OMCL 氧化医学和细胞寿命 1942 - 0994 1942 - 0900 Hindawi 10.1155 / 2021/2308317 2308317 研究文章 选择性血管老化特性引起的平滑肌细胞的DNA损伤 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9797 - 3890 Ataei Ataabadi • 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 8879 - 3177 Golshiri Keivan 1 范德林登 珍妮 1 2 3 德布尔 马丁尼 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 2836 - 2241 Duncker, 德克·J。 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 8078 - 7453 Juttner 安妮卡 1 德弗里斯 刘若英 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2249 - 1002 范Veghel 理查德。 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9368 - 5779 van der Pluijm 英格丽。 3 4 Dutheil 苏菲 5 Chalgeri Suman 5 张 Lei 5 林 艾米 5 https://orcid.org/0000 - 0002 - 1644 - 9553 戴维斯 罗伯特·E。 5 https://orcid.org/0000 - 0003 - 4749 - 686 x 斯奈德 格雷琴L。 5 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5052 - 3585 在 a·h·简 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7155 - 1756 后撤 安东·j·M。 1 Berenyiova 安德里亚 1 药理学与血管医学 内科 伊拉斯谟MC 鹿特丹 荷兰 erasmusmc.nl 2 实验分工心脏病学 心内科 胸腔中心 伊拉斯谟MC 鹿特丹 荷兰 erasmusmc.nl 3 部分子遗传学 伊拉斯谟MC 鹿特丹 荷兰 erasmusmc.nl 4 部血管手术 伊拉斯谟MC 鹿特丹 荷兰 erasmusmc.nl 5 胞内治疗公司 R 29日街430号 900套房 纽约 纽约10016 美国 intracellulartherapies.com 2021年 31日 8 2021年 2021年 2 6 2021年 16 7 2021年 16 8 2021年 31日 8 2021年 2021年 版权©2021•Ataei Ataabadi et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

一直未修理的DNA损伤已被确认为血管老化的诱发因素。之前我们已经表明,一个缺陷在DNA修复酶的功能或表达ERCC1(切除修复交叉互补1)在小鼠体内导致加速,nonatherosclerotic老化的血管系统早在出生后8周。删除ERCC1单从内皮部分解释这种老化,如endothelial-specific所示 Ercc1基因敲除小鼠。在这项研究中,我们确定血管老化由于血管平滑肌细胞的DNA损伤,通过平滑muscle-selective基因切除ERCC1在小鼠DNA修复(SMC-KO: SM22 αCre + Ercc1/ -)。SMC-KO血管老化特性及其野生型的同胞(WT: SM22 αCre + Ercc1fl / +)检查14周和25岁的周。SMC-KO和WT老鼠血压正常的人。WT相比,SMC-KO显示心率降低,部分缩短,心输出量。SMC-KO显示进步nonatherosclerotic血管老化的特点,因为他们年龄在14到25周。减少皮下微血管扩张,增加颈动脉僵硬观察。血管舒张反应测量主动脉环在器官浴endothelium-dependent和endothelium-independent反应减少,主要是由于减少NO-cGMP信号。NADPH氧化酶2和磷酸二酯酶1抑制改善相呼应。SMC-KO老鼠显示各种细胞因子水平升高,表明平衡支持和抗炎通路的变化。总之,SMC-KO老鼠累进血管衰老表型耐药和动脉导管与心脏重构和收缩功能障碍有关。的变化引起的DNA损伤可能是有限的VSMC但最终影响EC-mediated反应。 The fact that NADPH oxidase 2 as wells as phosphodiesterase 1 inhibition restores vasodilation suggests that both decreased NO bioavailability and cGMP degradation play a role in local vascular smooth muscle cell ageing induced by DNA damage.

 细胞疗法Inc .纽约 荷兰Technologie en Kennis Instituut-Life科学和健康 EMCLSH 19 - 0913 左Lijf en利文湖 60 1。介绍

心血管疾病(CVD)是全球发病率和死亡率的主要原因和医疗系统有一个巨大的经济负担 1]。即使发展控制经典危险因素,如吸烟、高胆固醇、糖尿病、高血压、心血管问题仍然是一个主要的健康问题。老龄化仍是最大的心血管疾病危险因素( 2]。老龄化的定义是一个依赖于时间的大多数生物体功能的恶化影响并导致高级生理完整性丧失,器官功能受损,和过早死亡的风险更大 3]。有不同因素与老化相关或加速老化的积累DNA损伤是主要的( 1, 4, 5]。DNA损伤可诱导内源性等不同来源(例如,生成的活性氧(ROS)和其他氧化反应)或外源性(如紫外线和电离辐射)活性代理可能会导致几百几千每天每细胞DNA损伤( 3, 6]。因为DNA修复的错综复杂的网络系统在我们的身体中,大部分的损伤将会消除。然而,一些病变不修复,这些持续的损伤能诱导转录问题,代谢和信号的变化,随着年龄的增长和细胞衰老,累积。根据中介,暴露程度,靶细胞,修复能力的个体差异,显示不同的个人间和老化瀑特异性(节段)的发展,人类生活在每日观察和衰老的动物模型 7, 8]。

