NP 神经可塑性 1687 - 5443 2090 - 5904 Hindawi出版公司 10.1155 / 2015/935403 935403年 研究文章 Andrographolide刺激成人海马神经发生 Varela-Nallar 罗瑞拉 1 阿雷东多 塞巴斯蒂安·B。 1 Tapia-Rojas Cheril 2 Hancke 胡安 3 Inestrosa Nibaldo C。 2、4、5所示 自由的法令 毛罗·G。 1 Centro de Investigaciones基于(CIB) Facultad de Ciencias Biologicas y Facultad药物 大学安德烈斯贝罗 圣地亚哥 智利 unab.cl 2 Centro de Envejecimiento y Regeneracion(保健) Departamento de Biologia Celular y分子 Facultad de Ciencias Biologicas 智利天主教大学德 圣地亚哥 智利 uc.cl 3 皇家研究院Farmacologia y Morfofisiologia 智利大学南国德 瓦尔迪维亚 智利 uach.cl 4 中心健康的大脑老化 学院精神病学 医学院 新南威尔士大学 悉尼 澳大利亚 unsw.edu.au 5 Centro de Excelencia en Biomedicina de Magallanes (CEBIMA) 大学de Magallanes 彭塔阿雷纳斯 智利 umag.cl 2015年 22 12 2015年 2015年 23 07年 2015年 17 09年 2015年 22 12 2015年 2015年 版权©2015年曾Varela-Nallar et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Andrographolide(穿心莲内酯)是一个labdane二萜的组成部分 穿心莲香广泛用于其抗炎作用。我们最近发现穿心莲内酯是糖原合酶激酶3的竞争性抑制剂 β(GSK-3 β),Wnt /的一个关键酶 β连环蛋白信号级联。由于此信号通路调节成人海马神经发生,我们评估是否穿心莲内酯刺激这一过程。穿心莲内酯治疗增加神经祖细胞增殖和不成熟的海马神经元的数量2 -和10个月大的老鼠相比,年龄控制老鼠。此外,穿心莲内酯刺激神经新生神经元增加新生儿齿状颗粒的数量。同时,穿心莲内酯的影响评估APPswe / PS1ΔE9转基因阿尔茨海默病小鼠模型。在这些老鼠,穿心莲内酯的密度增加了细胞增殖和成熟在齿状回神经元。与增加的神经发生,穿心莲内酯诱导Wnt信号通路的激活海马的野生型和APPswe / PS1ΔE9老鼠取决于水平的提高 β连环蛋白,GSK-3的活动形式 β,NeuroD1 Wnt目标基因参与神经发生。我们的研究结果表明,穿心莲内酯刺激神经发生在成年人的海马表明这种药物可以作为治疗疾病的神经发生的影响。

 1。介绍

Andrographolide(穿心莲内酯)是一个labdane二萜的主要成分之一 穿心莲香( 1, 2),一个著名的药用植物在亚洲被广泛使用。穿心莲内酯具有广泛的生物活性,包括抗炎作用[ 3- - - - - - 5),也显示出神经保护属性( 6, 7]。最近,也是确定穿心莲内酯预防神经病理变化和改善空间记忆APPswe / PS1ΔE9小鼠模型的阿尔茨海默病(AD) [ 8]。

对穿心莲内酯的作用机制,我们最近决定,直接抑制了酶糖原合成酶激酶3 β(GSK-3 β)[ 9),Wnt /的一个关键酶 β连环蛋白信号通路。Wnt信号通路被激活的绑定Wnt卷曲的seven-pass跨膜受体配体,这可能激活规范Wnt / β连环蛋白信号通路或经典之中 β-catenin-independent信号级联( 10]。Wnt信号级联调节神经系统的发展也是一个重要的调制器的成人神经系统调节突触联系的形成,神经传递,和可塑性 11- - - - - - 13]。此外,它已被最近表明,Wnt信号通路调节的形成新的神经元在成年人的海马(了 14]),这一过程称为成年神经发生。

