1。介绍
神经生物学的研究长期的变化影响压力事件后发生兴趣,兴趣加剧了这一事实可怕事件可能沉淀情感精神疾病(
1 ,
2 ]。在极端情况下,一个厌恶的体验可能会引起创伤后应激障碍(PTSD) (
3 ,
4 ]。动物模型是有用的增进了解压力对大脑和行为的影响,允许模拟人类在控制环境允许无序发展的研究。条件性恐惧范例,行为在不熟悉的情况下恐惧或焦虑,而最近,捕食者的压力,所有的模型被用来理解神经生物学的可怕事件影响的影响。
捕食者的压力在我们的手中包括保护暴露一只老鼠一只猫(
5 ]。捕食者PTSD的压力可能模型方面有几个原因。首先,捕食者的压力由于自然生态效度威胁掠夺自然的压力。第二,焦虑影响的持续时间在老鼠捕食者压力,寿命比,与DSM IV时间所需的精神病理诊断为慢性PTSD。第三,捕食者压力有神经生物学的脸有效性对杏仁核和海马电路与捕食者产生的行为变化的压力,而这些地区是一致的大脑区域被认为参与了创伤后应激障碍(
6 - - - - - -
9 ]。例如,脑成像涉及兴奋过度的右侧杏仁核在脚本驱动的创伤提醒在创伤后应激障碍的病因
10 - - - - - -
14 ]。第四,并行路径分析研究使用的数据来自越南退伍军人患有创伤后应激障碍和捕食者强调啮齿动物的研究发现,在人类和啮齿动物,压力源的特点预测焦虑的水平(
6 ]。例如,在捕食者强调动物,猫咬收到越多,级别越高的焦虑测量一周后。最后,类似的惊吓持久的惊吓和习惯的变化都在捕食者强调老鼠和人类与创伤后应激障碍(
6 ,
15 - - - - - -
18 ]。
捕食者压力是害怕激怒和压力(
19 - - - - - -
22 ]。此外,猫接触产生持久的焦虑行为增加老鼠(铝青铜)
5 ,
23 ),一些行为变化持续三个星期或更长时间(
5 ,
6 ,
24 ]。捕食者的行为影响压力一直在评估数量的测试包括孔板、高架+迷宫(EPM),无条件声惊吓,光/暗框,和社会互动。Anxiogenic NMDA receptor-dependent捕食者的压力的影响。系统性管理的竞争性和非竞争性NMDA受体拮抗剂30分钟前,而不是30分钟之后,捕食者压力防止铝青铜的持久变化(
16 ,
25 ]。此外,当地的NMDA受体在杏仁核防止食肉动物应激增加铝青铜(
26 ]。
除了行为变化,杏仁核传出和传入神经传输后改变了捕食者的压力。具体来说,捕食者的压力导致长期势差现象在神经传输从右侧杏仁核(中央nucleus-CeA)向右横向列的中脑导水管周围灰质(PAG),并通过正确的腹侧角从海马体包(还有VAB)向右基底外侧杏仁核(BLA) [
9 ,
23 ,
27 ]。此外,增强作用在这些途径NMDA receptor-dependent [
7 ]。此外,NMDA受体拮抗剂产生anxiolytic-like效果当microinjected背外侧PAG [
28 ,
29日 ]。PAG也牵连在啮齿动物铝青铜
30. ),和被捕食者激活压力(
31日 ]。这些数据表明NMDA receptor-dependent长期势差(LTP)——杏仁核变化传入和传出传输后掠食者压力导致的持久anxiogenic影响猫接触(
7 ,
9 ,
16 ]。支持这个结论的发现杏仁核的传入和传出LTP-like变化高度预测的严重程度变化的捕食者的压力(后铝青铜
9 ,
23 ,
27 ]。
捕食者压力诱导改变铝青铜和杏仁核神经传输都伴随着营地磷酸化反应元件结合蛋白的变化(pCREB)。具体来说,pCREB-like-immunoreactivity (lir)是basomedial升高(BM), BLA,东航,横向(La)杏仁核在捕食者相比,压力控制老鼠(
32 ]。这是符合海拔pCREB-lir强迫游泳应激后的杏仁核(
33 ,
34 ),小鼠的恐惧调节(
35 ),检索cued-fear记忆(
36 ),和电击
37 ]。除了杏仁核,捕食者压力增大pCREB-lir PAG的正确的侧列(lPAG) [
23 ]。
如前所述,NMDA受体对抗捕食者之前压力块增加铝青铜和杏仁核的传入和传出神经传输的强化。因为分子的磷酸化可能由NMDA受体(
38 ,
39 )和后pCREB-lir增加捕食者的压力(
23 ,