一些转基因品系小鼠已经生成,加速老化模型。这些都是基于一个特定的DNA修复缺陷。可以针对不同的DNA修复系统和组件加速老化,其中,切除修复cross-complementation组1 (ERCC1)是一种蛋白质,有缺陷时,几种主要影响DNA修复系统( 9]。ERCC1-xeroderma萎缩(XP) F是一个structure-specific蛋白复合物作为酶酶参与修复的几种类型的DNA损伤,主要是笨重,helix-distorting损伤修复的核苷酸切除修复途径,而且双链断裂和interstrand交叉连接( 10- - - - - - 12]。 Ercc1缺乏老鼠重复使用了不同的组来研究人类老化特性( 13- - - - - - 16]。的 Ercc1∆/ - 鼠标是一种方便的模型来研究血管老化和潜在的治疗方法。∆等位基因的截断 Ercc17基因的氨基酸的糖基破坏ERCC1和XPF蛋白质之间的相互作用,随后引起DNA损伤积累渐进的方式( 7]。

Ercc1∆/ - 老鼠有一个短的寿命约为24 - 28周和显示许多类似人类的老化特性,如神经退化,骨质疏松症,和肝脏,肾脏,心脏,肌肉功能障碍的影响,主要从年龄大约12周( 15, 17]。关于心血管老化, Ercc1∆/ - 老鼠显示血管硬化和血管壁厚增加,血压升高,降低宏观和微血管放松主要是解释为减少NO-cGMP通路信号,一个主要玩家在老年人心血管系统功能障碍( 17]。 Ercc1∆/ - 老鼠显示节段性早衰症( 18),这表明影响器官可能会影响当地的DNA损伤过程,而不是一个系统。事实上,我们已经证明了 Ercc1淘汰赛特别是在血管内皮细胞(EC-KO)选择性地影响endothelium-derived一氧化氮(NO)和导致终末器官的灌注减少,血管渗漏,增加壁厚 7]。然而,血管平滑肌细胞(VSMC) Ercc1∆/ - 老鼠显示额外hyporesponsiveness没有比EC-KO老鼠( 17]。此外,有一个快速发展的颈动脉僵硬 Ercc1∆/ - 老鼠在EC-KO缺席( 17]。这些差异表明,一些老化特性 Ercc1∆/ - 老鼠可以通过DNA损伤诱导VSMC [ 7, 17]。解决这个问题如果当地VSMC DNA修复缺陷是至关重要的为特定的血管功能,观察到的变化 Ercc1∆/ - 老鼠,我们调查心血管功能在一个小鼠模型与特定的损失 Ercc1函数在平滑肌细胞(smc)。我们专注于改变NO-cGMP响应因为这是老化的主要标志和DNA的伤害血管功能障碍。

 2。方法 2.1。动物

我们评估了SMC基因组不稳定性对心血管功能的影响与SMC-targeted删除小鼠模型 Ercc1基于杂交与液氧的老鼠 Ercc1基因B6.129S6 - Taglntm2 (cre)公司 / J应变(SM22 αcreKI,杰克逊实验室的美国股票。006878)( 19]。SM22 αcreKI港口Cre recombinase-coding序列控制的内生transgelin或平滑肌22 α肌动蛋白启动子,这是研究平滑肌启动子。Cre重组酶的表达在胚胎SMC和心脏细胞,其他SM22的缺点 α在这个模型中(Cre紧张,没来 19, 20.]。除了在血管平滑肌细胞中表达,有报告显示启动子的激活血小板,脂肪细胞和髓细胞,完全特定的启动子平滑肌迄今为止没有被确认 20.]。针对平滑肌细胞,可以使用各种Cre重组酶模型。SM22Cre模型被用于这项研究。SM22 α是actin-binding监管蛋白质参与SMC收缩和作为一个标记来研究SMC-specific表达式模式 20.]。

随着 Ercc1液氧应变,我们使用了FVB / N background-based转基因小鼠产生的梅尔顿et al。(英国爱丁堡)[ 21]。SM22 αCre + / -雌性老鼠了 Ercc1+ / -生成SM22雄性老鼠 αCre + / -:: Ercc1+ / -在纯粹的C57BL / 6 j小鼠背景。这孩子当时交叉 Ercc1fl纯FVB / N / fl老鼠生产SM22背景 αCre + Ercc1fl / -小鼠基因敲除小鼠(SMC-KO) C57BL6 / FVB F1杂交背景( 22]。因此, Ercc1等位基因的基因完全灭活。同窝出生(基因型:SM22 αCre + Ercc1fl / +)被用作控制。我们也选择SM22 αCre——老鼠排除潜在Cre对血管功能的影响。

