OMCL 氧化医学和细胞寿命 1942 - 0994 1942 - 0900 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/1594616 1594616 研究文章 的潜在的健康益处Polyphenol-Rich提取物 Cichorium intybusl . Caco-2细胞模型研究 Azzini 埃琳娜 1 Maiani 朱塞佩 1 Garaguso 伊凡娜 1 Polito 安琪拉 1 Foddai 玛丽亚。 1 Venneria 尤金尼亚 1 都拉佐 亚历山德拉 1 Intorre Federica 1 Palomba 劳拉 1 Rauseo 玛丽亚L。 1 Lombardi-Boccia Ginevra 1 Nobili 法比奥 1 Drummen 格雷戈尔 农业研究理事会和经济学(克雷亚) 食品和营养研究中心,通过Ardeatina 546、00178罗马 意大利 2016年 29日 12 2015年 2016年 07年 09年 2015年 28 10 2015年 28 10 2015年 2016年 版权©2016 Elena Azzini et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

植物化学物质没有到达体循环可以发挥他们的生物活性;几乎到达大肠吸收抗氧化剂可能导致保护氧化损害肠胃疾病。在目前的工作中,我们旨在研究潜在polyphenol-rich提取物活性之间的关系 Cichorium intybusl . Caco-2细胞形态特征的变化。植物化学物质含量(类胡萝卜素和黄酮类化合物)和总抗氧化活性红菊苣的特雷维索和杂色菊苣Castelfranco进行评估。polyphenol-rich菊苣提取物的生物活性进行了研究 在体外Caco-2单层细胞模型。形态特征的变化来测试抗氧化和/或prooxidant效果验证了组织学分析和韵律节奏的电子显微镜(SEM)观察到。Caco-2细胞模型,从菊苣表示温和的抗氧化多酚分数的行为直到17 μM浓度,而70年 μM和34 μ米特雷维索的起到细胞毒性作用和Castelfranco菊苣,分别强调了te减少,渗透率增加,上皮的改变。我们的研究结果支持这些产品的有利影响抵消氧化应激和细胞损伤,诱导 在体外Caco-2细胞模型,通过glycocalyx与粘多糖复合物的交互,维护 在活的有机体内一个健康的和有效的肠道屏障。

 1。介绍

菊苣,植物属典型的地中海地区,原产于欧洲、西亚、北美和它的颜色从白色到红色( 1]。特雷维索的“红菊苣”和“杂色Castelfranco菊苣,”PGI根据欧盟规定,息息相关,他们的领土,根据传统的栽培技术。这些产品获得了极大的兴趣对他们的感官和营养特征。众所周知,植物化学物质的消费水果和蔬菜可以改善一些慢性退行性疾病的预防 2, 3]。植物化学物质内容可能受到几个因素的影响:遗传特点,环境方面,农艺实践和水分条件( 4, 5]。遗传因素对营养和植物化学物质内容,发挥巨大的影响和在蔬菜物种之间。气候条件、曝光量、温度、相对湿度和发光强度是特定参数,影响食品质量。特别是,选择一个适当的农艺实践可以提高水平和生物活性化合物的形象。植物作物中,红菊苣是有吸引力的,因为他们可能是生的还是熟的消耗。特别是,它们通常在沙拉生吃冬季当大多数蔬菜都不是上市的季节。事实上,红菊苣特别耐低温( 6全年)和他们的可用性是一个重要的微量营养素来源在最冷的季节。红色的颜色在很大程度上是由于水溶性色素,花青素,但一些作品展示的红叶品种 Cichorium intybusl .绿叶蔬菜中多酚含量最高,消耗原料( 7, 8]。农业生产的植物化学物质含量的变化在我们的饮食尤为重要。生物活性化合物的食物,如维生素、类胡萝卜素和多酚,似乎能够调节一个或多个代谢过程,在促进更好的健康结果( 9]。最接受的解释对于食物的保护作用可能源于观察,不同植物植物化学物质可以作为自由基的“拾荒者”,“饮料”单线态氧,或金属螯合剂( 10, 11),因此诱导氧化损伤防护通过抗菌,抗炎,王亚南,抗癌的,血管扩张的行动。

