimulations.

靶向小鼠circRasGEF1B（si-circRasGEF1B）、ZFP36（si-ZFP36）和干扰siRNA（si-Con）的siRNA双链体是从RiboBio（中国广州）设计并获得的；根据制造商的协议，使用Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂（Invitrogen）将siRNA瞬时转染到VSMC中。

通过PCR扩增CircraseF1B序列，并将其构建到pLCDH ciR载体（Geenseed Biotech，中国广州）中。合成不同序列的circRasGEF1B缺失突变体，并将其插入pLCDH ciR载体中，以过度表达突变体circRasGEF1B。将pLCDH空载体和pLCDH-circRasGEF1B或pLCDH-circRasGEF1B突变体用X基因HP DNA转染试剂（06366236001，Roche）转染血管平滑肌细胞24小时 h根据制造商的协议，然后使用指定的刺激进行处理。

巨噬细胞迁移活动使用24孔跨孔板进行 μm孔过滤器(康宁)。将VSMCs预先植入下腔。在达到融合后，血清饥饿的VSMCs被Ang II刺激(10^-5 M） 24小时 H此后，将RAW264.7细胞置于上腔。孵育6天后 h、 去除上膜表面的非迁移细胞，用4%多聚甲醛固定穿过下膜表面并扩散的细胞，并用龙胆紫染色。通过使用40倍物镜的显微镜，计算每个膜的迁移细胞数。每个滤波器中至少检查了三个随机场。每个实验一式三份，迁移表示为 的意思是 ± SD 每个字段计数的总单元格。

用Ang II刺激96孔培养板中的VSMCs（10^-5 M） 或指示治疗，然后，将RAW264.7细胞（用钙黄绿素AM标记，生命技术）添加到每个孔中。30岁以后 孵育分钟后，用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，小心地去除非粘附细胞。荧光强度由490和535处的激发和发射确定 纳米。对于腺病毒感染的血管平滑肌细胞，将RAW264.7细胞添加到每个孔中，并计数粘附细胞。

用ApopTag过氧化物酶检测冰冻主动脉切片的凋亡情况 原位凋亡检测试剂盒(S7100, Chemicon)根据制造商的说明。

根据说明书使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(556547,BD Pharmingen)检测VSMCs凋亡，使用BD LSRFortessa™流式细胞仪(BD Biosciences)分析凋亡指数。或者，使用ApopTag Red 原位凋亡检测试剂盒(Millipore)，质粒转染后的VSMC细胞凋亡采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)染色检测，荧光信号采用共聚焦激光扫描显微镜(Leica SP5，瑞士)监测。

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Life Technologies）提取总RNA。为了量化mRNA或circRNA的数量，使用M-MLV第一链试剂盒（Life Technologies）合成cDNA，并使用SYBR Green qPCR SuperMix UDG（Life Technologies）进行定量PCR.对于microRNA，使用QIAzol裂解试剂提取总RNA。使用Sangon Biotech（中国上海）的miRNA检测试剂盒进行逆转录和定量逆转录PCR。相对circRNA、mRNA或miRNA表达标准化为 β-肌动蛋白/GAPDH或U6 snRNA水平，使用 2. − Δ Δ 计算机断层扫描 方法。补充表中列出了每种底漆的顺序 1.在补充材料。每个基因的平均阈值周期是由至少三次独立实验确定的。