雄性和雌性老鼠被安置在单独通风笼,在12 h光/暗周期,吃正常的食物和水 随意。SMC-KO发达重量差异与WT控制在6个月时达到阈值终止实验的伦理要求欧盟指令。因此,我们决定测量心脏和血管表现型特征在12 - 13(早期的时间点:ET)和22日至23日周的年龄(晚时间点:LT),当没有明显的临床症状(体重损失除外)是很明显的。在实验结束时,小鼠安乐死深麻醉下门静脉放血。我们牺牲了老鼠14岁和25周。老鼠牺牲14岁和25周大之前被称为时间点(ET),后来时间点(LT),分别在本文中。等,总共14 SMC-KO 14 WT LT, 16 SMC-KO和21 WT被列入研究。对于每一组,男女双方都包含相当数量相等,与男女双方进行的所有方法。所有动物程序进行动物实验后,伊拉斯谟MC设施的指导方针从欧洲议会在欧盟指令2010/63 /保护动物用于科学目的。动物研究都是批准的国家动物保护委员会和地方政府在鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心。

 2.2。血压测量

血压(BP)与无创测量方法在有意识的老鼠在跨度为使用尾袖口技术(CODA大规模设备,肯特科学)。BP测量连续5天,每个会话包括30测量周期/鼠标。适应环境会议进行第一次4天,和5th天曾是主要的测量对于每一个鼠标。英国石油(BP)值报告为所有有效周期的平均记录在第五天 17]。

 2.3。体内微血管血管舒张功能<斜体> < /斜体>

我们评估 在活的有机体内使用激光多普勒血管舒张功能灌注成像(LDPI、Perimed PeriScan PIM 3系统)。反应性充血,定义为后腿仍灌注后增加临时阻塞血液流动的计算。一天在左后腿仍LDPI之前,头发是被脱毛膏。后腿仍一直还借助固定设备。记录基线灌注5分钟后,血液流动和止血带闭塞2分钟。释放止血带后,血流监测10分钟观察其返回postocclusion基线和记录充血。在所有测量,2.8%异氟烷麻醉下老鼠,体温一直在36.4 - -37.0°C的加热垫与直肠温度探头反馈。对于每一个鼠标,最大响应闭塞和曲线下的面积(AUC)相对于postocclusion基线计算。只有上述区域基线被认为是,和值低于基线被设置为0。

 2.4。血管壁的机械性能和尺寸

去除周围组织后,颈动脉移植等和LT老鼠安装在一个压力肌动描记器(丹麦肌动描记器技术(DMT)、奥尔胡斯、丹麦)calcium-free缓冲区(120年更易/ L:氯化钠,氯化钾5.9,EGTA 2, MgCl2 3.6, NaH2PO4 1.2,葡萄糖11.4,和26.3 NaHCO3;pH值7.4),因此不包括测量应变收缩和急性PDE1抑制效果(PDE1相对不活跃在Ca的缺失2 +)。颈动脉管腔内的压力的逐步增加了10毫米汞柱从0毫米汞柱和达到120毫米汞柱。每一步后,船只被允许平衡腔和血管直径测量和用于计算应变和压力 23]。

 2.5。心脏功能

小鼠镇静以4%异氟烷、气管插管和连接到压力控制呼吸机。和2.5%异氟烷麻醉维持,体温一直在37°C ( 24]。心脏几何,函数被执行评估2-D-guided极震区超音波检查发现M-mode (Vevo 770高分辨率成像系统,VisualSonics)配备了35 MHz调查。左心室(LV)内部和外部直径被跟踪,随后,心率、部分缩短,心输出量、LV质量,和LV壁厚计算使用视觉超音速心脏测量方案。心脏体积测量直径的计算假设球的形状。超声心动图进行13岁和24周的年龄在LT老鼠牺牲了,让我们获得超声心动图参数对同一种动物在两种不同的跨度为(对应于ET和LT)。完成超声心动图之后,老鼠牺牲和心灵很快被切除,在冰冷的生理盐水冲洗。随后,LV是右心室和心房解剖和LV称重和存储进行进一步的分析。

 2.6。组织学的心脏

石蜡包埋LV样本切成4 μ米部分,deparaffinized,染色确定自由壁心肌胶原含量及心肌细胞的大小。胶原蛋白含量测定用picrosirius红染色根据标准协议。图像进行了分析使用定量图像分析系统(BioPix智商软件,BioPix AB)。心肌细胞大小量化通过执行Gomori染色使用标准的协议。图像进行了分析使用定量图像分析软件(徕卡Qwin加上V3)。