最近,D 'Evoli et al。 12]表明,高水平的抗氧化剂花青素在红菊苣施加直接对活性氧清除作用形成的抗氧化剂和cytoprotective活动以及抗增殖活动Caco-2细胞。在目前的工作中,我们旨在研究潜在的polyphenol-rich活动之间的关系从菊苣提取物,形态和化学/物理Caco-2细胞的变化。这个目的,生物活性化合物的内容(类胡萝卜素和黄酮类化合物)和总抗氧化活性评价早期和晚期红菊苣的特雷维索和菊苣的Castelfranco组合成的斑叶。此外,从菊苣polyphenol-rich提取物的生物活性 在体外Caco-2细胞单层模型进行了研究。形态特征的变化来测试抗氧化和/或prooxidant效果验证了组织学分析和韵律节奏的电子显微镜(SEM)观察到。

 2。材料和方法 2.1。试剂

溶剂都从卡洛Erba购买(意大利米兰),BDH(英国Poole),和默克(达姆施塔特,德国)。2、4、6-Tri (2-pyridyl) -s-triazine (TPTZ)与丙烯酰胺(瑞士)。磷酸盐(PBS) 6-hydroxy-2 5 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic酸(Trolox)和抗坏血酸是由Sigma-Aldrich Srl提供。商业标准也从Sigma-Aldrich Srl(意大利米兰)。AAPH (2, 2′, -azobis (2-amidinopropane)盐酸盐)(韦科化学。,Richmond, VA, USA) was used as a source of hydrophilic radicals. Double distilled water (Millipore, Milan, Italy) was used throughout the study.

 2.2。<斜体> Cichorium intybus < /斜体> L。

红菊苣的特雷维索(两种情况:一种是早期和晚期)生长在这个地区的样本包括Quinto(特雷维索),零布兰科(特雷维索)和Scorze(威尼斯),而PGI杂色菊苣Castelfranco来自样品由于Carrare(帕多瓦),米拉(威尼斯),Monselice(帕多瓦)。5公斤的总重量为每个位置收集每个品种在收获时间和交付给实验室。唯一的可食用部分是用于分析样品,按照下列方法。

 2.3。分析方法

提取的黄酮类化合物(槲皮素、山柰酚、和芹黄素)被执行所述Hertog et al。 13)和定量分析通过system-ESA高效液相色谱电化学检测器据Azzini et al。( 14]。类胡萝卜素提取从特雷维索和Castelfranco菊苣根据沙普利斯描述的方法et al。 15]。样本量化,分析了高压液相色谱(HPLC)据Maiani et al。 16]。总抗氧化能力(TAC)使用两种不同的分析评估:铁降低抗氧化能力(收紧)[ 17)和Trolox等效抗氧化能力(问题)方法( 18, 19]。每一个分析的结果已经在一式三份。

 2.4。Transepithelial电阻(te)评估

te的评价,多酚红菊苣的分数特雷维索和杂色菊苣Castelfranco水解提取在Caco-2细胞单层膜上研究了测试的变化紧密连接(TJ)渗透率通过三通,酚红通道,组织学分析。

细胞治疗是提高浓度两个多酚提取物(0.2,1.3,10日,17日,34岁的70人 μ米),180分钟,来模拟 在活的有机体内生理过程。transepithelial势和酚红渗透率的变化记录时间间隔(30′)。在实验中,细胞被播种到聚碳酸酯过滤细胞培养箱插入(直径6.5毫米,面积0.33厘米2,孔隙直径0.4 μ米),密度1.5·105细胞/过滤和放置在一个多井猎鹰。过滤器将商会分成两部分,顶端和基底,代表了腔和胃肠的底面积的系统。两院,te评估紧密连接的渗透率测量是使用Millicell人执行器(美国微孔,贝德福德,MA)根据制造商的指示。校准后的阻力系统,单层的电阻测量通过将一个电极两侧的聚碳酸酯过滤器( 20., 21]。每一个分析的结果一式三份并表示为欧姆×厘米2。

