1。介绍
大量研究证明了MSC人口展览donor-to-donor异质性。这个事实可以归因于几个因素,包括用于文化的方法,选择,扩大人口和供体的年龄
1 ]。
羊水干细胞(AFSC),收获协议是建立在临床实践以及选择方法,基于c - kit表面标记表达式(
2 ]。此外供体年龄范围以来被认为是相当限制获得的样本通常是在临床实践中进行细胞遗传学分析16周和怀孕20周之间。然而,以及其他msc (
1 ),AFSC可以显示捐助者之间的异质性。
ROS的监管有至关重要的作用在维护具备干细胞和分化潜能的干细胞,以及stem-cell-associated疾病的进展(
3 ]。ROS-mediated扩散和干细胞/祖细胞衰老可能是由数量决定的,时间和地点ROS的生成,激活特定redox-signaling通路(
4 ]。事实上氧化还原变化在不同的领域和产生的ROS水平变化可能代表一个重要的细胞内机制不同细胞之间的沟通隔间(
5 ]。原子核本身就含有大量的蛋白质和可氧化的硫醇必不可少的转录,染色质稳定,和核蛋白质进出口,以及DNA复制和修复(
5 ]。一些转录因子被认为是参与基因表达的redox-dependent调制
5 ]。
最新进展表明,参与ROS-producing烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶减少(NADPH,氮氧化物)系统是一个重要的触发区分ESCs向心肌细胞谱系(
6 - - - - - -
10 ]。Nox4 ESCs鼠标的分化中起着重要的作用对平滑肌细胞(SMC)血统当把原子核和生成H2 O2 (
11 ]。事实上Nox4的亚细胞定位是可能尤其重要,鉴于其本构行为,不同亚型,如Nox1或Nox2,需要激活受体激动剂。据报道Nox4一直不定地出现在内质网(
12 ,
13 ),线粒体(
14 ),细胞骨架
15 ),质膜(
16 ),和核
17 在不同的细胞类型。最近我们证明人类AFSC Nox4可以检测到细胞核,根据细胞代谢状态(
18 ]。
有趣的是更好地了解ROS体内平衡是一个重要的调制器在干细胞自我更新和分化。特定的蛋白质可以作为“氧化还原传感器”由于他们半胱氨酸残基的氧化还原的修改,这是至关重要的蛋白质功能的控制。信号分子如foxo APE1 / Ref-1 Nrf2,自动取款机,低氧诱导因子NF -
κ B, p38和p53遭受氧化还原的修改,可能参与调节干细胞的自我更新和分化
19 ]。
本研究的目的是评估核Nox4-generated ROS是否可以调节转录因子的存在和定位在核领域具备干细胞功能的关键。为此我们进行了共聚焦免疫荧光实验和coimmunoprecipitation化验分析。此外我们调查是否不同的核Nox4 (nNox4)存在,AFSC中观察到的样本,与典型的表达干细胞标记和分化潜能。这些数据表明nNox4派生ROS具备干细胞参与AFSC监管和可以被视为遏制潜在的标志。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
羊膜穿刺术样品(6备份烧瓶获得不同的捐助者)Laboratorio di提供的遗传,Ospedale圣玛丽亚四星龙(Reggio Emilia、意大利)。所有样本收集病人的知情同意(母亲的年龄
≥
35)根据意大利法律和伦理委员会的指导方针。
人类AFSC (AFSC)被孤立如前所述德骑绝尘et al。
2 ]。人类羊膜穿刺术文化被胰蛋白酶化和收获进行c - kit免疫选择使用mac技术(Miltenyi研究,德国)。AFSC亚文化通常在1:3稀释,不允许扩大超出了70%的融合。AFSC是生长在培养基(
α MEM补充20%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100
μ g / mL链霉素)(所有试剂从EuroClone Spa、意大利)37°C和5%的公司2 (
20. ]。
2.2。Nox4沉默
逆转录病毒上清液生产根据嘘shRNA质粒板(29-mer)应用指南;AM12细胞转染空向量(pRS向量,TR20003),炒向量(嘘29-mer无效pRS向量,TR30012),和四个NOX4基因特定成分表达pRS向量(TI311637, TI311638、TI311639 TI311640) 48 h (