成年神经发生主要发生在大脑的两个区域——subventricular区在墙上的侧脑室和subgranular区(SGZ)在海马齿状回 15, 16]。在SGZ神经祖细胞位于颗粒细胞层(GCL)和门增殖并产生成神经细胞成熟到融入海马颗粒细胞电路。这些新生神经元与海马可塑性相关,学习、记忆( 17- - - - - - 19]。SGZ神经发生是由Wnt /控制 β连环蛋白信号通路调节增殖,分化和成熟的新生神经元( 20.- - - - - - 23),影响由Wnt目标基因的表达( 24, 25]。考虑到穿心莲内酯激活Wnt信号通路和Wnt目标基因的转录 9),在目前的研究中我们调查穿心莲内酯治疗的效果在成人海马神经发生。我们确定,穿心莲内酯增加细胞增殖和新生的一代成熟的颗粒细胞年轻,年龄在野生型老鼠。此外,雄烯二酮增加扩散和未成熟神经元的密度在APPswe / PS1ΔE9老鼠。在两者中,野生型和APPswe / PS1ΔE9老鼠,穿心莲内酯Wnt信号通路的激活增加海马和增加NeuroD1颈板Wnt目标基因的表达。

 2。材料和方法 2.1。动物和治疗

两年期和10个野生型C57BL / 6小鼠腹腔内注射(i.p)与0.2% DMSO在生理盐水(车辆)单独或车辆与2毫克公斤−1穿心莲内酯(Sigma-Aldrich)每周3次2、4或6周。7个月大APPswe / PSEN1ΔE9(股票# 004462,杰克逊实验室)腹腔注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆为4周每周3次。5-Bromo-2′脱氧尿苷(BrdU Sigma-Aldrich)注入ip 100毫克公斤−11或3天。所有的动物有水和食物 随意在12:12 h光/暗周期。智利天主教大学生命伦理委员会批准的所有程序涉及实验动物学科。

 2.2。灌注和Postfixation

动物麻醉(100 μg氯胺酮+ 10 μ在10 g甲苯噻嗪 μL盐水/ g),然后用生理盐水灌注transcardially,其次是4%多聚甲醛(PFA Sigma-Aldrich)在PBS。大脑被放置在一个瓶4% PFA在PBS 24小时在室温下,在30%蔗糖脱水,保持在4°C到分析。

 2.3。组织切片

脱水后,大脑被分组在低温恒温器12套连续冠状切片的40岁 μ米厚度(徕卡微系统)和收集在冰冷的PBS在多井菜如前所述 26]。每组包含5 - 7片覆盖整个海马体的长度,因此对应于一个整个海马的代表性样本。

 2.4。免疫荧光

Immunodetection BrdU和神经元标记组织部分进行了如前所述在[ 26]。主要抗体使用老鼠anti-BrdU (Abcam),兔子anti-doublecortin(细胞信号技术Inc .)单克隆anti-NeuN(美国Billerica的微孔,MA),兔子anti-Ki67 (Abcam),山羊anti-NeuroD1(圣克鲁斯生物技术有限公司),单克隆anti-Nestin(微孔),Alexa(分子探针,生活技术),DyLight (Abcam)共轭二次抗体。片是安装在gelatin-coated幻灯片Fluoromount-G(电子显微镜科学)。

 2.5。图像分析

量化、BrdU Ki67或DCX-positive细胞数使用荧光显微镜(奥林巴斯BX51、东京、日本)中描述( 26]。短暂,总数量的细胞数在所有部分1组脑组织(见组织切片)乘以集的总数估计BrdU的总数,Ki67或DCX-positive细胞完整SGZ (BrdU和Ki67)或GCL(克莱斯勒)。Double-labeled部分分析了通过激光共焦显微镜(奥林巴斯阵线1000)。图像分析和z-projections由ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。

APPswe / PSEN1ΔE9 DCX-positive细胞的密度估计如前所述的谎言et al。 20.)做了一些调整。短暂,GCL DCX-positive细胞数在5 - 6系列随机部分。NeuN免疫反应性被用来测量GCL体积。GCL的面积被使用ImageJ软件追踪,10倍的目标。未成熟神经元的密度是表示为克莱斯勒细胞每卷(毫米3齿状GCL的)。