在15 - 20天内达到融合细胞和分化。在这段时间里,细胞形态学Leitz则是监测和检查Diavert倒置光学显微镜。

 2.5。组织学分析

细胞单层分离过滤和固定在一起Bouin(苦味酸组成的水溶液中,乙酸,和甲醛)大约12小时,然后使用酒精脱水提升规模(70%,80%,90%,95%,100%),最后是封装在环氧树脂的聚合块(GMA, J134K polyscience Inc .沃灵顿,PA,美国)。然后,样本粘在嵌入式存根和切成3 μm部分与微米旋转式切片机(德国蔡司)适当的组装,使用水晶叶片据拉尔夫的修改 22, 23]。部分粘在显微镜载玻片都沾染了哈里斯的苏木精和伊红 24, 25]。准备工作就绪永久与封面和滑动密封树脂(BDA Eukitt安装介质,实验室供应池,英格兰)。所有部分(3 μ22米)进行的组织学变化Diaplan光学显微镜Leitz则(德国),如图 1。所有图片(缩微摄影)的放大356倍,与徕卡显微镜进行Dialux 22。

代表测定梯度数组polyphenol-rich提取物的色谱分析在特定条件下从红菊苣的特雷维索和组合Castelfranco提取物。

 2.6。扫描电镜分析

在每个实验(180分钟),12小时的细胞单层固定甲醛(10%)和戊二醛(2.5%),然后用酒精干的解决方案。然后,样本被临界点干燥脱水(Emitech K850,群体技术,西萨塞克斯郡,英国)。最后的脱水是实现有限公司2。最后,样品与120年代黄金30 mA气急败坏的在修改的气氛中有2%氩和分析使用SEM (EVO LS10,卡尔蔡司显微镜GmbH,耶拿,德国)。

 2.7。统计数据

结果表示为平均数±标准差。统计数据分析使用方差分析测试Bonferroni事后考验(意义紧随其后 P < 0.05)。

 3所示。结果 3.1。植物化学的描述

据几位作者,黄酮类成分可以作为潜在的标记分析草药和植物供人类食用的 26- - - - - - 28]。

对黄酮类化合物的定量分析(免费+共轭形式),图 1显示数组代表HPLC-DAD梯度色谱,而他们识别报告在表 1。不同的类黄酮含量在不同的品种和种植地点是总结表 2。比较生长地点,类黄酮含量没有明显差异,而品种之间的显著差异都被记录下来。槲皮素被发现是最丰富的黄酮类红色的萝卜特雷维索品种(90.04±25.16毫克/公斤和97.88±33.94毫克/公斤,分别地。,在末和红菊苣)对早期的杂色菊苣Castelfranco(14.20±4.51毫克/公斤)。

类黄酮鉴别从特雷维索的红菊苣和杂色菊苣Castelfranco提取物。

峰值分析物 红菊苣的特雷维索 组合成的菊苣Castelfranco
RT(分钟) 主要通道高度 率的准确性 RT(分钟) 主要通道高度 率的准确性
槲皮素 51.26 637 nA 0.925 51.19 22.7 nA 0.947
山柰酚 53.28 174 nA 0.800 53.13 123 nA 0.807
芹黄素 55.61 37.3 nA 55.52 36.4 nA

类黄酮含量在不同品种的生长位置(毫克/公斤)。

槲皮素(毫克/公斤) 山柰酚(毫克/公斤) 芹黄素(毫克/公斤)
晚红菊苣的特雷维索
零布兰科 83.92±15.08 21.43±2.19 2.10±0.61
Scorze 95.89±26.51 26.23±10.48 3.24±0.82
Quinto 90.31±33.9 20.94±4.86 3.05±1.12
90.04±25.16 一个 22.80±5.84 一个 2.80±0.85
早期的红菊苣的特雷维索
零布兰科 101.50±40.20 14.42±8.40 3.98±1.81
Scorze 100.23±42.4 14.51±9.80 1.51±0.80
Quinto 91.89±29.22 8.11±5.38 2.30±1.60
97.88±33.94 一个 12.35±7.65 b 2.60±1.40
组合成的菊苣Castelfranco
Monselice 15.32±3.54 8.68±2.16 3.33±0.44
米拉 14.47±4.92 13.5±3.81 3.78±0.38
由于Carrare 12.8±5.08 13.21±4.97 3.62±0.05
14.20±4.51 b 11.80±3.64 b 3.58±0.29