 2.7。< /斜体> <斜体>体外血管功能评估

后立即牺牲的老鼠,胸主动脉和髂动脉隔绝老鼠很仔细,保存在冷Krebs-Henseleit缓冲区(更易/ L: 118年氯化钠,氯化钾4.7,CaCl22.5,MgSO41.2,KH2阿宝41.2,NaHCO325日,在蒸馏水和葡萄糖8.3;pH值7.4)。去除周围组织后,船1.5 - 2毫米长度的片段被安装在小丝肌动描记器器官浴(丹麦肌动描记器技术、奥尔胡斯、丹麦)包含6毫升Krebs-Henseleit缓冲含氧95% O2和5%的公司2在37°C。血管的张力被拉伸规范化步骤,直到90%的估计直径达到100毫米汞柱的有效的透壁的压力( 25]。此后,血管检查的可行性通过诱导宫缩30和100 L更易与氯化钾。在达到最大收缩引起的氯化钾,船只被洗4次以5分钟间隔。评估血管扩张性反应,主动脉和髂段preconstricted与30 nmol / L U46619(血栓素A2模拟)或30更易与L氯化钾,导致preconstriction与50 - 100%的回应100更易与L氯化钾。

U46619达到收缩高原后,量效曲线(crc)是由endothelium-dependent血管舒张药乙酰胆碱(ACh)累积剂量(109-10年5mol / L)。CRC的ACh完工时,endothelium-independent血管舒张药硝普酸钠(SNP, 0.1更易/ L)补充道。评估NO-cGMP途径的参与,一个段是preincubated NG-nitro-L-arginine甲酯盐(L-NAME 104mol / L),一个内皮一氧化氮合酶抑制剂。调查的角色endothelium-dependent超极化(电火花强化),小电导Ca2 +激活K+(SKCa)通道抑制剂apamin (100 nmol / L)和中间电导Ca2 +激活K+(IKCa)通道抑制剂TRAM34 (10 μmol / L)添加L-NAME之上。我们也评估NADPH氧化酶的作用——(Nox)依赖活性氧生成,同时戒指,preincubated要么没有抑制剂,apocynin(广泛氮氧化物抑制剂,104mol / L),或GSK279503(选择性Nox2抑制剂,6 μmol / L)。抑制剂有10分钟前U46619除了apocynin(30分钟)和GSK279503(60分钟)。

戒指,并行crc任何捐助者不SNP (10-11年-10年4mol / L)。环与30 preconstricted更易与L电火花强化NO-cGMP反应的氯化钾,以避免偏见。为了避免偏见的内在释放不,段与L-NAME preincubated 104mol / L添加preconstriction前20分钟。探索PDE1和PDE5的贡献,最丰富的cGMP-degrading pde VSMC [ 1),段preincubated与西地那非100 nmol / L(选择性PDE5抑制剂) 16]或lenrispodun 100 nmol / L(选择性PDE1抑制剂) 26L-NAME之上。抑制剂诱导preconstriction之前有10分钟。

 2.8。分子分析:分析血浆细胞因子水平

对小鼠血浆、蛋白质水平的il - 1 β2、il - 4、il - 6、il - 10 TNF - α和干扰素- γ测量使用V-Plex内消旋规模发现(MSD)多路现场测定小鼠神经炎症1面板。所有样本稀释的比例1:4与稀释41-provided MSD工具包。样品和标准运行重复或根据制造商的指示和一式三份分析并发现工作台软件(内消旋规模发现,马里兰州)ITCI。

 2.9。定量实时聚合酶链反应

总RNA是孤立于腹主动脉,心脏,肾脏的LT老鼠使用RNeasy迷你包(试剂盒)。互补脱氧核糖核酸合成的总RNA使用上标IV第一链合成系统(ThermoFisher科学)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸被放大了定量实时PCR QuantStudio 7 Flex实时PCR系统(应用生物系统公司)。每个反应是在重复执行TaqMan普遍掌握混合二世(应用生物系统公司)。TaqMan测定id和上下文用于探针序列 Pde1a, il - 6, Gapdh表中提到 S1。PCR循环条件50°C 2分钟,10分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。

测量mRNA的表达 Ercc1, p16, p21腹主动脉,每个反应是在重复执行SYBR绿色PCR反应混合液(英国,应用生物系统公司)。PCR循环条件50°C 2分钟,2分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。 β肌动蛋白和 Hprt1被用作家庭基因。结果不可靠的重复或融化曲线被丢弃。基因组DNA的DNA样本的相对数量确定如下:相对的 量化 = 2 − Δ Δ Ct 。感和反义老鼠引物序列表中提到 S2。