32 ],NMDA受体是否对立的问题可以阻止捕食者压力诱导增强pCREB-lir最近测试。阻断NMDA受体竞争性阻断剂,CPP, 30分钟前捕食者的压力,使压力诱导增加pCREB表达式在杏仁核,和右lPAG [
40 ]。的重要性,同样的剂量政权也块捕食者压力影响影响和杏仁核的传入和传出传输(
7 ,
16 ,
25 ,
26 ]。
这些发现提供了令人信服的证据表明,捕食者的压力诱导增加pCREB是一个重要的贡献者捕食者强调啮齿动物的大脑和行为的变化。本研究的目的是直接操纵分子和pCREB表达式来证实这一观点。
当地可以实现大脑中的基因表达的变化与病毒引导方法的重组基因直接进入神经元(
41 ]。有各种各样的病毒载体,但单纯疱疹病毒(HSV)的几个特征使它理想的候选人。无毒的复制缺陷HSV向量能够感染大多数哺乳动物的分化的细胞类型,它接受非常大的插入,并在感染神经元,效率高是自然神经营养(
41 ,
42 ]。最早的研究利用该方法并应用到啮齿动物焦虑测试发现,HSV矢量表达式BLA增加分子的行为措施的焦虑在开放的现场试验和EPM,和增强暗示恐惧条件反射(
43 ]。
本研究旨在测试的功能意义pCREB PAG对侧列内的变化。为此我们基因诱导表达的增加分子的lPAG HSV向量和确定这些操作行为的影响和杏仁核传出传输(CeA-lPAG)。我们转染的神经元对PAG的地方pCREB和CeA-PAG传输升高后掠食者压力(见Adamec et al。
8 ,
23 ])。
2。方法
2.1。伦理批准
程序涉及动物报道综述了本文的制度纪念大学动物保健委员会和发现符合加拿大动物保护协会的指导方针。是尽一切努力减少疼痛和压力测试,同时使用尽可能少的动物。
2.2。动物
受试者雄性老鼠连帽长埃文斯(Charles River加拿大)。老鼠被单独安置在清晰的聚碳酸酯笼子46厘米
×
24厘米
×
20厘米的任何测试之前一个星期。在本周,老鼠适应于笼子,和处理。处理涉及拿起老鼠和前臂轻轻握住它。最小压力如果老鼠试图逃脱,使用和控制老鼠就成了仍然被释放。老鼠在同一个房间处理家里笼在工作日每天一分钟长的适应期。老鼠有食物和水
没有限制地 和暴露在12小时光/暗周期与灯在7点。老鼠体重在230 - 280年间约200 g的到来和g当天测试。
2.3。组
实验室适应和处理后,12个受试者被随机分配到三组,每组4队之一。一组作为处理控制(GFP)处理,而另一个是捕食者强调(捕食者强调GFP)。这两个组注入正确的横向PAG(在下面描述)HSV-GFP向量,然后再进一步治疗。这个向量由HSV病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)基因,记者使用可视化矢量位置和病毒诱导的基因表达。这也注入了控制,GFP本身可能有任何影响。第三组也处理(处理分子)和进一步治疗注射之前正确的横向PAG HSV-CREB向量。这个向量包括分子和GFP基因。基因表达的GFP担任记者,和分子基因分子水平升高在目标区域。
是认识到一群大小四个小的这种性质的行为研究。小的数字被病毒的可用性需要。小群体大小的影响是进一步解决的部分。
2.4。外科Microinfusion病毒载体
病毒注射做对PAG的侧栏,pCREB增加捕食者强调老鼠一直在观察(
23 ,
32 ,
40 ]。涉及降低无菌注射25计针连接微升注射器进入大脑使用sterotaxically微升注射器安装支架。根据阿特拉斯的坐标microinfusion Paxinos和沃森(
44 ),前囱6.3毫米后,0.5毫米侧中线,5.5毫米以下头骨。注入0.5
μ
L(浓度为4.0
×
107 传染性单位/毫升提供来自得克萨斯大学西南医学院)的速度是0.5
μ
L与针每五分钟离开五分钟后注射。这一剂量率来自经验和我们中的一个(伯顿)的向量。此外,与HSV-GFP试点研究,0.5
μ
l注入以这种速度产生GFP表达本地化PAG的右边侧列在AP飞机的范围。在注射后3天7毫米,最大的时间引起的蛋白表达这个向量(
43 ,
45 ]。
下注射进行水合氯醛麻醉(400毫克/公斤,IP)使用无菌技术。Preanaesthetic剂量的阿托品有(1.2毫克/公斤)。局部麻醉的伤口边缘实现marcaine和肾上腺素(2%)注入并根据需要补充。洞头骨被关闭与无菌凝胶泡沫和密封的无菌骨蜡和头皮伤口缝合。老鼠保暖灯柱下手术,直到他们开始和新郎走,在这段时间里,他们被回到家中笼子。为每个主题手术花了大约一小时。