方差分析: P < 0.05 a和b所列。

山柰酚明显不同的品种和品种。其内容在红菊苣的特雷维索(22.80±5.84毫克/公斤)多样性明显高于( P < 0.05)比较早期红菊苣的特雷维索(12.35±7.65毫克/公斤),组合成的菊苣Castelfranco(11.80±3.64毫克/公斤)。

芹黄素含量没有明显差异之间的品种和生产区域的平均范围从2.60±1.40,3.58±0.29毫克/公斤,分别对早期红菊苣的特雷维索和菊苣的Castelfranco组合成的斑叶。

我们的数据(表 3)表明,叶黄素和 β胡萝卜素是主要的类胡萝卜素(从1.19±0.24,2.40±0.61毫克/公斤和0.19±0.02,0.48±0.15毫克/公斤,职责)。一个显著差异( P < 0.05)之间是存在的 β胡萝卜素含量的红菊苣的特雷维索(0.38±0.08毫克/公斤)和早期红菊苣的特雷维索(0.22±0.04毫克/公斤)。菊苣Castelfranco显示平均的组合成的斑叶 β胡萝卜素含量等于0.35±0.14毫克/公斤。特雷维索的初红菊苣,意思是叶黄素含量水平明显高于2.16±0.28毫克/公斤( P < 0.05)比晚红菊苣的特雷维索(1.27±0.20毫克/ 100克)和杂色菊苣Castelfranco(1.20±0.27毫克/ 100克)。

类胡萝卜素(叶黄素和 β 胡萝卜素)意味着值(毫克/公斤)的不同品种 Chicorium intybusl和生产区域。

叶黄素(毫克/公斤) β-胡萝卜素(毫克/公斤)
晚红菊苣的特雷维索
零布兰科 1.27±0.17 0.27±0.06
Scorze 1.19±0.24 0.20±0.01
Quinto 1.41±0.07 0.19±0.02
1.27±0.20 b 0.22±0.04 b
早期的红菊苣的特雷维索
零布兰科 2.12±0.89 0.45±0.02
Scorze 1.97±0.11 0.35±0.01
Quinto 2.40±0.61 0.34±0.09
2.16±0.28 一个 0.38±0.08 一个
组合成的菊苣Castelfranco
Monselice 1.28±0.13 0.48±0.15
米拉 1.26±0.36 0.35±0.11
由于Carrare 1.07±0.4 0.23±0.01
1.20±0.27 b 0.35±0.14 ab

方差分析: P < 0.05 a和b所列。

评估个人抗氧化剂的内容后,合作行动的不同标本的生物活性分子 Cichorium intybusl .由总抗氧化能力(TAC)评估。图 2展示了各种抗氧化剂的协同作用来衡量收紧(更易/公斤)和问题(更易trolox /公斤)的方法。

总抗氧化能力:收紧(更易/公斤)和问题(更易trolox /公斤)值的不同品种 Cichorium intybusl

我们的研究结果强调了收紧值最高的红和红菊苣的特雷维索对杂色菊苣Castelfranco(11.70±1.92更易/公斤和9.93±3.11更易/公斤和8.76±4.46更易/公斤,职责)。没有差异的品种和生产区域出现在收紧(更易trolox /公斤)的结果。

显著差异存在的问题(更易trolox /公斤)的水平。问题的值晚红菊苣的特雷维索(4.54±0.88更易trolox /公斤)和早期红菊苣的特雷维索(5.32±1.76更易trolox /公斤)高( P < 0.05)相比,组合成的菊苣Castelfranco(2.12±0.74更易trolox /公斤)。

 3.2。基于单元的化验

不同于其他食物成分,植物化学物质可以发挥其生物活性没有到达体循环。几乎到达大肠吸收抗氧化剂可能导致保护氧化损害胃肠疾病( 29日]。有几个报告菊苣的药理作用和抗炎作用 30., 31日]。