 2.10。统计方法

提出了数据的均值和标准错误的意思是,除非另有指示。统计分析两组的单个值是由未配对,双尾 t 以及。组之间的区别,这取决于变量的数量,分析了单向或双向或三方方差分析Bonferroni事后测试紧随其后。区别一般线性模型,对crc是重复措施(球形假设)。 p 值低于0.05被认为是重要的。初步分析在雄性和雌性小鼠分别进行。然而,由于改变,如果存在,发生在一个gender-independent方式(图中未显示),这是决定在雄性和雌性老鼠池所有数据。

 3所示。结果 3.1。一般健康功能

没有明显下降的迹象SMC-KO老鼠直到20岁到22周。在23到25周,小鼠表现出平均体重减少20%相比,WT老鼠(补充表 S3),牺牲根据欧盟指令的伦理要求。

 3.2。血压

血压测量显示WT之间没有显著差异,SMC-KO老鼠ET和LT,无论是在WT组和SMC-KO老鼠还是在不同的跨度为(数字 1(一)和 1 (b))。

而且舒张压和收缩压(a) (b)和功能差异皮肤再灌注后2分钟的阻塞计算曲线下面积(c)和平均最大响应(d)与WT SMC-KO ET,中尉的每一列代表相应组的动物数量。统计分析了双向方差分析差异其次是Bonferroni事后测试( ∗ p < 0.05 )。

 3.3。体内微血管血管舒张功能<斜体> < /斜体>

在等,没有显著差异在反应性充血(AUC和最大响应)之间的后肢皮肤SMC-KO和WT老鼠(数字 1 (c)和 1 (d))。在LT, SMC-KO老鼠相比,显著降低了反应性充血WT老鼠(数字 1 (c)和 1 (d))。当从ET LT,反应性充血倾向于增加WT老鼠,而倾向于减少SMC-KO老鼠。

 3.4。血管壁的机械性能和尺寸

在LT, SMC-KO老鼠显示明显拒绝媒体老鼠与WT(图 2 (b)以相似的媒体压力(数据) 2 (c)和 2 (d)),表明更高的刚度。这不是观察到(图 2(一个))。

在等应变差异(a)和LT (b)和压力差异等(c)和颈动脉的LT (d) SMC-KO与WT。统计差异一般线性模型分析了重复措施( ∗ p < 0.05 )。

 3.5。心脏功能

在SMC-KO小鼠心率较低,ET和LT(图 3(一个))。心输出量(图这也是如此 3 (c))。部分缩短显著降低在LT SMC-KO老鼠(图 3 (b))。在LT, LV壁厚SMC-KO老鼠WT老鼠(图相比小得多 3 (d)),为LV质量(图也是如此 3 (e))。然而,为LV质量没有明显差异(图 3 (e))和壁厚等(图 3 (d))与WT SMC-KO老鼠。男性和女性之间没有显著的性别差异在上述参数使用三方方差分析。

心脏功能对比WT和SMC-KO ET和LT心率(a),部分缩短(b)、心输出量(c), LV壁厚(d), LV质量(e),相对LV体重体重在LT (f), LV自由壁胶原蛋白含量(g), LT自由壁心肌细胞大小(h)。在每一列代表数量的动物数量在相应的组。统计差异分析双向方差分析后跟Bonferroni事后测试(a e)和双尾 t 以及(f-h) ( ∗ p < 0.05 )。

超声心动图软件预测SMC-KO小鼠有不同的心脏体积和重量比WT。这是证实了在测量相对LV重量(= LV重量/体重)25岁的周(图 3 (f))。天狼星红染色Gomori(补充图 S1模拟)透露,间质胶原蛋白水平升高和增加心肌细胞大小,分别在LT SMC-KO与WT老鼠(数字 3 (g)和 3 (h))。没有性别差异在两种胶原蛋白含量和心肌细胞大小使用双向方差分析。

 3.6。< /斜体> <斜体>体外血管功能评估 3.6.1。Endothelium-Dependent和SMC-KO老鼠与WT Endothelium-Independent响应

在WT与髂U46619 preconstriction值SMC-KO ET和LT 3.67 ± 0.25 vs。 3.01 ± 0.31 和 3.28 ± 0.3 vs。 2.32 ± 0.2 ,分别。在WT与主动脉U46619 preconstriction值SMC-KO ET和LT 5.58 ± 1.12 vs。 6.87 ± 0.61 和 7.71 ± 0.85 vs。 7.27 ± 0.86 ,分别。主动脉氯化钾30更易在WT / L preconstriction值与SMC-KO ET和LT 3.25 ± 0.65 vs。 3.76 ± 0.27 和 3.99 ± 0.45 vs。 3.20 ± 0.22 ,分别。在millinewton preconstriction值。

