在慢性肾脏疾病(CKD)氧化应激发生频繁,提出了中央机制在慢性肾病进展和慢性肾病的发病机制相关的并发症和死亡率( 1]。特别是透析病人表现出更高的死亡率和心血管死亡率透析患者治疗与一般人群相比,高出10到20倍( 2]。氧化应激描述之间的不平衡形成的活性氧物种,如超氧化物阴离子和氢过氧化物,和抗氧化防御系统 3]。增加活性氧的生产由于炎症或抗氧化能力下降导致脂质过氧化反应和氧化蛋白质,碳水化合物和氨基酸( 4]。活性氧是正常的细胞代谢的副产品( 5]。据估计,1 - 3%的氧气消耗减少线粒体活性氧,如超氧化物阴离子one-electron-reduction生成的分子氧( 6, 7]。超氧化物歧化酶(SOD)催化歧化作用的超氧化物阴离子氧气和过氧化氢,从而代表了主要的抗氧化防御机制( 8]。超氧化物歧化酶在哺乳动物中,不同亚型存在:超氧化物歧化酶1 (SOD1,胞质铜-锌超氧化物歧化酶)、超氧化物歧化酶2,超氧化物歧化酶3 (SOD3,细胞外的铜-锌超氧化物歧化酶)(用于审查看到Fukai Ushio-Fukai [ 9])。超氧化物歧化酶2 (SOD2、锰超氧化物歧化酶)是三个亚型之一,位于线粒体( 10]。

早期研究与突变体小鼠模型显示,线粒体(SOD2的重要性 11, 12]。老鼠突变纯合子(Sod−−)完全丧失SOD2蛋白质进一步导致损伤的线粒体酶之后,死亡的动物出生后1到20天。杂合的Sod2 + /−老鼠显示增加氧化应激( 12]。

在慢性肾脏疾病中,对比结果对SOD2酶被报道。在尿毒症鼠模型Lim等人发现减少SOD2蛋白质含量在肝脏雀等人发现增加SOD2肾脏蛋白质( 13, 14]。在人类CKD SOD2的研究到目前为止有限外周白细胞基因表达分析。秋山等人没有发现显著差异SOD2的基因表达之间的健康受试者和慢性肾病或慢性肾病患者和血液透析治疗而Zaza公司等人报道15腹膜透析病人SOD2的基因表达明显高于健康对照组( 15, 16]。人类CKD SOD2蛋白质分析以及死亡率分析与SOD2缺乏蛋白质含量。

因此我们调查SOD2 CKD患者的蛋白质含量和基因表达和分析血液透析治疗患者生存率在CKD阶段5与SOD2的蛋白质。

慢性肾脏疾病患者共有81个连续第五阶段进行维护血液透析120例慢性肾病阶段1 - 5没有血液透析治疗,和13个健康的对照组进行调查。书面知情同意得到每个主体和道德是由当地伦理委员会批准。血液透析患者透析4 - 5小时每周3次使用可以使膜的生物相容性。血液透析患者的血样在血液透析会话的开始。

我们研究了从外周血单核细胞,这些细胞在慢性肾病患者的特殊利益团体。monocyte-macrophage血统参与不同的致病过程在CKD:系统性炎症( 17),血管疾病和动脉粥样硬化 18- - - - - - 21),肾损伤( 22),和免疫功能受损 23]。血液单核细胞分离得到肝素化使用超顺磁的聚苯乙烯珠涂上一个主要CD14膜抗原的单克隆抗体特定(表达载体DYNAL,挪威),洗几次汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院)。

供免疫印迹蛋白质分析单核细胞细胞溶解在缓冲均化(含50更易与L Tris-HCl, pH值8;100更易与L氯化钠,100更易/ L β巯基乙醇,50 L更易与氟化钠,2 L更易与乙二胺四乙酸,完成迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏诊断;德国));蛋白质分离12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)在150 V 90分钟,转移到纯硝化纤维素膜(Biorad;美国)。膜与奥德赛阻断缓冲区被封锁(Licor生物科学;美国)和孵化主要抗体超氧化物歧化酶2 (SOD2)和beta-actin (Abcam)。与哈佛商学院洗涤后,细胞膜和Alexa Fluor680-allophycocyanin-fluorescence-labelled孵化(美国MoBiTec)或IRDye800CW-infrared荧光dye-labelled (biomol、德国)二级抗体。成像是使用《奥德赛》执行红外成像系统(Licor生物科学;美国)在700 nm和800 nm发射的激发波长680 nm和780 nm,分别。我们的实验证实使用SOD2的特异性和beta-actin人类单核细胞抗体。

检测硝基酪氨酸的奥德赛的膜被封锁阻止缓冲区(Licor生物科学;美国)和孵化主要抗体硝基酪氨酸(Chemicon,微孔;美国)。与哈佛商学院洗后,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated anti-rabbit二级抗体(DakoCytomation;丹麦)。可视化进行了使用ECL化学发光系统(美国Amersham)。