三通测量通常用于描述单层完整性的细胞单层渗透实验,或量化渗透率的变化,例如,由于paracellular渗透增强剂( 32, 33]。

利用多酚分数从红色特雷维索和Castelfranco菊苣,套磁导率的变化进行了测试在单层膜文化Caco-2细胞系。三通增加酚浓度测量数据所示 3(一个)和 3 (b)分别对特雷维索红菊苣和菊苣的Castelfranco组合成的斑叶。

te的变化在不同浓度的多酚提取:(a)红菊苣的特雷维索(RT)和(b)组合成的菊苣Castelfranco (VC)多酚提取。

在治疗红菊苣的特雷维索和杂色菊苣Castelfranco多酚的提取、表示通过三通值,结果显示一个单层均衡模型(健康的单层细胞)0.2 - -1.3 - 17 μ米提取物浓度。直到17 μ米多酚提取物浓度,te测量伸出一个高原,表明套的紧张和缺乏直接上皮Caco-2细胞之间的相互作用和菊苣提取物经组织学分析。数据 4(一)和 4 (b)显示17 μM影响治疗。突出显示的扫描电镜超微结构的细胞学分析和证实缺乏形态变化或提取活动细胞单层(数字 5(一个)和 5 (b))。

组织学分析(a)和扫描电子显微图正常Caco-2的(b) 模式处理多酚提取的特雷维索红(17 μ米)。

组织学分析(a)和扫描电子显微图正常Caco-2的(b) 模式处理多酚提取的杂色菊苣Castelfranco (17 μ米)。

70年的浓度 μM和34 μ米高毒性,分别为特雷维索和Castelfranco菊苣提取物进行测试。这些治疗方法产生降低t值(数据 3(一个)和 3 (b)),突出了渗透率的增加套(酚红)和上皮的改变。这些浓度促进Caco-2细胞坏死细胞单层组织学分析和扫描电镜观察证实了所示(数字 6(一), 6 (b)和 7(一), 7 (b)特雷维索的Castelfranco菊苣,职责)。

组织学分析(a)和扫描电子显微图显示Caco-2坏死(b) 模式在治疗多酚提取:特雷维索红提取(70 μ米)。

组织学分析(a)和扫描电子显微图显示Caco-2坏死(b) 模式在治疗多酚精华:杂色菊苣的Castelfranco提取(34 μ米)。

为了更好地理解他们的生物活性和试图证明这些提取的可能的生命起源以前的角色,Caco-2氧化应激诱导增加2,2′azobis (2-amidinopropane)盐酸盐(AAPH)细胞培养基。之间的交互polyphenol-rich特雷维索的红菊苣提取物对AAPH-induced氧化应激在图 8(一个)。进步te增加表明,0.2,1.3,10 μM,菊苣提取物治疗显示出现了强大的抗氧化活性,能够抵消AAPH过氧化引发诱导,表明细胞膜完整性和confluency恢复。只有0.2 μM杂色Castelfranco的菊苣提取物表现出较低的抗氧化效果(图 8 (b))促进细胞损伤恢复产生的轻微的te增加。

te的变化在不同浓度polyphenol-rich AAPH-induced氧化应激后提取。(一)红菊苣的特雷维索(RT)提取和(b)组合成的菊苣Castelfranco (VC)多酚提取。

 4所示。讨论

几个品种的抗氧化性能 Cichorium属蔬菜一直认为,在某种程度上,植物化学物质包括hydroxycinnamic酸衍生品的存在,mono和diglycosides类黄酮、花青素。据rosseto et al。 6),这些酚醛树脂的存在赋予红菊苣异常高过氧化氢自由基清除活性方面的能力和效率,尤其是在早期发展阶段。本研究中观察到较低的类胡萝卜素值可能是由于有限的暴露在阳光和温度越低,在冬季,因为类胡萝卜素生物合成是不像蔬菜在开放领域的刺激。据Niizu和Rodriguez-Amaya 34),绿色的菊苣显示更高的平均含量为53.7±8.3(毫克/公斤)和35.3±5.0(毫克/公斤)对叶黄素和 β胡萝卜素,分别。如前所述(其他地方 35),绿色菊苣从拉齐奥表现出更高的类胡萝卜素含量。特别是,叶黄素和 β胡萝卜素值分别为14.10±3.30毫克/公斤和42.12±5.99毫克/公斤,分别在野生型,平均含量为15.51±3.28毫克/公斤叶黄素和40.62±2.15毫克/公斤 β在种植菊苣胡萝卜素。