 2.6。免疫印迹

海马解剖在冰和立即冻结在液态氮或加工(如前所述)( 27]。短暂,海马是均质里帕缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值7.4,5毫米EDTA, NP-40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,和1% SDS)补充蛋白酶抑制剂混合物(1毫米PMSF, 2 μg / mL抑肽酶,1 μ10 g / mL抑肽素, μg / mL苯甲脒)和磷酸酶抑制剂(25毫米氟化钠,100毫米Na3签证官4、1毫米EDTA和30 μ米纳4P2O7),在冰上保持30分钟在20000 g离心之前15分钟在4°C。蛋白质浓度在上层的决心使用BCA分析工具包(皮尔斯)。蛋白质在10% SDS /页面,解决转移到PVDF膜,与初级抗体反应在一夜之间在4°C,然后孵化peroxidase-conjugated二级抗体(皮尔斯)和使用ECL技术开发(西方闪电+ ECL, PerkinElmer)。主要的抗体使用鼠标反 β连环蛋白,兔子anti-GSK-3 β山羊anti-NeuroD1,兔抗 β微管蛋白(所有从圣克鲁斯生物技术有限公司),和兔子anti-GSK-3 βpSer9(细胞信号)。

 2.7。统计分析

使用棱镜5执行统计分析软件(GraphPad软件Inc .)。统计学意义上的差异是使用未配对学生的评估 t 以及;分析了非正规的分布式数据使用Mann-Whitney测试。每组动物的数量在每个实验显示在图的传说。

 3所示。结果 3.1。穿心莲内酯刺激细胞增殖的SGZ成年老鼠

探讨穿心莲内酯在成人海马神经发生的影响,我们首先分析了在SGZ药物对细胞增殖的影响。两个月大的老鼠注射ip 2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制,4周每周3次。在治疗的最后一天,动物也收到ip注入一剂的核苷酸模拟BrdU(100毫克公斤−1),牺牲了注射后24小时。细胞增殖的效应是调查核整合BrdU(图 1(一))和Ki67染色(图 1 (b))有丝分裂标志。BrdU免疫反应性显示有显著增加的总数BrdU-positive SGZ ANDRO-treated小鼠细胞(图 1(一))控制老鼠相比注射车辆(1726±196控制:穿心莲内酯:2554±275; P = 0.027 )。也有显著增加SGZ Ki67-positive细胞的总数与穿心莲内酯治疗组小鼠相比,控制老鼠(图 1 (c)穿心莲内酯、控制:2341±86:3711±344; P = 0.001 )。这些结果表明,穿心莲内酯刺激增殖SGZ成年老鼠的。

穿心莲内酯诱发成年小鼠齿状回的增殖。两个月大的老鼠注射ip 2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制4周每周3次,单剂量100毫克公斤−1BrdU治疗的最后一天,牺牲后24 h BrdU注入。(一)图像显示代表BrdU组织化学染色。酒吧规模:50 μm。图显示BrdU-positive总数(BrdU +)细胞在整个SGZ控制,ANDRO-treated老鼠。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 7 老鼠)。(b)代表Ki67组织化学染色和NeuN。酒吧规模:100 μm。(c, d)的总数Ki67-positive SGZ (Ki67 +)细胞的控制和ANDRO-treated丽江(c)和10个月大的老鼠(d)。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 7 (c)和 n = 5 (d)老鼠)。 P ∗ < 0.05 , P ∗ ∗ < 0.01 ,学生的 t 以及。

同时,我们评估了穿心莲内酯对细胞增殖的影响在老鼠岁10个月展示水平的神经发生减少由于老年性神经发生在几个种类下降( 28- - - - - - 31日]。这些小鼠腹腔注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制,4周每周3次;扩散在SGZ被Ki67染色评估。正如预期的那样,有一个强大的下降与2-month-old-mice Ki67-positive细胞相比,10个月大的老鼠(数字 1 (c)和 1 (d)),有一个显著增加的总数Ki67-positive细胞在小鼠接受穿心莲内酯(图 1 (d)控制: 269年 ± 12 穿心莲内酯: 470年 ± 54 ; P = 0.011 )。总之,这些结果表明,穿心莲内酯增加细胞增殖在年轻和老年小鼠的齿状回。

 3.2。穿心莲内酯会增加成年小鼠海马神经祖细胞的增殖

BrdU——和Ki67-positive细胞数量的增加可能导致增加增殖的神经祖细胞或成神经细胞。评估是否静止神经祖细胞是细胞穿心莲内酯的目标,我们评估Ki67 SGZ内Nestin-positive细胞染色(图 2)。巢蛋白表达的是一个中间丝状体神经祖细胞而不是成神经细胞( 32, 33]。老鼠接受2毫克公斤−1穿心莲内酯为4周显示显著增加的巢蛋白+ Ki67 +细胞相比,vehicle-treated动物(图 2控制: 584年 ± 112年 穿心莲内酯:1956±343; P = 0.0191 ),表明药物诱导SGZ神经祖细胞的激活。