量化SOD2的蛋白质含量我们最近表现西方化验的单核细胞- sensing被我们组( 24]。不同的方法提供了一种测量和转译后的修改和nonmodified形式的蛋白质(蛋白质物种)与主要的抗体能被探测到的。我们已经证明了这一概念在一个出版大约超氧化物歧化酶(SOD1)蛋白质的物种,我们调查SOD1 CKD患者单核细胞的蛋白质含量与二维凝胶电泳。后者表明我们SOD1西部- sensing蛋白质含量测定和分析覆盖至少6 SOD1蛋白质种类( 25]。

人类单核细胞在96孔板permeabilized Triton X100 coincubated和主SOD2抗体和beta-actin (Abcam) 2小时。清洗步骤之后,单核细胞与相应的二次抗体coincubated为1小时(见下文)。成像是在700 nm和800 nm发射的激发波长680 nm和780 nm。SOD2的蛋白质含量总是规范化beta-actin蛋白质含量相同的细胞。控制实验没有孵化的主要抗体。

激活和抑制实验phorbol-myristate-acetate (PMA、Sigma-Aldrich最终浓度100 ng / mL)和4-hydroxy-2, 2, 6日6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (Tempol Sigma-Aldrich,最终浓度100 μ米)(孵化时间3小时)。

RNA隔离、转录和定量实时PCR进行根据制造商的描述(高纯RNA隔离设备,Transcriptor第一链cDNA合成装备,LightCycler®由于“快速上手”项目DNA MasterPlus SYBR绿色我工具包;罗氏公司;德国)。以下使用实时PCR引物:

SOD2 / NM_000636:

我们研究了超氧化物歧化酶2 (SOD2)蛋白在单核细胞从慢性肾脏疾病(CKD)患者和健康对照组使用西方- sensing化验(主题特征表 1)。首先,SOD2的特异性和beta-actin抗体用于我们的实验被西方墨点法(图所示 1(一))。我们演示了SOD2 beta-actin蛋白质检测单核细胞21 kDa的分子量和41 kDa。图 1 (b)显示代表西方SOD2的化验和beta-actin蛋白质- sensing单核细胞从健康控制主题,CKD患者,血液透析病人为每个主题)(一式四份的决心。

接下来,SOD2所有CKD患者的蛋白质含量进行了分析阶段,血液透析治疗患者和健康对照组。图 2显示了SOD2的汇总数据蛋白质含量与肾小球滤过率下降,直到CKD下降阶段4。相比之下,CKD患者第五阶段没有和血液透析治疗然后再显示SOD2蛋白质含量更高,这样一个j型模式的结果。克鲁斯卡尔-沃利斯分析显示明显不同分布SOD2的所有组之间的蛋白质含量( p < 0.002 )。

除了蛋白质含量的量化,我们调查了SOD2的基因表达在单核细胞从血液透析患者中,慢性肾病患者和健康对照组。数据 3(一个)和 3 (b)呈现典型的放大和融化曲线SOD2 mRNA和管家基因beta-actin mRNA的血液透析病人,慢性肾病患者和控制问题。PCR产品也在1.0%琼脂糖凝胶和大小分级由溴化乙锭染色(图 3 (c))。SOD2 mRNA表达水平的CKD患者和健康对照组图所示 4。相对SOD2 beta-actin基因表达在单核细胞表达率。虽然似乎是一种趋势SOD2的基因表达增加从病人健康的慢性肾病阶段4克鲁斯卡尔-沃利斯的分析并没有显示出显著差异分布之间的SOD2的基因表达组( p = 0.10 )。

因为我们没有检测SOD2的基因表达的变化,解释了SOD2蛋白质含量的差异,我们发现我们调查的影响增加细胞过氧化物生产SOD2单核细胞中蛋白质含量。刺激细胞过氧化物的产生单核细胞对PMA的存在和缺乏SOD-mimetic Tempol。图 5显示变化SOD2蛋白在细胞和PMA有无Tempol孵化。SOD2的细胞的蛋白质含量在基线(1.00(0.98 - -1.02))降低孵化后PMA (0.82 (0.77 - -0.86); n = 8 )而增加Tempol SOD2蛋白质含量明显增加(1.22 (1.02 - -1.44; n = 6 );每一个 p < 0.01 )。

我们还进行了sds - page及免疫印迹分析搜索硝基酪氨酸修改SOD2蛋白质在健康受试者(H)和慢性肾病阶段4 (CKD)和慢性肾病阶段5 HD(高清)患者。没有蛋白质染色预期SOD2的乐队是anti-nitrotyrosine检测到的抗体(补充图1 (C)在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2016/7423249)。

最后,我们之间的关系很感兴趣SOD2的单核细胞蛋白质含量CKD第五阶段患者血液透析治疗和全因死亡率。我们把患者分为一组与下面SOD2蛋白质和一群SOD2蛋白质高于中位数(SOD2 /β-肌动蛋白的蛋白质= 42.54)。表 2显示了一个比较这两个病人的临床参数组。显示在图 6生存明显好于SOD2蛋白质含量较低的血液透析患者外周血单核细胞(x平方分布,6.25; p < 0.05 生存率较)。