21 ]。逆转录病毒上清液然后在2000×g离心5分钟,用于靶细胞(AFSC)感染。表明,细胞被感染NOX4 shRNA逆转录病毒载体,空向量,或炒向量。在感染后48小时,细胞暴露在2
μ g / mL嘌呤霉素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)24小时并受评估的Nox4表达蛋白免疫印迹和共焦分析和检测细胞内ROS水平。
2.3。分化的协议
成骨分化得到细胞3周维持在37°C和5%的公司2 在成骨的媒介:培养基补充100海里地塞米松,10毫米
β 甘油磷酸盐,50
μ g / mL抗坏血acid-2-phosphate (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。盖玻片被沾染了茜素红S染色光显微观察。
Chondrogenic分化:作为一个单层细胞培养使用包含DMEM培养基高葡萄糖,100 nM地塞米松和10 ng / mL TGF
β 1(美国圣路易斯Sigma-Aldrich), 10
μ 米2 p-ascorbic酸,1% v / v丙酮酸钠(表达载体、意大利),和50毫克/毫升的预混料(BD,富兰克林湖,新泽西,美国)为3周。
神经分化协议(
22 ]:细胞融合和维护被播种在60%神经分化培养基培养基补充10%的边后卫和20
μ M维甲酸(RA)在二甲亚砜(DMSO),从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)长达4周37°C和5%的公司2 。
2.4。制备的细胞提取
细胞中提取得到描述Maraldi et al。
23 ]。短暂,subconfluent细胞被添加在裂解提取缓冲(20毫米Tris-Cl, pH值7.0;1%诺乃清洁剂p 40;150毫米氯化钠;10%甘油;10毫米EDTA;20毫米氟化钠;5毫米焦磷酸钠;Na和1毫米3 签证官4 )和新添加Sigma-Aldrich蛋白酶抑制剂鸡尾酒在4°C为30分钟。用溶菌产物,通过离心,立即煮在SDS示例缓冲区或用于免疫沉淀反应实验,如下所述。
2.5。免疫沉淀反应和电泳
免疫沉淀反应进行报道他et al。
24 ]。等量的事先批准溶解产物(pcl),其蛋白质含量是由布拉德福德的方法,在一夜之间被孵化与兔子anti-Nox4(美国公司罗福斯生物制品)和鼠标anti-sc-35 (Sigma-Aldrich) (3
μ g)。那么这两个样本处理30
μ L 50% (v / v)的蛋白质/ G琼脂糖水泥浆(通用电气医疗集团生物科技,乌普萨拉,瑞典)在4°C温柔摇晃1 h。球团矿和20毫米Tris-Cl洗两次,pH值7.0;1%诺乃清洁剂p 40;150毫米氯化钠;10%甘油;10毫米EDTA;20毫米氟化钠;与10毫米和5毫米焦磷酸钠,一旦Tris-Cl, pH值7.4,煮在SDS示例缓冲区,和离心机。上层清液被加载到SDS-polyacrylamide凝胶涂抹在Immobilon-P膜(美国微孔,沃尔瑟姆,MA),处理与表示抗体和免疫印迹检测到Supersignal衬底化学发光检测设备(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。化学发光检测得到的信号量化是在440年柯达形象站cf与柯达1 d图像分析软件。
2.6。核净化
人类AFSC核被他净化报道et al。
25 ]。简单地说,400年
μ L核隔离缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值7.8,1%诺乃清洁剂p 40, 10毫米
β 巯基乙醇,0.5毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1
μ g / mL抑肽酶和亮抑酶肽,5毫米氟化钠)添加到5×106 细胞在冰上8分钟。Milli-Q水(400
μ L)被添加到膨胀细胞为3分钟。细胞通过22码针被剪切的段落。核被离心恢复在400×g在4°C 6分钟,400年洗一次