用RIPA裂解法制备细胞或组织的裂解物。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，并将其电转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜，并用抗VCAM-1（1）的一级抗体孵育 : 1000稀释，ab134047，Abcam），抗ZFP36（1 : 500稀释，sc-374305，圣克鲁斯），抗Bcl-2（1 : 1000稀释，sc-7382，圣克鲁斯），抗Bax（1 : 1000稀释，sc-7480，Santa Cruz），抗切割半胱天冬酶-3（1 : 1000倍稀释，ab49822，Abcam），抗前半胱天冬酶-3（1 : 1000稀释，ab32499，Abcam），抗SM22 α(1: 1000稀释，ab14106, Abcam)，抗icam -1(1: 1000稀释，ab222736, Abcam)，抗igfbp7(1: 500稀释，DF7131, Affinity Biosciences)，抗tnc(1: 500稀释，DF8051, Affinity Biosciences)， 4℃过夜。内部控制采用GAPDH(1: 1000稀释，ab181602, Abcam)。随后在室温下与irdy800®结合的二抗(1:2万稀释，Rockland)孵育1小时，随后使用奥德赛红外成像系统(LI-COR生物科学)扫描。每个探测波段的综合强度由Odyssey Imager软件确定。数据显示为 的意思是 ± SD 至少有三个独立的实验

在冰冷的PBS中洗涤VSMC，在裂解缓冲液中裂解（20mm / L Tris-HCl，pH 7.0,150mm / L NaCl，0.5％NP-40,5mm / L EDTA，新鲜加入1mm / L.dtt，1 mm / l pmsf和0.4 u / μL核糖核酸酶抑制剂），然后与5  μg ZPF36一级抗体（ABE285，默克）在4°C温度下持续2小时 h、 五十  μ将L蛋白A / g加琼脂糖（Santa Cruz）加入每个样品中，并将混合物在4℃下孵育4小时。用PBS洗涤粒料并重新悬浮在1ml Trizol试剂（Invitrogen）中。对水溶液中的沉淀的RNA进行QRT-PCR分析，以使用各种引物证明结合产物的存在。实验至少复制三次。

八到十道菜，共15道 在RNA下拉实验中使用直径为cm的血管平滑肌细胞。RNA下拉实验如所述进行[ 18］.简单地说，用0.4 U/的冰水PBS冲洗VSMCs μL核糖核酸酶抑制剂，500℃裂解  μL裂解缓冲液(20 mM/L Tris-HCl, pH 7.0, 150 mM/L NaCl, 0.5% NP-40, 5 mM/L EDTA，新鲜添加1 mM/L DTT, 1 mM/L PMSF, 0.4 U/ μL核糖核酸酶抑制剂），然后与3  μg生物素化DNA寡聚探针（由中国广州RiboBio公司设计和获得）在4°C下放置2小时 H总共50人  μ将LynaBeads™MyORE™链霉抗生物素蛋白C1磁珠（Invitrogen）加入到每个结合反应中，并在4℃下进一步温育4小时。用裂解缓冲液简要洗涤珠子三次;然后，通过免疫印迹鉴定富集的蛋白质，通过QRT-PCR鉴定富集的RNA。实验至少复制三次。

血管平滑肌细胞在PBS中洗涤，在4%多聚甲醛中固定30分钟 最小，并渗透15分钟 对于鱼类，根据荧光显微镜的用户手册，使用circRasGEF1B的特定探针培养细胞 原位杂交试剂盒(RiboBio，中国广州)。用荧光标记探针在杂交缓冲液中37°C孵育过夜进行杂交。细胞核经SSC缓冲液严格洗涤后，用DAPI (Invitrogen)进行反染色。使用共聚焦激光扫描显微镜(瑞士徕卡SP5)获取图像。

将circRasGEF1B转染24小时后，VSMCs过表达。然后用10 μg/mL ActD (C7698, Sigma-Aldrich)。在指定时间点收获总RNA，采用qRT-PCR检测mRNA表达。通过与加入ActD前的mRNA水平比较，测定ZFP36 mRNA的半衰期。

使用SPSS 16.0版或GraphPad Prism 6软件进行数据分析 意味着 ± SD 从至少3个独立实验中，每个独立实验重复3次，以获得平均值。正态分布的数据集由未配对的学生进行分析 T -测试2个独立组或配对 T 对2个依赖组进行单因素方差分析(ANOVA)，对≥3个依赖组进行bonferroni后多重比较检验。对于所有的统计比较，值为 P < ０．０５ < 0.05, 0.01, 0.001时，以1,2,3号星号表示。

