1。介绍
骨骼肌组成45到总数的55%的体重,可以认为是人体最大的器官(
1]。这是postmitotic组织主要由多核myofibres [
2]。骨骼肌的再生能力与正常生理成长和适应补偿磨损的骨骼肌因受伤或疾病是高度依赖于人口静止的祖细胞,称为卫星细胞(
3,
4]。这些静止的单核的细胞和基板之间的隔离myofibres肌纤维膜,毛罗·[最初描述的
5]。这些卫星细胞被称为肌母细胞一旦他们隔绝肌肉活检和增殖在文化
6]。静止卫星细胞被激活,以应对损坏或运动和扩散成肌细胞,修复或进一步分化和融合形成的肌肉纤维(
7]。不幸的是,无论是骨骼肌卫星细胞衰老期间可以避免各种修改的命运。
骨骼肌衰老与进步和戏剧性的肌肉和力量的损失和慢或再生能力受损,导致肌肉无力,身体虚弱,和受损的流动,这通常被称为sarcopenia [
8- - - - - -
10]。从40岁,骨骼肌质量开始下降以每年0.5 - 1.0% (
11]。Sarcopenia可能导致发病率,丧失独立性,并随后死亡率(
12,
13]。此外,除了物理功能的副作用,sarcopenia与一些疾病如肥胖、骨质疏松症和糖尿病被认为是全球人类健康的重大风险(
14]。到目前为止,还没有有效的治疗或补充至少遇到副作用sarcopenia [
15]。
过早老化或衰老可以诱导氧化应激,通过氧化损伤的积累或活性氧(ROS),也称为应激过早衰老(口)
16]。活性氧,如过氧化物、过氧化氢和氢氧自由基会攻击几种类型的组织,包括我们的兴趣组织,骨骼肌。骨骼肌衰老容易氧化应激的肌纤维是高度oxygen-consuming结构和骨骼肌中产生的ROS水平高于其他组织(
16,
17]。因此,为了创造一个老化环境类似于骨骼肌条件、过氧化氢(H2O2)被选为应激诱导物的过早衰老。研究表明,急性暴露在H2O2触发器的外观senescent-like表型,如senescent-like形态,更短的寿命,增长逮捕,减少扩散能力(
16,
18,
19]。如果过早氧化应激加速衰老,抗氧化治疗药物可能与衰老,有利于抵消和tocotrienol丰富的分数(基金会)纳入我们的考虑。
尤其是维生素E,对健康的好处
α生育酚,是著名的国际在过去的几十年。
α生育酚是维生素E的突出的形式在饮食和有较高的生物利用度在其他不同的维生素E(模拟
20.,
21]。之一,然而,最近tocotrienol维生素E的模拟,得到了越来越多的科学兴趣由于其较高的生物活性方面的抗氧化和nonantioxidant活动相比,生育酚。棕榈油派生扶轮基金会主要由tocotrienol的70% (
α- - - - - -,
β- - - - - -,
γ-)和30%的生育酚。Tocotrienol已获得了认可其在抗癌的效果,研究人员的脂质降低,antiatherosclerosis、神经保护、抗炎作用,antiosteoporotic [
22- - - - - -
26]。
扶轮基金会向各器官延缓衰老的效果令人鼓舞的结果。基金会作为一个例子,证明了改进的标准通过逆转衰老的细胞周期阻滞和恢复人类成纤维细胞端粒和端粒酶活性(
27]。此外,扶轮基金会postadministration UVB照射后的平均寿命延长
秀丽隐杆线虫(
秀丽隐杆线虫)[
28]。此外,膳食补充剂与tocotrienol证明改善免疫功能与年龄相关的恶化
在活的有机体内(