Cre重组酶表达孤独并没有改变主动脉反应ACh和SNP(补充数据 S2一个和 S2B)。相比之下,主动脉ACh响应显示SMC-KO老鼠对于跨度为下降,在LT,失去了这种反应的重要组成部分而WT同窝出生(图 4(一))。在髂动脉,观察类似的下降在LT但不是ET(补充图 S3)抑制NOS和电火花强化主动脉段显示,大多数反应ACh WT老鼠是由不,虽然电火花强化的贡献是温和(数字 4 (b)和 4 (c))。SMC-KO老鼠,电火花强化在ET已经缺席,而NO-cGMP响应显示比较健壮的下降(数字 4 (d)和 4 (e))。

血管舒张的主动脉环SMC-KO和WT老鼠跨度为应对ACh (109到105mol / L) (a)。NO-cGMP的贡献和电火花强化途径WT (b), WT LT (c), SMC-KO ET (d), SMC-KO LT (e),血管舒张的主动脉环SMC-KO和WT老鼠跨度为回应SNP (10-11年到104mol / L) (f), SNP(0.1更易/ L)后ACh CRC (g),和空调采暖(109到105mol / L)纠正SNP(0.1更易/ L) (h)。在每一列代表数量的动物数量在相应的组。统计差异分析了一般线性模型(f)和重复措施(h)和双向方差分析后跟Bonferroni事后测试(g) ( ∗ p < 0.05 )。

有减少SNP SMC-KO老鼠的反应等,进一步减少在LT与相应的WT同窝出生(图 4 (f))。当学习放松一个SNP剂量ACh CRC后,无论是在主动脉(图 4 (g))和髂环(图 S3B),同样的观察。

探索是否VSMC-dependent血管舒张的下降,我们纠正ACh nonpretreated环的响应结果SNP(0.1更易/ L) ACh CRC后管理。在主动脉和髂动脉,ACh反应SMC-KO老鼠只在LT改稿时减少了SNP(图 4 (h)和图 S3C)。

Apocynin GSK279503相对改善ACh和SNP主动脉反应LT SMC-KO老鼠(数字 5(一个), 5 (c), 5 (d))。没有影响主动脉反应LT WT鼠标环(数字 5 (b)- - - - - - 5 (d))。

血管舒张反应ACh (109到105mol / L)在主动脉环没有抑制剂或apocynin或GSK279503 WT LT (a)预孵化,SMC-KO LT (b),乙酰胆碱(10 μmol / L) Emax (c)和SNP(0.1更易/ L) Emax (d)在血管舒张反应中尉SNP (10-11年到104mol / L)在主动脉环没有抑制剂或与西地那非或lenrispodun预孵化ET (e)和LT (f)。在每一列代表数量的动物数量在相应的组。统计差异分析了一般线性模型重复措施(a)、(b)、(e)和(f)和单向方差分析Bonferroni紧随其后的事后考验(c)和(d) ( ∗ p < 0.05 )。

在主动脉环与lenrispodun预培养后,SNP的差异反应SMC-KO控制与lenrispodun ET和LT是边缘显著(等: p = 0.1 LT: p = 0.08 )。此外,苏格兰民族党SMC-KO反应是相同的与WT, ET和LT老鼠(数字 5 (e)和 5 (f))。没有这样的效果观察西地那非(数字 5 (e)和 5 (f))。无论是PDE抑制剂影响SNP反应WT老鼠在任何时间点(数据没有显示)。

 3.7。分子分析

老化期间所发生的重大变化之一是炎症的失调状态的细胞;因此,我们测量了一定的支持和抗炎细胞因子在LT SMC-KO老鼠和相应的WT ( 27]。血浆蛋白水平的il - 6和il - 10在SMC-KO LT增加与LT老鼠,和干扰素-的情况却恰恰相反 γ(数据 6(一)- - - - - - 6 (c))。没有观察到血浆il - 1的变化 β肿瘤坏死因子- α2、il - 4(数据没有显示; n = 12 WT和SMC-KO老鼠)。 il - 6信使rna表达调节心脏(图 6 (d))和肾脏(图 6 (e)),也是同样的情况 Pde1a在主动脉(图 6 (f))。 Pde1a信使rna表达的心脏和肾脏是不变的(数据没有显示; n = 12 WT和SMC-KO老鼠)。 Ercc1腹主动脉的mRNA表达显著降低SMC-KO与WT在LT(图 S4),DNA损伤反应和衰老标记 p16和 p21腹主动脉的表达显著高于SMC-KO与WT在LT(数字 S4B和 S4C)。