我们首先证实了动脉粥样硬化的发生率较高，主动脉巨噬细胞浸润加重 Sm22α^-/- 与ang II注入的小鼠与WT小鼠相比（图 1（a）和 1（b）)，与先前的研究结果一致[ 10］.接着我们进行了TUNEL实验，发现TUNEL阳性细胞在主动脉介质中明显增加 Sm22α^-/- 与WT对照组相比，与SM组相比，与SM组间壁VSMCs数量减少一致 α-actin-positive染色(图 1（c）)。因此，我们推测SM22 α丢失可能导致巨噬细胞浸润，与VSMC凋亡相关。

评估SM22之间的潜在因果关系 α巨噬细胞浸润 体内在研究中，我们使用Boyden室进行了transwell迁移分析。 Sm22α^-/- 经或不经Ang II处理的VSMCs均能显著诱导RAW264.7细胞的transwell迁移(图) 2(一个))，增强与RAW264.7细胞的相互作用(图 2 (b))。此外，促炎分子TNF-的表达 α、MCP-1、IL-6和IL-1 β经血管紧张素II条件培养基（CM）处理的RAW264.7细胞中的血管紧张素II显著增加 Sm22α^-/- VSMC（图 2 (c))。救援SM22 α表达减少了相互作用 Sm22α^-/- 含巨噬细胞的血管平滑肌细胞（图 2 (d))，显示井间偏移减少(图 2 (e))和在相同条件下RAW264.7细胞中促炎分子的表达(图 2 (f))，表示 Sm22α^-/-VSMCs能够以SM22的形式招募和激活巨噬细胞 α在WT小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中不表达（数据未显示）。

探索如何 Sm22α^-/-血管平滑肌细胞募集并激活巨噬细胞，我们分析了野生型和野生型血管平滑肌细胞条件培养基（CM）的完整分泌组 Sm22α^-/- 老鼠。鉴定出iTRAQ产生的推定差异表达蛋白(1.5倍变化)。根据这些标准，共得到267个差异蛋白 Sm22α^-/-GO生物过程（BP）显示，与细胞粘附相关的分子TN-C、VCAM-1和NID-2在细胞内的表达显著上调20倍以上 Sm22α^-/- VSMCs(补充表 2.)Western blot证实了这些粘附分子的表达，并在细胞中显著升高 Sm22α^-/- VSMCs与WT细胞的比较(图 2 (g)),这表明 Sm22α^-/- VSMCs具有促炎分泌表型。既往研究表明，在人类动脉粥样硬化斑块中，vsmc与巨噬细胞通过VCAM-1的表达直接接触[ 19].进一步验证VCAM-1由 Sm22α^-/- 血管平滑肌细胞介导巨噬细胞浸润，特异性siRNA用于抑制粘附分子的表达。我们发现，VCAM-1的抑制显著降低了血管平滑肌细胞与RAW264.7细胞之间的相互作用（图 2 (h))。同样，VCAM-1中和抗体消除了这种相互作用(图) 2(我)).这些发现表明SM22 α通过表达VCAM-1, VSMCs与巨噬细胞相互作用。

人巨噬细胞通过Fas/Fas- l介导的细胞-细胞直接相互作用有效诱导VSMC凋亡[ 20］.我们发现，与对照组相比，由脂多糖- (LPS-)激活的RAW264.7细胞的CM处理的VSMCs的凋亡活性增加了1.62倍(图) 3（a）)，同时Bax表达增加，caspase-3切割，Bcl-2蛋白表达减少(图) 3（b）)。消除TNF-的作用 α从lps激活的巨噬细胞中，TNF-处理RAW264.7 CM诱导VSMCs的凋亡 α中和抗体。我们发现去除TNF- α没有消除RAW264.7 CM诱导的血管平滑肌细胞凋亡（图 3（c）)。此外，细胞凋亡 Sm22α^-/- VSMCs高于WT(图) 3 (d))。