21]。这些研究结果激发了兴趣研究基金会对成肌细胞的再生能力的影响。增强对骨骼肌卫星细胞的再生能力将进一步提高肌肉老化的性能。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类卫星细胞被隔绝的活检5-day-old婴儿股四头肌肌肉如前所述[
29日文森特博士提供的),并请谅解备忘录从UMR年代787年,德Myologie研究所,由大学皮埃尔和玛丽·居里,巴黎,法国。隔离,卫星细胞在文化为成肌细胞增殖(CHQ5B细胞)和被认为是1意味着人口翻倍(MPD)。细胞培养在37°C在潮湿的气氛中含5%二氧化碳(有限公司2)。的生长介质由X-medium杜尔贝科(四个部分的修改鹰的介质(4.5 g / L d -葡萄糖)(美国Gibco)中一部分199(美国Gibco))补充50
μ奥地利g / mL庆大霉素(PAA), 20%胎牛血清(的边后卫;PAA、奥地利)和2.5 ng / mL重组人肝细胞生长因子(美国Gibco)。细胞群confluency使胰蛋白酶化当他们达到70 80%。在每个通道,分歧的数量计算
日志
(
N
/
n
)
/
日志
2
,在那里
N
细胞的数量在走廊和的时间吗
n
是细胞的数量最初镀。文化被认为是衰老时未能将在3个星期重新喂料的高血清生长介质。在这项研究中,细胞数量孵化与不同的治疗,也就是说,年轻(PD控制
29日
±
3
;口和扶轮基金会),SIPS-induced集团,扶轮基金会控制,预处理组(预处理的与扶轮基金会口肌母细胞感应),和后处理组(口肌母细胞烧伤科扶轮基金会)。
2.2。口的感应H <子> < /订阅> O <子> 2 < /订阅>
孵化的压力源,1毫米H2O230分钟,诱导成肌细胞衰老雷诺等人提出来的。
16]。在sub-confluency 60%,总计
2。5
×
10
4
/毫升肌母细胞暴露在单一的1毫米急性应激H2O2稀释在X-medium补充50
μg / mL庆大霉素,20%的边后卫,2.5 ng / mL重组人肝细胞生长因子30分钟。文化与X-medium然后冲洗两次。
2.3。剂量测定扶轮基金会
影响各种浓度的扶轮基金会(森达美Bioganic Sdn有限公司)在细胞增殖能力进行了研究,以确定最佳剂量的扶轮基金会在成肌细胞。palm-derived扶轮基金会黄金三E 70由80% tocotrienol (26.76%
α-tocotrienol, 4.29%
β-tocotrienol, 32.60%
γ-tocotrienol, 15.53%
δ-tocotrienol)和20.81%
α生育酚。包含159.5毫克每克扶轮基金会
α生育酚,205.1毫克
α-tocotrienol, 32.9毫克
β-tocotrienol, 249.8毫克
γ-tocotrienol和119毫克
δ-tocotrienol。细胞被镀到96孔板的密度
2。5
×
10
4
/毫升,孵化与不同浓度的扶轮基金会,从0开始
μg / mL 250年扶轮基金会(担任负控制)
μ克/毫升扶轮基金会。扶轮基金会孵化24小时后,细胞增殖能力决定通过细胞增殖ELISA, BrdU工具包(罗氏)。的细胞被孵化5-bromo-2′脱氧尿苷(BrdU), 18个小时的溴化胸苷类似物,并发治疗期的24小时。切除治疗介质后,细胞被固定和DNA变性。Anti-BrdU-peroxidase被加入到细胞和免疫复合物被随后的底物反应了。最终产品是量化的测量吸光度的样品在450 nm,参照690海里。
2.4。扶轮基金会的治疗
总共
2。5
×
10
4
/毫升细胞治疗与扶轮基金会(森达美Bioganic Sdn有限公司)作为扶轮基金会控制,预处理组和后治疗组24小时。预处理组的细胞使用50