穿心莲内酯诱导SGZ神经祖细胞的增殖。代表Ki67组织化学染色和巢蛋白在两个月的老老鼠每4周治疗2毫克公斤−1穿心莲内酯或生理盐水作为控制。比例尺:10 μm。图代表总数的量化Ki67-positive / Nestin-positive SGZ (Ki67 +巢蛋白+)细胞。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 3 老鼠)。 P ∗ < 0.05 ,学生的 t 以及。

 3.3。穿心莲内酯会增加成年老鼠的齿状回神经发生

评估是否穿心莲内酯治疗诱导新神经元的生成在成年人的齿状回,首先我们进行immunodetection未成熟神经元的标记doublecortin(克莱斯勒)。强烈的不成熟的阳性神经元的密度增加观察克莱斯勒的齿状回丽江小鼠治疗4周2毫克公斤−1穿心莲内酯与控制老鼠注射了车辆(数字 3(一个)和 3 (b))。Immunodetection克莱斯勒也在10个月大的老鼠接受了同样的治疗(图 3 (c))。与年龄相关性下降的神经发生,协议有一个明显的减少不成熟DCX-positive神经元的密度与丽江动物相比,老鼠岁10个月(比较数据 3(一个)和 3 (c))。在10个月大的老鼠,穿心莲内酯治疗诱导显著增加GCL DCX-positive细胞的总数相比,控制老鼠注射汽车解决方案(图 3 (c)穿心莲内酯、控制:1246±108:2141±250; P = 0.008 )。

穿心莲内酯未成熟神经元的密度增加成年老鼠的齿状回。(一)代表克莱斯勒组织化学染色,在丽江老鼠车或穿心莲内酯治疗,疗程4周。酒吧规模:50 μm。(b)更高放大的代表克莱斯勒在控制和免疫染色ANDRO-treated老鼠。比例尺:30 μm。(c)代表图像双重免疫染色的克莱斯勒和NeuN 10个月大的老鼠车或穿心莲内酯治疗,疗程4周。酒吧规模:100 μm。图量化DCX-positive总数(克莱斯勒+)细胞GCL 10个月大的老鼠。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 5 老鼠)。 P ∗ ∗ < 0.01 ,学生的 t 以及。

进一步评估是否穿心莲内酯诱导神经发生净增长,2个月大的老鼠注射ip 2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制,每周3次,2周,然后每天收到ip注入100毫克公斤−1BrdU连续3天,然后继续注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆每周3次4周(图 4(一))。因为它是观察治疗4周(图 1 (c)),经过6周的治疗有显著增加的总数SGZ Ki67-positive细胞的老鼠用穿心莲内酯治疗与控制老鼠(图 4 (b);控制:1784±86,穿心莲内酯:2888±152; P = 0.0049 ),支持药物对细胞增殖的影响。评估神经发生的影响,我们评估新生儿总数的颗粒细胞通过分析BrdU-positive总数为成熟的神经细胞,也积极NeuN标志。这是评估通过共焦显微镜使用z平面部分评估每个BrdU-positive NeuN染色细胞(图 4 (c)insets)和BrdU + NeuN +细胞的总数估计在整个齿状回 26]。中可观察到显著增加BrdU + NeuN +细胞总数GCL的老鼠用穿心莲内酯治疗与控制老鼠(图 4 (d)控制: 477年 ± 84年 穿心莲内酯:1023±108, P = 0.0286 ),表明穿心莲内酯的生成增加新的颗粒在齿状回神经元。总之,这些发现表明,穿心莲内酯增加成人海马神经发生。