MSD血浆样品分析在LT WT和SMC-KO il - 6 (a),干扰素- γ(b)和il - 10 (c)。qPCR分析WT和SMC-KO il - 6在LV (d)、il - 6在肾脏(e)和腹主动脉Pde1a (f)。在每一列代表数量的动物数量在相应的组。由双尾统计的差异进行了分析 t 以及( ∗ p < 0.05 )。

 4所示。讨论

我们研究了平滑肌细胞特异性DNA修复缺陷的作用对心血管功能在一个小鼠模型与特定的损失 Ercc1在平滑肌细胞。我们发现没有BP SMC-KO和WT老鼠之间的差异也在SMC-KO小鼠在不同跨度为测试。然而,LDPI微血管灌注成像显示逐步下降等之间的反应性充血和LT SMC-KO老鼠。此外,我们评价颈动脉的力学性能,发现这两组之间的显著减少合规。另一个著名的血管老化特性SMC-KO老鼠NO-mediated减少血管舒张。后者似乎是由于,至少部分upregulation Pde1和 Nox2。这些血管的改变并没有导致血压上升暗示是一种适应性反应,最有可能的心脏。事实上,在等、心率和心脏输出较低没有收缩的心脏功能障碍,建议自主调节的适应。在LT,然而,部分缩短降低,这是与异常心脏重构,以增加胶原蛋白含量和心肌细胞大小。这样的变化,而在恶性心脏重塑。这个ageing-like表型是伴随着炎症状态的改变。未发现性别影响的变量。

我们发现了一个显著降低血管的功能 在活的有机体内通过LDPI,我们怀疑受损血管舒张反应。我们演示了在体外器官浴实验和探索底层机制。没有发现信号下降,通过减少反应没有捐赠SNP。这已经是最大的在等,没有进一步减少观察之后(图 4)。重要的是,修正ACh应对SNP没有正常化打扰endothelium-dependent反应SMC-KO老鼠WT(图的水平 4;图 S3)。这是表明内皮功能的剩余损失。的确,没有IKCa / SKCa-mediated EDH-dependent响应可以观察ET和LT SMC-KO老鼠(图 4),而另外内皮NO-mediated响应随时间减少。综上所述,SMC-KO老鼠显示电火花强化损失和减少响应没有发布的内皮细胞ET和其他中尉电火花强化机制,如BKCa或connexin-mediated效应( 28),也可能扮演一个角色。因此,进一步揭示电火花强化变化加速SMC老化模型是必要的。

减少没有信号是一个常见的特性造成的加速老化小鼠模型减少了DNA修复蛋白的功能( 1]。整个身体 Ercc1 Δ/ -老鼠的特点是减少老化的血管舒张反应的结合没有和内皮功能障碍 29日),而在endothelium-specific Ercc1KO小鼠(EC-KO),只有后者的情况( 7]。我们观察到降低血管舒张反应的VSMC在SMC-KO外生和endothelium-derived没有老鼠。

失去的没有响应SMC-KO老鼠VSMC中所有可能性表明DNA损伤导致生物利用度的下降。lenrispodun PDE1抑制剂的观察,完全恢复了SNP在主动脉(数据的反应 5)表明,失去了没有反应涉及 Pde1upregulation。主动脉 Pde1A信使rna表达数据证实了这一观点,而类似 Pde1A观察upregulation早些时候全身 Ercc1 Δ/ -老鼠和人类老龄化VSMC [ 30.]。PDE5抑制与西地那非在老鼠SMC-KO船只没有影响,反对的角色 Pde5upregulation。减少内皮没有释放可能解释的基础上,由氧自由基失活,鉴于我们发现氮抑制另外恢复的影响没有。由于选择性Nox2抑制和非选择性氧化氮抑制产生同样的效果,最可能的因素Nox2 NO-inactivating激进分子。 Nox2upregulation是一个著名的细胞因子失调的结果( 31日),证明在这个模型 il - 6upregulation可能诱发 Nox2upregulation和ROS生产。这个过程最终会导致减少没有可用性( 32]。一般在心血管老化、歌曲等人测量了炎症反应在培养主动脉血管平滑肌细胞的年龄(月16日- 18日)与年轻(2 - 4个月)老鼠nonstimulatory条件,发现小鼠表现出高度的基底il - 6岁。升高il - 6函数以自分泌的方式进一步促进VSMC的炎症反应,从而降低血管容易发生动脉粥样硬化和收缩表型( 33, 34]。