μ L洗涤缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米MgCl2 +文本)抑制剂如前所述。上层清液(包含胞质分数)进一步离心机在4000×g为30分钟。孤立的核和胞质提取物终于在裂解缓冲细胞溶解,用近,通过离心分离。
2.7。免疫印迹
免疫印迹的协议进行了描述,汉森et al。
26 ]。
由布拉德福德蛋白质测定蛋白质提取、量化(Bio-Rad实验室、CA、美国),接受SDS-polyacrylamide凝胶电泳转移到Immobilon-P膜。以下使用抗体:兔子anti-NF -
κ B,兔抗
β 连环蛋白、山羊anti-matrin3山羊anti-actin(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)稀释1:500;兔子anti-cyclin E2,细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B1、p21, Pmyt1, Oct4、和鼠标anti-cyclin A1,和SSEA-4(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),鼠标anti-tubulin,和鼠标anti-sc-35 (Sigma-Aldrich圣路易斯,密苏里州,美国),兔子anti-Nrf2 (Abcam,剑桥,英国),兔子anti-Nox4(罗福斯生物制品有限公司,美国),和鼠标anti-pH2A (Ser139),鼠标anti-CD90和anti-CD105(美国Billerica的微孔,MA)兔anti-CD73(美国CA Genetex欧文分校),稀释1:1000;peroxidase-labelled anti-rabbit,鼠标,和山羊二级抗体稀释1:3000(皮尔斯抗体,热科学;美国罗克福德,IL)。Ab稀释了包含3% BSA TBS-T pH值7.6。膜使用Supersignal衬底化学发光检测可视化工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。Anti-actin抗体被用来控制蛋白质的加载。
2.8。老化试验
衰老细胞可视化在45天内文化与衰老
β 牛乳糖染色工具包(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国制造商的指示。这个测试的目的是检测
β 牛乳糖活动pH值6,衰老细胞中没有的一个已知特征presenescent,静止不动,或永生细胞。
2.9。共焦显微镜
未分化AFSC冰冷的多聚甲醛固定的20分钟4%然后permeabilized 0.1% Triton x - 100在冰冷的磷酸盐(PBS) 5分钟。Permeabilized样本然后堵塞3%的牛血清白蛋白(BSA)在PBS 30分钟在室温下(RT)和孵化主要抗体(Ab)。鼠标和鼠标anti-sc-35 anti-glial原纤维酸性蛋白(GFAP) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),兔子反胶原蛋白II型(美国CA Genetex欧文分校),兔子anti-coilin (Abcam,剑桥,英国),山羊anti-aggrecan,兔子anti-Nox4,兔子anti-Oct4,山羊anti-Foxo1,山羊anti-Sox2(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)(稀释1:50),鼠标anti-Oct4(美国微孔Billerica的),鼠标反
β 微管蛋白3(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),和鼠标anti-pH2A (Ser139)(美国微孔,Billerica的)(稀释1:100),在PBS含有3% BSA 1 h RT,被用作主要的抗体(Ab)。二级Ab是稀释1:200年PBS含有3% BSA(山羊anti-mouse Alexa 647年,山羊anti-rabbit Alexa 488年,抗体和驴Alexa 488)。在PBS洗涤后,样本沾1