总抗氧化能力是一个参数强烈影响类型的食物(即。,species and varieties for the same species), but also by growing conditions, environmental factors, and preservation techniques. Variegated Chicory of Castelfranco exhibited the lowest TAC values for the FRAP and TEAC methods, respectively. Red Chicory of Treviso (Early and Late) results, analyzed by the FRAP and TEAC assays, were according to Pellegrini et al. [ 36]。其他地方的报道( 35),几种蔬菜的抗氧化成分的变化与农业实践和环境因素。关于细胞化验,te测量代表一个物理测量评估细胞培养的生理状态检测早期肠道屏障功能 在活的有机体内损害。众所周知,缺陷引起的上皮通透性改变的套料在几个炎性肠道疾病。不同的元素,包括强大的先天免疫反应,上皮paracellular渗透率、和上皮细胞完整,以及粘液的生产,导致肠道屏障的完整性( 37]。我们的实验系统是Caco-2的汇合的单层细胞平衡。在这种情况下,上皮文化更容易受到菊苣提取物浓度的变化。所以,小的相对浓度的变化提取对应于化学和物理改变细胞模式和戏剧性的细胞形态变化。套的紧张,经组织学分析(数据 4(一)和 5(一个))和缺乏形态变化或提取活动由扫描电镜细胞单层(数字 4 (b)和 5 (b)),没有指定如果这些提取物维护保护作用的抗氧化剂的混合物,但表示没有上皮之间的直接交互Caco-2细胞和菊苣提取物。这些提取物可以区分的黏多糖glycocalyx像生命起源以前的混合物。众所周知,glycocalyx是结合粘液糖蛋白分子的网络产生的黏多糖主要由杯状细胞。glycocalyx和粘液形式灵活的外衣提供细胞免受机械和化学损伤。营养物质扩散到粘膜,可以受到glycocalyx中的酶,并创建一个区域在高浓度的更容易吸附分子的浓度梯度( 38]。目前,我们的研究重点是聚类的食物中提取glycocalyx交互。

最大的保护作用在细胞细胞毒性,从特雷维索红色的萝卜提取物(70 μM)对组合成的菊苣Castelfranco提取(34 μ米),可能是由于特定的成分在polyphenol-rich分数。上述的主要黄酮类化合物提取报道在表 1TJs应对各种自然植物和食品提取物。三通测量存在剂量反应曲线模式,表明没有改变Caco-2细胞单层,根据我们的研究结果强调从0.2到17 μM菊苣提取物治疗(图 3)。此外, Cichorium intybusl .似乎抵消,提高AAPH引起的氧化应激和细胞损伤 在体外Caco-2细胞模型(图 8)。正如之前报道的( 39),当prooxidant (AAPH)补充说,t形测量大大减少,直到细胞坏死;此外,据Finotti et al。 40)、氧化剂(AAPH)的存在导致增加黏多糖分泌位于微绒毛glycocalyx。总的来说,一个更好的健康行动的红菊苣特雷维索polyphenol-rich提取Caco-2 (0.2 - -1.3 -10 μ浓度)可以认为不与单层细胞作为外源性物质有助于保持最佳的细胞功能由其强大的抗氧化活性。另一方面,红菊苣的特点是花青素色素含量高( 41],可能产生一些有益的健康和营养的影响 12, 42, 43]。

 5。结论

可以得出结论,TJs反应取决于剂量暴露和特定食品提取物的化学成分协同和相互依存的抗氧化效果与上皮glycocalyx(酶和非酶的)。即使氧化还原平衡不来自一个单一的原因,我们的研究表明,抗氧化剂之间的交互提取和粘多糖复合物glycocalyx可以保护 在活的有机体内衬里损伤的肠道保持健康和有效的肠道屏障。

 缩写 Caco-2:

人类结肠癌细胞系

 收紧:

铁降低抗氧化能力

 问题:

Trolox等效抗氧化能力

 te:

Transepithelial电阻

 TJ:

紧密连接

 扫描电镜:

扫描电子显微镜。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

本研究在项目中执行BIOVITA和TERRAVITA由意大利农业部、食品、和林业政策。

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