穿心莲内酯会增加新生的一代成年小鼠的海马颗粒细胞。(一)实验过程的示意图表示。两个月大的老鼠注射ip 2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制每周3次2周,然后每天收到ip注入100毫克公斤−1BrdU连续3天,继续治疗4周。(b)代表Ki67组织化学染色和NeuN经过6周的治疗。酒吧规模:100 μm。图代表总数的量化Ki67-positive SGZ (Ki67 +)细胞。(c)代表BrdU组织化学染色和NeuN。double-positive细胞的Insets显示更高的放大。酒吧规模:50 μ米(d)量化总数的double-positive GCL (BrdU + NeuN +)细胞控制,ANDRO-treated老鼠。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 4 老鼠)。 P ∗ < 0.05 ,学生的 t 以及。

 3.4。穿心莲内酯刺激Wnt / <斜体>β< /斜体>连环蛋白信号通路在成年小鼠的海马

我们先前表明,穿心莲内酯抑制GSK-3的活动 β( 9),Wnt /的一个组成部分 β连环蛋白信号通路的激活途径的抑制,从而防止其目标的磷酸化 β连环蛋白核易位到的激活Wnt目标基因的转录 34]。我们评估Wnt信号通路的激活海马的丽江小鼠腹腔注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制,4周每周3次。正如预期的那样,我们观察到显著增加 βANDRO-treated动物的海马连环蛋白水平与控制老鼠(图 5(一个)),与此同时增加GSK-3的活动形式 β磷酸化在serine-9残渣(图 5(一个))。此外,我们评估的水平NeuroD1这是一个转录因子参与了胚胎和成年大脑的神经发生( 35]之前确认为Wnt目标基因( 24]。NeuroD1水平的显著增加是ANDRO-treated老鼠的海马(图中观察到 5 (b))。这一增长也观察到疣状(图 5 (c)),NeuroD1 DCX-positive主要是观察到的细胞,如前所述[ 35]。总之,这些发现表明,穿心莲内酯诱导激活Wnt / β连环蛋白信号通路在成年小鼠的海马。

穿心莲内酯诱发Wnt信号通路的激活在成年小鼠的海马。(一)免疫印迹 β连环蛋白,GSK-3的活动形式 β(磷酸化serine-9 pSer9),总GSK-3 β, β微管蛋白作为加载控制总蛋白提取从丽江老鼠的海马注射获得ip 2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制4周每周3次。图对应的光密度分析 β连环蛋白和GSK-3 βpSer9规范化, β微管蛋白和总GSK-3 β,分别。(b) NeuroD1和免疫印迹 β微管蛋白。图对应的光密度分析NeuroD1规范化 β微管蛋白的水平。(c)代表NeuroD1组织化学染色,克莱斯勒,NeuN老鼠车或穿心莲内酯治疗,疗程4周。酒吧规模:20 μm。底部,更高的放大的图像。酒吧规模:20 μm。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 4 老鼠)。 P ∗ < 0.05 , P ∗ ∗ < 0.01 , P ∗ ∗ ∗ < 0.001 ,学生的 t 以及。

 3.5。穿心莲内酯增加齿状回上神经发生APPswe / PSEN1ΔE9老鼠

最后,我们评估了穿心莲内酯对神经发生的影响在APPswe / PSEN1ΔE9转基因小鼠模型的广告展示了一个受损的神经发生( 26]。这些双转基因动物表达人类淀粉样前体蛋白(APP)瑞典突变(K595N / M596L)和presenilin 1删除外显子9和显示广告的组织病理学特征(比如,一个 β淀粉样斑块沉积,astrogliosis和τ病理学)和认知障碍的7个月大的时候( 27]。我们确定在这个年龄动物显示SGZ显著减少细胞增殖并展示一个受损的新生细胞的分化DCX-positive成神经细胞( 26]。APPswe / PSEN1ΔE9小鼠在7个月ip注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制,4周每周3次。扩散在SGZ被Ki67染色(图评估 6(一))。穿心莲内酯治疗强烈诱导扩散由Ki67-positive细胞数量的增加(APPswe / PSEN1ΔE9控制: 96年 ± 37 APPswe / PSEN1ΔE9穿心莲内酯 256年 ± 32 ; P = 0.05 )。此外,不成熟的DCX-positive神经元的密度增加小鼠观察穿心莲内酯治疗相比,控制基因转移获得车辆注射(图 6 (b)),这表明APPswe / PSEN1ΔE9药物诱导神经发生。