我们调查了SOD2的基因表达和蛋白质含量在CKD患者单核细胞。据说在血液透析患者,人口与原因以及心血管病死亡率高,我们分析了SOD2蛋白质含量和死亡率之间的关系。我们研究的主要发现如下:( 1 )SOD2蛋白质含量显示曲线模式与健康对照组相比显著降低值,逐步减少,直到CKD第四阶段之后再次被高SOD2 CKD阶段5中蛋白质含量和血液透析患者治疗。( 2 SOD2的基因表达没有明显不同的两组之间。( 3 )高于中位数SOD2蛋白质含量与血液透析治疗患者的死亡率更高。

同时,结果在蛋白质含量和SOD2的基因表达在我们的研究中,是很有趣的。在早期研究中我们组调查的基因表达和蛋白质含量(SOD1)单核细胞胞质超氧化物歧化酶对碘氧基苯甲醚的CKD患者。SOD2相比,SOD1蛋白在CKD显示减少血液透析治疗患者的蛋白质含量最低;在CKD SOD1基因表达增加,血液透析患者高的意义( 25]。这些结果支持的文学。在血液透析患者外周血单核细胞健康对照组相比显著增加SOD1 mRNA的报道而SOD2信使rna从控制之间没有显著性差异 15]。杆的不同基因表达在慢性肾病可以解释SOD1之间的多个不同的基因调控和SOD2(审查看到苗和圣克莱尔 26])。关于减少SOD2蛋白质含量在CKD阶段3和4在我们目前的研究文献提出不同的解释。两个因素在CKD有助于增强蛋白质的降解:氧化应激和尿毒症。氧化改性SOD2的蛋白质被描述。我们自己的免疫印迹分析并没有建议酪氨酸硝化SOD2的CKD虽然提炼分析需要SOD2蛋白质的质谱分析从CKD患者和健康者。有些作者使用重组SOD2显示蛋白质酪氨酸硝化和过氧亚硝基酪氨酸氧化在治疗( 27)、蛋白质的生化分析SOD2成神经管细胞瘤细胞的蛋白质种类显示氧化色氨酸和组氨酸氧化但没有酪氨酸硝化( 28]。因此,有必要分析氧化SOD2修改为每个单独致病条件。进一步的见解可以通过相邻SOD2的分析揭示蛋白质降解和SOD2酶活性。

自己在当前研究结果指向一个活性氧参与SOD2蛋白质含量的规定,因为我们观察SOD2的PMA-induced减少蛋白质在单核细胞可以被治疗SOD-mimetic Tempol。此外,增加SOD2蛋白质降解在尿毒症的环境中可能涉及。ubiquitin-proteasomal SOD2蛋白质是退化的途径( 29日]。通过ubiquitin-proteasomal CKD蛋白质降解途径是增强 30., 31日]。一般来说,蛋白质转译后的修改以SOD2从其他细胞类型也应考虑单核细胞。这些都是酪氨酸硝化和酪氨酸氧化 27色氨酸、组氨酸和氧化( 28),乙酰化作用(审查看到邹et al。 32]),和泛素化 29日]。

众多的研究表明,基因表达之间的相关性,通过信使核糖核酸(mRNA)量化分析和量化的蛋白质含量通常是有限的审查(参见[ 33, 34])。专门为蛋白质含量的变化,但不变的mRNA水平翻译或监管的监管变化的蛋白质降解可以潜在机制。

描述了下列条件例如:mRNA水平降低但恒定的蛋白质含量( 35),常数mRNA水平而减少蛋白质含量由于增加蛋白质降解[ 36),和不断的mRNA水平但是增加蛋白质含量由于减少蛋白质降解[ 37]。此外,我们的小组显示,单核细胞超氧化物歧化酶1慢性肾脏疾病患者增加mRNA水平与降低超氧化物歧化酶1蛋白质含量[ 25]。

SOD2蛋白质的机制增加先进CKD (CKD5和没有血液透析)相比,CKD 3和4,我们观察到,导致j形SOD2的蛋白质含量都不知道。在这方面的兴趣,upregulation SOD2的蛋白质,在尿毒症的老鼠可以逆转的维生素D受体受体激动剂( 14]。由于先进的尿毒症是1的状态,缺乏25-dihydroxyvitamin D还缺乏维生素D受体和功能障碍,维生素D受体相关尿毒症效果可能参与了j形SOD2的蛋白质,我们观察到的 38]。

最后,我们观察到一个更好的生存在血液透析患者SOD2蛋白质含量低于中位数的患者组相比与SOD高于中位数。观测的基本机制是未知的,但考虑上面的讨论与维生素D代谢蛋白质较高含量的SOD2的协会更严重的尿毒症扰动的维生素D受体信号转导可能参与其中。

在未来的实验中有必要识别潜在SOD2蛋白质修改使用2 DE,质谱仪和免疫印迹。

综上所述,我们的研究显示显著变化SOD2的蛋白质含量与肾功能损害程度增加。我们还证明,符合我们自己的先前的研究还有许多其他团体,在clinical-experimental基因表达和蛋白质的研究一个平行的调查内容是必不可少的。最后,我们提供的第一份报告SOD2蛋白质含量及其与生存在CKD患者血液透析治疗。