μg / mL扶轮基金会24小时之后,氧化应激诱导,也就是说,孵化与1毫米H2O2治疗后组,反之亦然。对于扶轮基金会对照组,细胞治疗50
μ没有氧化应激诱导g / mL扶轮基金会。
2.5。测定肌原性的纯洁
卫星细胞培养的肌原性的纯洁是监控通过细胞向肌间线蛋白的表达,只是表达的细胞骨架蛋白肌原性的细胞和成纤维细胞中没有
30.]。desmin-positive细胞的数量占总数的比例确定核细胞培养的肌原性的纯洁和至少500细胞数。使用抗体免疫细胞化学进行了具体的肌间线蛋白稀释1:50(克隆D33;DAKO、丹麦)。细胞(
2
×
10
3
/在80
μL培养基)被播种在聚四氟乙烯涂层幻灯片。治疗是根据他们的集团,分别播种后第二天。第三天,细胞被洗1 x磷酸缓冲盐(PBS)和100%乙醇固定10分钟。固定剂是通过与PBS 1 x 5分钟洗3次。非特异性结合位点被封锁30分钟的边后卫在PBS稀释为1%。细胞培养的主要针对肌间线蛋白抗体。特定的抗体绑定了使用Alexa萤石488(美国英杰公司)直接耦合到二次抗体稀释的1/500。原子核是由赫斯特在荧光染色(σ)的稀释0.0001% w / v。所有图片都是使用ImageJ数字化。
2.6。测定细胞衰老成肌细胞
衰老细胞的存在是通过SA的活动——评估的
β牛乳糖通过计算中阳性细胞的数量在4个随机选择的领域在100 x放大细胞总数的百分比计算(
31日]。测定SA -
β牛乳糖活动进行工具使用衰老细胞组织化学染色(σ)。细胞(
5
×
10
4
细胞在2毫升/中)被播种到six-well盘子和孵化了各自的治疗。细胞被洗两次与PBS 1 x和固定固定缓冲区。固定后,细胞被冲洗三次与PBS孵化前1 x染色混合物(染色的解决方案,试剂B, C和半乳糖苷溶液试剂)37°C没有有限公司2为24小时。
2.7。测定细胞增殖、DNA合成
口和扶轮基金会的影响扩散和DNA合成的细胞进行评估间接通过量化BrdU结合的DNA合成。总数量的细胞(
2
×
10
3
细胞/ 80
μL培养基)被镀成96 -孔板和被接受不同治疗组。参与细胞增殖的细胞DNA的复制可以通过细胞增殖ELISA,量化colorimetrically BrdU工具包(罗氏)。胸苷,而是嘧啶类似物BrdU标签解决方案将被纳入增殖细胞。后涉及单克隆抗体的免疫测定特定BrdU和衬底,样品的吸光度测量在450 nm,参照690海里。
2.8。统计分析
数据提出了意味着±标准错误意味着(SEM)。与IBM SPSS统计软件进行统计分析(版本20)。独立样本
t
以及用于确定控制之间的显著差异,治疗组对所有参数。这些团体被认为是统计上的不同
P
值低于0.05 (
P
<
0.05
)。
4所示。讨论
老龄化每年增加的担心这个国家老龄化不会受益国家无论是在经济上还是社会。即使在个人的舞台,与年龄有关的肌肉损失,称为sarcopenia,会破坏一个年老的男人的生活质量由于独立性的丧失,增加的脆弱,不动。如今,sarcopenia已开始吸引研究人员的注意,考虑到老年综合症自2010年(
1]。各种干预措施或营养nonnutritional如耐力运动和睾酮补充进行了提高骨骼肌性能老化(
32,
33]。据我们所知,这是第一次研究证明扶轮基金会的影响老化的骨骼肌的再生潜力的骨骼肌卫星细胞
在体外。
在这项研究中,治疗1毫米H2O2作为压力源的现象口CHQ5B成肌细胞。治疗口诱导物增加了衰老的生物标志物的存在,也就是说,积累的SA -的活性