穿心莲内酯刺激增殖和成熟的齿状回神经元的密度APPswe / PSEN1ΔE9。7个月大APPswe / PSEN1ΔE9小鼠腹腔注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制每4周每周3次。(一)图像Ki67的双重免疫染色和NeuN代表。图表显示了Ki67-positive总数的量化(Ki67 +)细胞(黄色箭头)在老鼠的SGZ处理车辆或穿心莲内酯。酒吧规模:20 μm。(b)图像显示代表克莱斯勒和NeuN双重免疫染色。酒吧规模:20 μm。图的密度差异不成熟DCX-positive(克莱斯勒+)神经元控制和ANDRO-treated APPswe / PSEN1ΔE9老鼠。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 3 (一)或 n = 5 老鼠(b))。 P ∗ < 0.05 ,学生的 t 以及。

在这些老鼠,我们也评估Wnt目标基因NeuroD1(图 7(一))。正如我们以前观察到在12个月大的转基因小鼠 8),水平的提高 β连环蛋白和GSK-3 β磷酸化在APPswe / PSEN1ΔE9 serine-9观察小鼠接受穿心莲内酯与控制老鼠(图 7 (b))。此外,和野生动物(图中观察到 5 (b))、穿心莲内酯治疗诱导的NeuroD1水平显著增加海马APPswe / PSEN1ΔE9老鼠(图 7 (c))。

海马体的雄烯二酮增加NeuroD1 APPswe / PSEN1ΔE9。7个月大APPswe / PSEN1ΔE9小鼠腹腔注射2毫克公斤−1穿心莲内酯或车辆控制每4周每周3次。(一)免疫印迹 β连环蛋白,GSK-3的活动形式 β(磷酸化serine-9 pSer9),总GSK-3 β、NeuroD1和 β肌动蛋白在总蛋白提取得到控制和海马体的ANDRO-treated APPswe / PSEN1ΔE9老鼠。(b)的光密度分析 β连环蛋白和GSK-3 βpSer9规范化, β微管蛋白和总GSK-3 β,分别。(c)的光密度分析NeuroD1规范化 β微管蛋白。酒吧代表的意思是±S.E. ( n = 3 老鼠)。 P ∗ < 0.05 , P ∗ ∗ < 0.01 , P ∗ ∗ ∗ < 0.001 ,学生的 t 以及。

 4所示。讨论

新神经元的生成在海马体成年已经决定在几个物种和显示为海马体的可塑性和一些海马过程包括空间学习和记忆( 17, 19]。这个过程被破坏在一些病理影响中枢神经系统(如广告、精神分裂症、心境障碍)也在正常老化的影响( 30., 36];神经发生的减少有关,例如,认知缺陷与这些条件;因此,它很容易寻找新方法来刺激大脑这个过程在正常和病变。在这里,我们评估穿心莲内酯的能力,药用植物的有效成分之一 穿心莲香,刺激神经发生,表明,穿心莲内酯诱导增殖和新神经元的生成成人海马齿状回的野生型老鼠和一只老鼠的广告模式。

在成年人的齿状回,在不断产生新的颗粒细胞神经祖细胞位于GCL和门之间。激活后,这些细胞产生的祖细胞或中间祖细胞,然后提交到神经元命运产生成神经细胞发展成不成熟的神经元树突扩展到GCL和分子层和项目的轴突CA3区域( 16]。这些新生神经元会成熟在几个星期功能齿状颗粒神经元形成突触连接,成为集成到海马电路( 37, 38]。我们确定,穿心莲内酯治疗4周刺激增殖SGZ和未成熟神经元的GCL的密度增加。我们的研究结果表明,穿心莲内酯增加静止神经祖细胞的激活,强烈建议这些细胞穿心莲内酯活动的目标。有趣的是,穿心莲内酯对扩散的影响和未成熟神经元观察小鼠年龄在2个月的治疗,也在10个月大的老鼠神经发生的显著降低。海马神经发生年龄相关性下降已经证明在不同的物种包括人类 28- - - - - - 31日];然而,研究表明,甚至可以刺激神经发生衰老的高级阶段。穿心莲内酯在10个月大的老鼠的效果表明,这种药物可以刺激受体在神经发生。此外,我们发现穿心莲内酯诱导神经发生的净增加。成熟神经元标记由新生神经元的表达需要大约4周( 16];我们确定,穿心莲内酯的总数增加新生细胞表达成熟神经元标记NeuN BrdU(4周后评估管理),表明药物诱导新生总数增加净颗粒神经元。总之,这些发现表明,穿心莲内酯刺激成人海马神经发生。