众所周知，外源转录本对受体细胞的基因表达和功能进行重编程[ 21– 25］.为了检测巨噬细胞诱导VSMC凋亡的潜在介质，我们筛选并鉴定了一组在活化巨噬细胞中高表达的非编码rna (ncRNAs)，包括lincRNA-Cox2、miR-146a、miR-155、circRasGEF1B、circRNA-010231、circRNA-010056和circRNA-003780 [ 21, 26– 30］.其中，激活的RAW264.7细胞及其CM中5种非编码rna表达增加;特别是circRasGEF1B的增加更多(图) 3 (e)和 3 (f))。尽管检测到所有这些非编码rna，但在RAW264.7细胞CM处理的VSMCs中circRasGEF1B水平最高(图) 3 (g))。此外，circRasGEF1B的表达对巨噬细胞是特异性的，因为在LPS处理后，它在VSMCs中表达低且不变(图) 3 (h))荧光光谱进一步证实了这一结果 原位杂交试验(鱼)。荧光染色circRasGEF1B仅在活化RAW264.7细胞CM处理的VSMCs胞浆中观察到(图) 3(我))这表明CircraseF1b是从巨噬细胞传递到血管平滑肌细胞的。

为了进一步确定巨噬细胞来源的circRasGEF1B引发VSMC凋亡，我们将pLCDH-circRasGEF1B质粒转染VSMC。过表达circRasGEF1B的VSMCs中tunel染色的细胞百分比和Bax/Bcl-2的比例增加(图) 3 (j)和 3 (k)).circRasGEF1B介导的细胞凋亡在大鼠中更为严重 Sm22α^-/-VSMCs比WT细胞(图 3(左))。这些数据表明，circRasGEF1B是巨噬细胞诱导VSMC凋亡的新媒介。

在对照组和circrasgef1b缺陷的巨噬细胞中，转录组范围的数据已通过RNA测序(RNA-seq)报告[ 13].基于这些数据，我们通过高通量转录组分析确定了假定的差异表达基因（2倍变化截止值）。在差异表达基因中，筛选了10个潜在的凋亡相关基因，包括Ada、Tnfrsf-26、Relt、Mif、Cd74、Nradd、Ticam1、Cd5、Zfp36和Zfp36l1（补充表 3.），所有这些都在CircrasgeF1B缺陷组中下调。为了确定CircrasgeF1B调节这些基因的表达，我们使用QRT-PCR测试了在PLCDH-CircrasgeF1B转染的VSMC中所述10基因的表达。我们表明，ZFP36 mRNA水平显然是在CircrasgeF1B过表达后显然上调（图 4(一))，并伴有ZFP36蛋白升高(图 4 (b))。为了确定circRasGEF1B是如何上调ZFP36表达的，我们用ActD阻断vsmc中的新生RNA合成后，测量了ZFP36 mRNA的半衰期。与对照组相比，过表达circrasgef1b的VSMCs中ZFP36 mRNA半衰期增加(图) 4（c）)，表明ZFP36 mRNA的稳定性增强。为了确认ZFP36是否与circrasgef1b诱导的VSMC凋亡相关，我们在circrasgef1b过表达的VSMC中使用特异性sirna沉默ZFP36的表达(图) 4（d）)，并显示ZFP36基因敲除circrasgef1b诱导的细胞凋亡(图 4（e）)，并伴有Bax/Bcl-2比值降低和caspase-3表达断裂(图) 4（f）)，提示ZFP36介导circrasgef1b诱导的VSMCs凋亡。