β牛乳糖和减少成肌细胞的增殖能力,但没有产生显著影响细胞的肌原性的纯洁。这些发现被发现符合细胞的研究在同一模型来调查一个急性剂量的1毫米的后果H2O2增殖能力,成肌细胞的肌原性的特征显示相似的结果(
16]。研究结果表明,与1毫米H孵化2O230分钟诱导细胞进入一个阶段称为衰老寿命和卫星细胞的增殖能力耗尽,但是肌原性和分化能力的影响。
扶轮基金会的数据显示,低剂量刺激成肌细胞的增殖能力。然而,高浓度的扶轮基金会(超过200人
μg / mL)减少成肌细胞的增殖能力。扶轮基金会的数据显示高浓度肌母细胞的细胞毒性。tocotrienol palm-based扶轮基金会主要由80%和20%的生育酚。tocotrienol 80%类似物中,
γ-tocotrienol最高宪法tocotrienol宪法中(41.17%)。各种研究表明,高浓度的
γ-tocotrienol prooxidant和减少细胞的可行性,如成骨细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞(
19,
34,
35]。此外,高浓度的
γ-tocotrienol (100
μ米)是proapoptotic向成骨细胞促进了通过激活成骨细胞的凋亡caspase-3 [
34]。有研究结果表明成纤维细胞的可行性增加浓度为0.5毫克/毫升扶轮基金会(
27]。然而,有不同的细胞类型(肌母细胞与成纤维细胞)和涉及的扶轮基金会(扶轮基金会黄金三E 70与扶轮基金会黄金三E 50)可能导致两者之间的对比研究。简而言之,维生素E是一种抗氧化剂的属性,prooxidant甚至中性造成了一个有争议的问题在高剂量的维生素E (
35]。
在这项研究中,骨骼肌成肌细胞拥有肌原性的稳定后诱导的氧化应激SIPS-induced成肌细胞。据雷诺et al。
16),人类肌母细胞有较高的电阻对氧化应激与其他细胞相比,成纤维细胞和上皮细胞等,可能是由于长期接触更高层次的活性氧产量在骨骼肌。一项由Bortoli et al。
36)表明,在老化肌原性不受影响。成肌细胞的肌原性的纯洁人口孤立从刚出生的婴儿是90到95%;为成肌细胞肌原性的纯洁人口从一个52岁的孤立的捐赠减少从80%(早期的增殖)75%(增生性寿命结束)和成肌细胞群体孤立从79岁的捐赠者,肌原性的纯度从79%减少(早期的增殖)到76%(增生性寿命结束)
36]。治疗后肌母细胞保持了肌原性,尽管他们已经孵化口诱导物和扶轮基金会。预处理组的肌原性的纯洁,即使它是减少,并不引人注目而细胞群与杜氏肌肉营养不良症(DMD) [
37]。戏剧性的减少在成肌细胞肌原性建议多次经历了一系列的变性再生,从而耗尽细胞的增殖潜力。因此,成肌细胞显示早期衰老(
37]。
年轻人口的成肌细胞出现细胞细长薄和最低限度积极沾染了SA -
β牛乳糖。衰老的细胞,通过口或复制衰老,伴随着修改他们的形态。衰老成肌细胞表现出区分形态,即大,奉承,更延长单核细胞与突出的中间丝与抗体针对肌间线蛋白染色。形态学研究的结果一致,谅解备忘录et al。
8)和Nehlin et al。
38]。治疗与扶轮基金会SIPS-induced肌母细胞恢复细胞形态学,仿佛年轻肌母细胞更多的纺锤状细胞。同样,治疗与扶轮基金会在人类衰老二倍体成纤维细胞(HDF)显示相同的结果在形态学研究[
27]。
SA -
β牛乳糖被称为著名的生物标记物的老化岁礼物在大多数细胞而不是静止的细胞。衰老细胞,增加活动的SA -
β牛乳糖是由于显著增加溶酶体的基因和蛋白质表达
β牛乳糖1基因产物(
GLB1)[