穿心莲内酯在神经发生的影响可能涉及GSK-3的抑制 β。我们最近决定,穿心莲内酯抑制GSK-3 βsubstrate-competitive模式的行动 9]。有趣的是,穿心莲内酯显示了GSK-3高选择性 β,因为它没有影响细胞周期蛋白依赖性激酶5 (Cdk5), Ca2 +/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CaMKII),细胞外signal-regulated激酶(ERK) c-Jun n端激酶(物)、蛋白激酶C (PKC),一种蛋白激酶,酪蛋白激酶(CK)、S6激酶( 9]。由GSK-3刺激神经发生 β抑制报道 在体外和 在活的有机体内。治疗成人海马与GSK-3祖细胞培养 β抑制剂诱导锂扩散( 39), 在活的有机体内锂盐治疗的诱导增殖和海马的神经元命运规范广告的小鼠模型( 40]。此外,受损神经发生在GSK-3敲入小鼠携带突变阻止抑制磷酸化的激酶 41)和小鼠overexpressing GSK-3 β( 42)也显示新生神经元形态变化( 43]。因此,它可能是通过抑制GSK-3穿心莲内酯可能刺激神经发生 β。其他机制与穿心莲内酯的生物效应包括抑制PI3K / Akt和NF - κβ通路( 44- - - - - - 46]。正如前面提到的,我们之前确定穿心莲内酯对Akt活动没有影响( 9),由于抑制NF - κβ信号通路与受损有关成人海马神经发生( 47, 48),不太可能积极的穿心莲内酯对神经发生的影响可能涉及这些瀑布。

如前所述,GSK-3 β是一个关键组成部分Wnt / β连环蛋白信号通路,几所示 在活的有机体内研究调节增殖、分化和成熟的adult-born颗粒神经元( 20.- - - - - - 22, 24]。通过抑制GSK-3 β,穿心莲内酯是一种有效的催化剂的Wnt信号通路 9]。在这里,我们认为与神经发生的增加穿心莲内酯诱导Wnt /治疗 β连环蛋白信号通路在成年小鼠海马区,由增加 β连环蛋白的水平增加蛋白质和GSK-3的活动形式 β。另外,我们观察到NeuroD1水平增加,先前描述的Wnt目标基因( 24]所需的生存和成熟adult-born神经元。因此,它可能表明,穿心莲内酯的影响可能由Wnt信号通路的激活和颈板Wnt目标基因的表达,如NeuroD1。有趣的是,增加水平NeuroD1也观察到ANDRO-treated APPswe / PS1ΔE9老鼠。在小鼠模型的广告,显示减少的增殖水平SGZ和减少神经祖细胞分化成神经元与野生型小鼠相比,( 26, 49),我们决定,穿心莲内酯治疗诱导SGZ几乎三倍增加细胞增殖。我们观察到这样一个强大的效应细胞增殖在这转基因小鼠暴露于自愿轮运行( 50),这是一个著名的神经发生在年轻和老年小鼠的有力电感器 51, 52]。同时,我们确定,穿心莲内酯治疗未成熟神经元的密度增加APPswe / PS1ΔE9老鼠,表明药物诱导神经发生。

 5。结论

在目前的研究中,我们已经表明,穿心莲内酯,药用植物的活性成分 穿心莲香,促进成人海马神经发生。此前,穿心莲内酯显示神经保护效应在永久性脑缺血大鼠模型 6)和尼古丁引起的氧化损伤( 7];此外,APPswe / PS1ΔE9小鼠模型的广告,穿心莲内酯预防神经病理变化与疾病和改善空间记忆( 8]。在这里,我们表明,穿心莲内酯诱导增殖和新神经元的生成在成年人的海马的野生型和APPswe / PS1ΔE9老鼠,提供新的证据表明穿心莲内酯作为脑部疾病的潜在治疗药物治疗。

 利益冲突

所有作者声明非金融相互竞争的利益。

 确认

这项工作由拨款支持FONDECYT (N 1150933°)罗瑞拉Varela-Nallar和由FONDECYT (N 1120156°)和基底科技卓越中心(CONICYT-PFB12/2007) Nibaldo Inestrosa。

 张 h . 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