细胞因子是已知的被改变 Ercc1突变小鼠的特异性的靶细胞DNA修复的影响( 13, 35, 36]。循环il - 10在SMC-KO老鼠,被发现增加,而干扰素-传播 γ是降低了。这可能反映出一种抗炎反应增加血浆il - 6水平的反馈。干扰素- γ减少与年龄VSMC的变化一致 解剖( 37),虽然il - 10也减少了在这个模型。一个错综复杂的炎症因素一直在观察到的变化 Ercc1突变小鼠和其他DNA修复突变体。因此,细胞因子变化的具体意义是被小心,虽然一般的假设 Ercc1突变小鼠显示主要炎性表型( 38]。总之,SMC-KO炎症状态可能是参与观察的血管功能障碍,和我们目前的观测需要在将来的研究中进一步检验,这将需要开发合适的工具。

SMC-KO老鼠血压是正常的,乍一看,这是在矛盾与减少血管舒张能力。然而,心率和部分缩短,减少,心输出量下降了20%在SMC-KO平均与WT老鼠。在同等水平的两个品系小鼠血管阻力,这将转化为20%的降低血压SMC-KO老鼠( 血 压力 = 心脏 输出 × 血管 电阻 )。然而,血压是相同的菌株。向后推理如何转化为血管阻力,Hagen-Poiseuille方程可以应用。压力或流量的改变与血管长度、血液粘度和半径4。船长度和血液粘度是相似的和血流量(=心输出量)降低了20%,血管直径SMC-KO应该平均的0.95 x WT老鼠。因为这需要血管收缩状态相对于WT, SMC-KO可以维持正常血压,尽管强烈降低血管舒张能力,例如,通过减少交感神经激素的输入。心输出量减少,如果因为这种监管(或由于病理重塑或两者的结合),因此适应SMC-KO老鼠血压正常化。的血管,il - 6增加可能参与心脏的变化。有趣的是,特il - 6等人在老鼠注入导致同心LV重塑,显著增加胶原蛋白体积分数和相对增加心肌细胞的宽度和长度都是独立于血压的变化( 39]。尽管装修,没有观察到明显的心脏衰竭SMC-KO老鼠。似乎除了病理重构,适应血流动力学功能的神经激素的机制占观察血流动力学变化。然而,心力衰竭等表型的可能性不能排除,需要进一步调查。

总之,SMC-KO小鼠显示出进步衰老表型耐药和动脉导管。的变化引起的DNA损伤可能是限于VSMC,虽然看起来功能障碍在VSMC最终影响电子商务功能,影响生物利用度的endothelium-derived没有通过Nox2-mediated ROS生产。PDE1抑制恢复血管舒张功能,而PDE5似乎扮演一个次要角色发展VSMC功能障碍。作为一个未来的角度来看,它可能会感兴趣的研究慢性PDE1特定抑制剂治疗的影响发展的血管功能障碍,炎症,和心脏重塑。目前,lenrispodun正在临床开发治疗神经退行性疾病和已被证明是一个安全的和耐受药物在心脏衰竭患者 40]。

 数据可用性

数据请求。

 的利益冲突

苏菲Dutheil Suman Chalgeri, Lei,艾米林,罗伯特·E·戴维斯和格雷琴L斯奈德员工细胞疗法Inc .的纽约,美国

 作者的贡献

•Ataei Ataabadi和Keivan Golshiri同样起到了推波助澜的作用。

 确认

我们感谢Ilona Krabbendam-Peters她技术支持。这项工作已经从左支持格兰特Lijf en利文湖项目60和Technologie en Kennis Instituut-Life科学和健康荷兰项目从细胞内EMCLSH 19 - 0913和格兰特疗法Inc .纽约A.J.M.后撤。

 补充材料

补充1。表S1: TaqMan ID用于分析和调查背景序列 Pde1a, il - 6, GapdhqPCR测量。表S2:感觉和反义序列的引物 p16, p21, Ercc1, β肌动蛋白, Hprt1qPCR测量。补充2。表S3:体重SMC-KO和WT老鼠按年龄和性别分层。补充3。图S1:胶原蛋白染色的照片为WT (A)和SMC-KO (B)和心肌细胞染色WT (C)和SMC-KO中尉补充4 (D)。图S2:血管舒张反应ACh (109到105mol / L (A)和SNP (10)-11年到104mol / L) (B)在主动脉瓣环和不使用Cre WT老鼠。统计差异分析了一般线性模型重复措施。补充5。图S3:血管舒张反应ACh (109到105mol / L) (A), SNP(0.1更易/ L)课时(B)后,和空调采暖(109到105mol / L)纠正SNP(0.1更易/ L)髂SMC-KO环和WT跨度为老鼠。动物的数量在每一列表示在相应的组。统计差异分析了一般线性模型重复措施A和C和双向方差分析其次是Bonferroni事后测试B ( ∗ p < 0.05 )。补充6。图S4: qPCR分析WT、腹主动脉SMC-KO LT Ercc1(一), p16(B) p21(C),在每一列代表的动物数量在相应的组。由双尾统计的差异进行了分析 t 以及( ∗ p < 0.05 )。

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