39),这个过程是不可逆的亚文化。SIPS-induced衰老具有类似特征的活动的SA -
β牛乳糖复制衰老(
40]。骨骼肌卫星细胞的复制衰老与个人50岁左右被发现与SA -染色阳性
β牛乳糖(
38]。结果符合SIPS-induced集团所表现出的结果在我们的研究中。在我们的研究中,扶轮基金会展出不同的SA -对活动的影响
β牛乳糖进行预处理和posttreated成肌细胞。之前我们的研究表明细胞预处理与扶轮基金会口感应未能减少SA -活动的累积
β牛乳糖的细胞。然而,与扶轮基金会posttreated细胞显著减少SA的活动——SIPS-induced增量
β牛乳糖。我们的结果涉及到扶轮基金会治疗和SIPS-induced细胞类似于扶轮基金会的研究涉及治疗HDF(复制衰老的
27]。扶轮基金会治疗显著降低的百分比阳性染色SA -
β牛乳糖衰老的HDF,暗示逆转衰老HDF由扶轮基金会。同样,我们的结果表明,逆转衰老的SIPS-induced由扶轮基金会后处理成肌细胞。然而,预处理与扶轮基金会没有表现出对成肌细胞的保护作用老化的命运。
骨骼肌的再生能力是多因子的过程包括:(i)数量的可用卫星细胞变性时,随着年龄的增长而减少在人类
41];(2)激活、增殖和分化能力,由终端有限增长被捕,被称为细胞衰老(
3];(3)环境压力;及(iv)氧化应激(
8]。因此,恢复骨骼肌的再生能力,可用的卫星细胞数量、活化、增殖和分化能力的卫星细胞应该考虑。在这项研究中,SIPS-induced细胞增殖能力有限。老化的成肌细胞的增殖能力有限可能是由于过度转化生长因子的生产
β(TGF -
β)和高水平的pSmad3进而调节细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂,如p15 p16, p21和p27 [
42]。口预处理细胞与扶轮基金会没有扭转成肌细胞的增殖能力的限制。尽管posttreated口肌母细胞与扶轮基金会没有恢复到年轻的控制细胞的增殖能力;增殖能力提高而SIPS-induced成肌细胞。扩散能力的补充和DNA合成posttreated肌母细胞表明扶轮基金会的影响细胞周期阻滞的抑制和增强的细胞复制(
27]。
一般来说,后处理组施加的影响比预处理组打击口通过改善细胞的衰老状况,补充成肌细胞的增殖能力。背后的机制后治疗组剩下的未知。它可能是由于抗氧化剂或nonantioxidant tocotrienol的函数,如信号转导的调节器,基因表达和氧化还原传感器(
43]。足立和Ishii
28)认为postadministration扶轮基金会的有效性
秀丽隐杆线虫并不仅仅是由于扶轮基金会的抗氧化活性,但扶轮基金会可能增强修复或受损的大分子的营业额。在目前的研究中,扶轮基金会补充可能调节细胞老化,类似于先前的研究在衰老HDF (
27),从而导致后处理对老化参数的有效性。sarcopenia期间,损害胰岛素样生长因子(igf - 1)是在老老鼠的肌肉,但igf - 1的激活/ Akt /哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)保护作用中能对骨骼肌质量损失(
44,
45]。有趣的是,李et al。
46)的保护作用
δ-tocotrienol向
γ辐照老鼠和人类造血祖细胞通过upregulation mTOR的途径。因此,它可能表明,应用相同的保护机制可能在当前结果,但应该进行进一步调查证实它。Tocotrienol显示有更高的效率比生育酚由于其敏感性实验的培养基培养细胞(