μ g / mL DAPI H2 O为1分钟,然后安装与抗衰落中(0.21米DABCO和90%甘油0.02米三,pH值8.0)。消极的控制由样本不孵化与主抗体但只有二级抗体。
对于双重染色sc-35抗体,例如,Nox4,我们进行了第一次孵化anti-Nox4过夜,然后分别1 h anti-sc-35孵化的,为了避免非特定的抗体的相互作用。
共焦成像进行了使用尼康A1共焦激光扫描显微镜(如前所述)(
27 ]。
光谱分析进行排除两个信号之间的重叠或荧光染料的自发荧光背景信号的影响,正如前面所示(
28 ]。共焦串行部分加工与ImageJ软件均获得三维预测,如前所述[
29日 ]。使用Adobe Photoshop软件执行图像呈现。
2.10。核ROS成像
核发现了ROS nuclear-localized荧光探针为H2 O2 ,核过氧化翡翠1 (NucPE1) [
30. - - - - - -
33 ]。对所有实验,5
μ M NucPE1的解决方案(从5毫米股票在DMSO)在PBS /葡萄糖。细胞被保存在一个孵化器(37°C, 5%的公司2 )过程中所有的实验。探测器是孵化为30分钟。
共焦荧光成像研究进行一个尼康A1共焦激光扫描显微镜。激发NucPE1-loaded细胞在488纳米是一个基于“增大化现实”技术的激光和排放收集在535海里。所有图片收集在一个实验同时使用相同的显微镜设置。图像分析在ImageJ执行。
2.11。统计分析
在体外 实验进行了一式三份。对于定量比较,值被表示为平均数±标准差(标准差)一式三份分析的基础上为每个样本。测试观察到的差异的重要性在学习小组中,单向方差分析(方差分析)与因果Bonferroni调整应用测试。一个
P
值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Nox4 AFSC的细胞核
最近我们已经证明,利用抗体从圣克鲁斯,Abcam,或罗福斯,我们可以看到Nox4信号主要是局部的细胞核内AFSC [
18 ]。特别是AFSC表达Nox4核显示位置分布,点状的模式类似于一个在核领域,如斑点或卡哈尔的身体。为了测试是否核Nox4 (nNox4)驻留在核领域,colocalization化验使用抗体直接执行sc-35,斑纹标记,或coilin,卡哈尔的身体标记。共焦分析(图
1(一) )双重染色anti-Nox4(绿色)和anti-sc35(红色)或anti-coilin(红色)表明Nox4与核斑点的域,而不是卡哈尔的身体,如图所示值的皮尔森相关系数(
Rp )和重叠系数(
R ),它提供了信息之间的形状相似度两种模式(Nox4和sc-35)。相关的值
R 可以从−1比1,因此值意味着模式非常相似,而价值−1意味着模式是完全相反的。重叠系数约0.8表示一个很好的colocalization两个信号。
图1
Nox4 AFSC的核本地化和交互。(a)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),Nox4(绿色),和coilin(红色)或sc-35(红色)。Colocalization图报告皮尔森和重叠系数。比例尺:10
μ m。(b)总溶解产物(TL)和sc-35抗体免疫沉淀反应,然后显示与anti-sc-35 anti-Nox4(右)或与anti-Nox4免疫沉淀反应,然后显示anti-Nox4和anti-sc-35(左)。事先批准的信号样本(pcl)中间线所示。(c)第一行:代表图像显示与核染色ROS探针(核过氧化祖母绿1)AFSC治疗或不治疗的成分。第二行:Nox4信号(绿色)在相同的样本。比例尺:10
μ m。(d)的免疫印迹显示anti-Nox4 AFSC对待小干扰rna TI311640空向量(ev)或者,最好沉默向量中4报道在材料和方法部分。所有提交的数据代表三个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
证明这个定位也意味着这些蛋白质的直接交互,coimmunoprecipitation实验(anti-Nox4 IP anti-sc35和IP)进行核斑点和显示Nox4与域(图
1 (b) )。
为了探讨NADPH氧化酶活性在细胞核内,我们核选择性探针用于H2 O2 ,核过氧化翡翠1(图