有报道称，ZFP36家族通过与3结合促进mRNA衰变 ′ - utr与AU-rich元件(ARE)的靶mrna保持适当的靶转录本和蛋白水平，包括Bcl-2和ZFP36本身[ 31］.如上所述，CircrasgeF1b的过表达减少了Bcl-2表达（图 3(左))为了验证ZFP36升高与Bcl-2水平降低之间的因果关系，我们敲除了ZFP36，并显示circRasGEF1B过度表达的VSMC中Bcl-2 mRNA水平升高（图 5(一个))。为了检测ZFP36是否与Bcl-2 mRNA相互作用，我们分别使用抗ZFP36抗体和Bcl-2 mRNA探针进行RNA下拉。我们发现在circrasgef1b转染的VSMCs中，ZFP36蛋白和Bcl-2 mRNA的相互作用增加(图) 5 (b)和 5 (c))然而，circRasGEF1B的过度表达并未增加ZFP36蛋白与其含有富含AU元素的mRNA的相互作用（图 5 (d)和 5 (e))。

为了确定在circRasGEF1B过表达的VSMCs中，ZFP36优先结合并衰减Bcl-2 mRNA的机制，我们首先使用RegRNA 2.0预测circRasGEF1B与这两种mRNA和ZFP36蛋白结合的潜在RNA区域[ 32]和catRAPID计划[ 33，并对杂交进行了评估 Δ G RNAup Server的RNA-RNA对值[ 34］.在circRasGEF1B序列中观察到ZFP36蛋白的潜在结合区，且明显较低 Δ G 与ZFP36 mRNA结合相比，circRasGEF1B和Bcl-2 mRNA之间的值（补充表 4和5）;即，CircrasgeF1B可以用于将ZFP36和BCL-2 MRNA绑定在一起。这让我们进一步探索CircrasgeF1B指导ZFP36在ZFP36 mRNA存在下优先与Bcl-2 mRNA结合的机制。RIP和RNA下拉测定显示，通过使用ZFP36抗体检索CircrasgeF1b，并且还通过使用PLCDH-Circrasgef1b质粒转染的VSMC中的CircrasgeF1b探针检索ZFP36蛋白质（图 5 (f)和 5（g）).与ZFP36 mRNA探针相比，Bcl-2 mRNA探针检索到更多的循环f1b（图 5（h）)因此，在ZFP36 mRNA存在的情况下，circRasGEF1B使ZFP36优先与Bcl-2 mRNA结合。

为了确定circRasGEF1B序列中ZFP36的结合位点，我们使用了一系列circRasGEF1B缺失突变体来确定circRasGEF1B中与ZFP36结合的区域。我们表明，保留circRasGEF1B的nt 161-310序列的突变体与ZFP36结合，而其他突变体则完全丧失了其结合能力（图1） 6（a）)。此外，catRAPID预测circRasGEF1B的nt 244-302基元是ZFP36的结合位点。为了验证这一预测，我们将circRasGEF1B序列中ZFP36结合位点互补的阻断寡核苷酸转染到vsmc中。我们在RNA下拉实验中发现，阻断寡聚物抑制了circRasGEF1B与ZFP36的相互作用(图) 6（b）)。此外，在RNA下拉和RIP实验中，circRasGEF1B与ZFP36的相互作用在转染circRasGEF1B的VSMCs中增强，而在circRasGEF1B缺失突变体中没有增强(图) 6（c）和 6（d）)。

如上所述，杂化率较低 Δ G 与ZFP36 mRNA结合相比，circRasGEF1B和Bcl-2 mRNA之间的值（补充表 4和5)。为了进一步确定Bcl-2 mRNA在circRasGEF1B中的结合序列，我们合成了一系列生物素化的DNA探针，分别与转染不同circRasGEF1B缺失突变体的VSMCs孵育。随后用链霉亲和素珠拉下混合物，然后进行实时PCR。我们发现circRasGEF1B突变体保留了nt 311-444与Bcl-2 mRNA结合(图) 6（e）)。相比之下，circRasGEF1B缺失nt 244-302或311-444的突变体无法招募ZFP36来衰变Bcl-2 mRNA(图) 6（f）)，导致VSMC细胞凋亡减少(图 6（g）和 6 (h))。这些数据表明，circRasGEF1B作为一个平台，招募ZFP36选择性地衰减Bcl-2 mrna，这可能是ZFP36- mrna靶标特异性的关键决定因素。