27,
47]。
sarcopenia期间,切口激活之间的不平衡和骨骼肌岁pSmad3将干扰骨骼肌的再生和扩散。失活的Notch信号调节CDK抑制剂p15的表达,p16, p21和p27 [
42]。此外,信号调制的细胞增殖,分化,甚至生存和干扰microrna的表达(
48]。研究表明,miR-1和mir - 206是骨骼肌卫星细胞增殖密切相关,和配对框转录因子的表达,罗马7 miR-1抑制和mir - 206,将刺激骨骼肌卫星细胞的增殖和罗马7蛋白的表达水平
在活的有机体内(
49]。罗马7成人肌肉卫星细胞中特异表达和主成肌细胞
在体外(
50]。它涉及批判性的骨骼肌卫星细胞增殖和分化。罗马帝国7-null老鼠未能生长或生存;骨骼肌卫星细胞稀少和肌肉很弱,尽管老鼠生存管理(
51]。卢娜et al。
52]表明palm-oil-based扶轮基金会能够减少TGF -
β1诱导pSmad3激活和磷酸化在人类肠道成纤维细胞。我们假定成肌细胞可能会出现相同的结果,因此CDK抑制剂的监管可能会中断。此外,扶轮基金会和
γ-tocotrienol增强细胞增殖在衰老HDF通过调制的细胞周期,也就是说,在G细胞数量减少0/ G1阶段,在S, G细胞数量增加2/ M期(
27,
53]。此外,
γ-tocotrienol调制senescent-associated基因表达,表达下调MMP1、白细胞介素6、CCND1, RB1但调节COL1A1与民族解放军的表达(
53]。基于这些研究结果,我们建议扶轮基金会可能在类似的机制对提高年龄成肌细胞的细胞增殖。
预处理组的结果显示在当前研究与研究进行HDF各种年龄段的治疗
γ-tocotrienol [
19]。进行HDF从不同年龄组(年轻,中间,和老年)的最佳剂量
γ-tocotrienol保护细胞免受H2O2全身的端粒缩短端粒酶活性和损失。虽然
γ从H -tocotrienol保护细胞2O2全身的细胞损失,中间的保护作用更加突出,老年HDF相比年轻HDF。对比的结果可能是由于不同的细胞类型涉及-的模拟-参与机制。
从我们的研究结果是平行于证据tocotrienol走向衰老的保护作用或与变性从其他研究报告。
在体外福井等进行的研究。
240.5)表明,治疗
μM H2O2诱导轴突和树突变性,但治疗同种型的tocotrienol发挥神经保护作用,防止退化的轴突和树突。一些
在活的有机体内研究涉及对延缓衰老的维生素E对不同器官的影响近年来进行了,这些结果显示积极研究改善老化。扶轮基金会改善了与年龄相关的变化在衰老小鼠红细胞酶活性(
54]。此外,扶轮基金会补充改善血脂和氧化还原氧化还原平衡状态的健康的老年人,尤其是个人超过50岁(
55]。然而,很少研究研究仅仅是维生素E的影响或tocotrienol向年龄在骨骼肌。维生素E和运动训练交互显示积极影响通过改善大鼠骨骼肌抗氧化状态(
56]。补充维生素E (
α生育酚)和维生素C改善氧化状态与重复加载运动和衰老小鼠骨骼肌的(
57]。
然而,人类和啮齿动物的肌肉之间存在明显的差异。人类骨骼肌纤维主要由缓慢(II型),但在动物模型中,快速的骨骼肌主要由纤维(I型)。此外,在骨骼肌在啮齿动物中显示标记去神经的神经肌肉接头(NMJs)没有任何显著的运动神经元细胞体的变化。相反,在人类骨骼肌在运动神经元具有许多功能的变化(
58]。因此,它将成为一个需要探讨骨骼肌衰老过程从人类样本。人骨骼肌卫星细胞培养是一个很好的平台来确定所涉及的机制至关重要的再生潜力肌肉疾病,衰老细胞疗法,和肌肉。