1 (c) )。免疫荧光分析(图
1 (c) )表明,减少Nox4表达式,证明了免疫印迹(图
1 (d) ),发生在细胞质和核隔间。核处理,总的来说,AFSC细胞显示核ROS水平显著降低。
Forkhead盒O (FoxO)转录因子在成体干细胞保存他们的再生潜力。FoxO1对人类ESC多能性的维护至关重要。这个函数可能是介导通过直接控制FoxO1 Oct4、Sox2通过占领和激活基因表达各自的启动子(
34 ]。的细胞分布在AFSC FoxO1胞质和胞核,但Nox4信号匹配只有在细胞溶质,如图
2(一个) 。否则,多能干细胞标记Oct4 colocalizes在某些地方与nNox4染色成核(图
2(一个) )。有趣的是Oct4在散斑检测领域,通过与sc-35标签(图所示
2 (b) )和coimmunoprecipitation试验(图
2 (c) )。coilin的信号,卡哈尔的身体标记,不匹配Oct4(图之一
2 (b) )。
图2
Nox4 AFSC与核转录因子的关系。(a)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),Nox4(绿色),和FoxO1(红色)或Oct4(红色)。(b)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),Oct4(绿色),和coilin(红色)或sc-35(红色)。比例尺:10
μ m。(c)免疫印迹分析,核溶解产物(NL)和免疫沉淀反应实验的问Nox4抗体然后用anti-Oct4和anti-sc-35透露。事先批准的信号样本(pcl)中间线所示。提出了数据的代表三个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.2。AFSC异质性和nNox4
从不同的羊膜干细胞分离液收集样本(1 - 6)表现出不同的行为,增殖率。的数据只显示最具代表性的4。图
3(一个) 显示图片,4代表的6个样品,与Nox4的不同的细胞分布有关。很明显,在s1示例Nox4更表示,检测主要在胞质。相反,样本s4,最慢的一个,显示了Nox4定位成核,胞质表达很低。这个证据证实了免疫印迹分析Nox4核提取,如图
3 (b) 。此外,使用核ROS调查表明,活性氧的产生从s1 ~ s4供体核显著增加(图
3 (c) )。
图3
捐赠异质性对Nox4本地化和核ROS的影响生产。(a)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色)和Nox4 4不同AFSC文化(绿色)信号。比例尺:10
μ m。(b)代表图像的免疫印迹分析核样品1 - 4与Nox4 AFSC透露。肌动蛋白进行检测,以在每一行显示蛋白质装载的数量。提出了数据的代表三个独立的实验。(c)代表图显示获得核ROS荧光探针(核过氧化祖母绿1)规范化AFSC样品的蛋白质含量。
P
*
*
*
<
0.0001
;
P
*
*
*
<
0.01
从样本1明显不同。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
由于活性氧可以引起DNA损伤,我们测试的磷酸化水平H2AX虽然是至关重要的,以确定DNA损伤后细胞存活(
35 ]。像预期的那样看着核H2A疫源地,我们发现,相比s1和s2、s3和s4样本表现出巨大H2A磷酸化的状态(图
4(一) )。Nox4双重染色,pH2AX,即使不是所有的原子核,可以表明nNox4-generated ROS可能诱发核DNA损伤。
图4
AFSC样本异质性在DNA损伤、衰老和细胞周期。(a)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),Nox4(绿色),和PH2A(红色)AFSC样品1到4的信号。(b)的代表图像的总溶解产物AFSC样品1 - 4通过sds - page分离。与表示抗体免疫印迹被执行。肌动蛋白进行检测,以在每一行显示蛋白质装载的数量。NF的分析
κ B和Nrf2进行核溶解产物和matrin3检测执行为了显示在每一行的核内蛋白量加载。提出了数据的代表三个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
同时,我们寻找衰老标记,
β 牛乳糖活动(数据未显示),但只能注意到一个不显著增加在样例4。
事实上,关于增殖率,样品越快(s1)培养
在体外 达到融合每48小时,最慢的一个(s4),同时播种密度,花费超过3天。细胞周期的深入的分析报告(图下方
4 (b) )。c - kit的积极选择的人口是大约98%的样本(数据未显示)。
为了研究细胞周期检查站,我们分析细胞周期蛋白和其他相关蛋白的表达不同(图
4 (b) )。细胞周期蛋白A1、B1和E2,通常在增殖细胞中调节,减少从s1 s4, p21和
β 连环蛋白。另一方面,pmyt1和细胞周期蛋白D1的增加,因为他们中表达
G
0
/
G
1
阶段,确认这些样品的低增长率(s3和s4)。
分析核提取物、调节细胞周期的转录因子NF -
κ B减少慢样本,表明氧化状态进入细胞核会导致不稳定和核出口。另一方面,Nrf2存在原子核从s1 ~ s4增加,因为Nrf2作为负调节细胞周期进入造血干细胞(
36 ]。
表达谱的多能干细胞和间充质干细胞标记物进行了分析。数据
5(一个) 和
5 (b) 表明,核表达多能性的标志如Oct4、Sox2,并从s1 ~ s4 SSEA-4减少,以及存在间充质干细胞标记CD73, CD90、CD105。因此具备干细胞能力可能会下降。
图5
捐赠异质性对干细胞标志物的影响。(a)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),Nox4(绿色),和Oct4(红色)信号或DAPI(蓝色)和Sox2(绿色)AFSC样本1和4的信号。比例尺:10
μ m。(b)代表图像的总溶解产物AFSC样品1 - 4通过sds - page分离。与表示抗体免疫印迹被执行。提出了数据的代表三个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
然后我们对待AFSC有3种不同的分化协议和我们测试的存在钙化矩阵(茜素红)成骨,胶原蛋白II和aggrecan chondrogenic,和GFAP和
β 微管蛋白III的神经源性。分化潜能分析表明成骨的(图
6(一) )和神经源性(图
6 (c) )分型方便样本1比4。另一方面,软骨基质蛋白的存在是高于样本4比1(图
6 (b) )。
图6
捐赠异质性对分化的影响潜力。(a)代表图像显示与茜素红染色AFSC样本1和4后三周的文化成骨的媒介。(b)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),胶原蛋白II(绿色),aggrecan(红色)的信号AFSC样品1 - 4后三周的文化chondrogenic媒介。(c)代表图像显示之间的叠加DAPI(蓝色),GFAP(绿色),和
β 微管蛋白3(红色)信号AFSC样本1和4三周后神经源性文化的媒介。比例尺:10
μ m。
(一)
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(b)
![]()
(c)
![]()
4所示。讨论
当前工作在再生医学是人类干细胞的使用容易收集和高增殖,可塑性大,没有道德问题。羊水干细胞显示所有这些特点,但有一个donor-to-donor异质性影响了增殖和分化能力。这是明显的从文化的初始阶段,选择c - kit。差异可能是由于羊水中含有的细胞混合种群来自胎儿和羊膜。不过,这种增长的区别是维护后c - kit+ 细胞的选择。因此,重要的是要找到替代因素参与细胞命运的变化如ROS和讨论他们的角色在多能性干细胞的分化,提高定向培养协议(
3 ]。
最近,它已成为明显,核氧化还原信号是一个重要的信号机制调节多种细胞功能(
37 ]。NADPH氧化酶家族(Nox)是最重要的一个来源的活性氧在几个细胞车厢,包括细胞核。最近,我们证明了在AFSC Nox4可以检测到核内域(
18 ]。在目前的研究中我们阐明Nox4定位核域的类型,即斑点域。斑点是亚核的结构中丰富premessenger RNA剪接因子和位于interchromatin地区的哺乳动物细胞的核浆。斑点是动态的结构,其蛋白质和rna蛋白质斑点之间的组件可以不断循环和其他核的位置。几种激酶和磷酸酶调节剪接机制也被本地化的成核斑点。他们也可能包含转录因子,连同剪接因子(
38 ]。
事实上,转录因子,以及甚至激酶和磷酸酶,描述了氧化还原调控的核心,通过调制的DNA结合能力(
37 ]。多样性的转录控制是通过一个复杂的网络组合蛋白质和protein-DNA交互影响的稳定和亚核的定位这些转录监管机构。的forkhead同源框O型(FOXO)转录因子有重要作用在维持干细胞的身份(
3 ]。FoxO1、FoxO3a FoxO4介质至关重要的细胞氧化应激反应,也可以视为对氧化压力传感器由于他们的活动是由H2 O2 依赖于细胞环境,他们传递这些压力诱导细胞凋亡,抗压力,或衰老
39 ,
40 ]。增加细胞内ROS促进FoxO的定位在细胞核转录活跃的地方
40 ]。因此,我们调查起初AFSC表达Nox4 FoxO蛋白质的定位也进入细胞核。FoxO1对应的信号在胞质Nox4之一,但隔间。
因为我们的兴趣是阐明Nox4到核的作用,我们研究了核与其他转录因子相互作用。例如转录因子Oct4扮演着重要功能维护多能胚胎与哺乳动物的生殖细胞(
41 ]。此外,Oct4蛋白质之前已经报道过有关,在人类卵母细胞,拼接斑点和卡哈尔的身体(
42 ]。在这里,我们表明,在AFSC核Oct4 colocalizes Nox4和sc-35斑点标记。此外共焦和coimmunoprecipitation分析表明Nox4与散斑域,表明Nox4可能参与调节的转录/ pre-mRNA加工机械的ROS在这些特定核领域的生产。事实上,immunofluorescent本地化Nox4演示了一个点状的模式在干细胞的细胞核染色,与Oct4匹配,具备干细胞调节蛋白质。所以Nox4-derived Oct4调制的ROS可能协调与其他蛋白质斑点调节RNA加工。
从不同的羊膜干细胞分离液表现出反向增殖率加上Nox4-derived ROS水平进入细胞核,细胞周期蛋白分析如图所示。支持这一点,最近报道的证据表明氧化DNA损伤积累限制人类肝星状细胞的自我更新能力(
43 ]。因此,我们分析了不同AFSC样本H2A疫源地的存在,作为DNA损伤的标志。正如所料,在样本Nox4主要是核能,更高的DNA损伤发生。因此一个潜在的角色nNox4可以应对DNA损伤的规定或通过调节DNA修复。
研究细胞周期更好的澄清,慢AFSC样品被屏蔽
G
0
/
G
1
阶段。转录因子,NF -
κ B和Nrf2氧化还原敏感和细胞周期调控。如果细胞,NF -
κ B细胞溶质是隐藏在一个不活动的形式。它可以释放这些胞质池的两个主要途径(审查,请参阅[
44 ),导致核易位NF -
κ B复合物。在我们的实验条件nNox4 derived-ROS似乎建立在NF -减少
κ B表达式也进入细胞核。
Nrf-2是一个转录因子与细胞对氧化应激的反应。这种异质二聚体结合antioxidant-response元素(战神),从而上调众多基因编码解毒酶,抗氧化剂,所需的酶
新创 谷胱甘肽合成(
45 ]。有趣的是Nrf2作为负调节细胞循环进入肝星状细胞,维持平衡HSC静止和自我更新
36 ]。实际上,Nrf2水平增加AFSC样本中细胞周期被阻塞。分析获得的细胞文化从不同的捐赠者,我们也注意到,Oct4低增长率下降的表达样本,以及Sox2。事实上,越来越多的证据表明,Oct4不单独激活靶基因的转录与另一个dna结合转录因子,但是需要依赖dna的heterodimerization hmg盒子蛋白Sox2 [
41 ]。
至于有关分化能力不同的AFSC样本,我们注意到具备干细胞标记物的表达越高(样本1或2)与一个更简单的对成骨分化潜能,神经性的血统。另一方面,chondrogenic承诺更好的获得了AFSC人口样本4,但这个结果可能是合理的低氧条件,允许这种区别。
理解ROS的可能机制影响干细胞的命运可以提供深入了解干细胞的衰老可能与衰老的疾病(
46 ]。而且它可能表明新的具备干细胞的标志功能为了容易区别活跃MSC生产供临床使用,病人治疗的最终结果只有有效的细胞和浪费公共资金是预防。
我们的发现不仅显示AFSC核Nox4-derived ROS的影响,但还建议的机制参与增殖和分化的调控能力。此外,针对核ROS水平的提高与一般干细胞可能扭转他们的抑制能力降低,活性氧含量的轻微变化可能对干细胞的命运有着重要的影响。