2.5。猫接触和处理程序
三天后病毒(HSV)注射,当病毒表达(见顶
43 ,
45 ),老鼠处理或捕食者的压力。当天的测试,捕食者强调老鼠暴露在其他地方所描述的成年猫一样(
5 ]。猫暴露持续了10分钟,录像捕捉猫和鼠的活动。猫通常在远处观察老鼠的间歇方法和嗅探。有时,猫会轻度攻击老鼠但没有受伤。在测试结束时,老鼠被回国内凯奇和安静的离开了。其他两组的老鼠,其治疗包括只处理没有接触到猫,猫的气味或老鼠曾暴露于猫。当天的测试后,老鼠在这些组体重和处理后1分钟。正如前面提到的这段处理老鼠笼子回到他们的家,安静的离开了。处理和捕食者强调老鼠笼中分别保存在单独的房间里。
2.6。行为测试和行为的措施
四天后HSV注入和治疗后的一天,铝青铜在孔板测量,按照项目和惊吓测试。孔板测试之前发生的EPM作为一个独立的测试活动和探索性的趋势(
46 ]。
2.6.1。孔板和高架迷宫测试和措施
孔板和EPM建造和使用所述其他地方(
5 ]。老鼠在洞里的行为,按照项目是远程录像供以后分析。老鼠首先放置在板5分钟。这个时期结束时他们被带手套的手转移进一步的EPM 5分钟的测试。最后这段测试老鼠笼子回到他们的家。
活动和探索的若干措施被当老鼠在洞里。他们包括饲养的频率(活动),头下降,一定程度的探索性倾向得分当老鼠把它的鼻子或进入一个洞在地板上。粪便勃利沉积也计算在内。趋触性的测量时间附近墙上的孔板。这项措施被量化为鼠有四英尺之间的空间洞头浸渍和墙上。中心的时间举行董事会也记录下来。一只老鼠被认为是在中间当所有四英尺的中心空间定义为一个正方形画通过盒子的四个地板上的洞。
EPM,探索和活动得分为条目的数量到封闭的迷宫(封闭的手臂条目)。只有一个条目时记录里面的老鼠都四英尺迷宫的一只胳膊。其他措施的探索包括头下降,得分当一只老鼠把它的鼻子或在开放的手臂,和饲养的测量活动。这些行为被分成三种类型:保护(老鼠都在闭臂四英尺饲养或后腿在闭臂头下降),中心(老鼠在迷宫的中心有四英尺),和不受保护的(老鼠有四个脚在一个开放的手臂)。时间打扮也使用相同的记录三个细分。
的焦虑行为也采取措施。两项措施评估开放臂探索:比时间和比条目。比时间所花费的时间在迷宫的张开双臂除以总时间的迷宫。比率越开放越小胳膊勘探表明一个更“焦虑”老鼠。比率是条目的数量进入迷宫的张开双臂除以总条目到任何的迷宫。比例越小,开放臂勘探经验越少,越“焦虑”老鼠。
Adamec和浅
5 适应)是第一个按照项目风险评估的概念。这一措施得分时,老鼠和脚掌的探出头来进入开放臂迷宫的同时保持后腿在一个封闭的手臂。风险评估的频率测量和转换为相对风险评估这些频率除以时间花在封闭的武器。粪便勃利存入EPM也计算在内。
2.6.2。惊吓测试和措施
惊吓的测试是在同一天进行董事会和EPM的洞。惊吓反应是决定使用一个标准的惊吓室(圣地亚哥仪器)。设备是配备了一个20.32厘米有机玻璃筒用于保存动物在测试期间,以及扬声器产生声音。下面一个压电换能器定位气缸的气缸检测到运动动物。这个传感器的输出采样反馈给电脑。
惊吓测试之前,动物适应仪器背景白噪声水平的10分钟60分贝。然后老鼠受到40试验(1/30秒)的50毫秒的120分贝的白噪声背景下上升60分贝。一半的试验是在室黑暗而另一半了一篇光(光强度28英尺蜡烛或300勒克斯)。光试验随机散布在黑暗的试验。光试验期间,灯光会在2.95秒前声音破裂,期间保持声音破灭,终止在“声音抵消(灯总共3秒)。美国商会之间在黑暗中试验。一台电脑连接到传感器记录40样本的输出。样品包括20毫秒基线和发病后250毫秒采样噪声破裂。平均换能器输出噪声破裂之前保存为基线(
V
开始
)。计算机随后发现的最大惊吓振幅在每个样本(
V
马克斯
)。这些措施都是保存供以后分析。惊吓峰值振幅表示为
V
马克斯
- - - - - -
V
开始
进行分析。惊吓的会话结束时老鼠笼子回到他们的家。之间的设备被老鼠。
2.7。电生理记录程序
五天后HSV注入和两天治疗后,所有老鼠都与氨基甲酸乙酯麻醉(1.5克/公斤),分三次由10分钟。然后老鼠放在一个sterotaxic仪器下头皮注射marcaine肾上腺素(2%),局部麻醉,减少出血。头骨被曝光和孔钻允许stereotaxically引导刺激电极插入中央杏仁核(CeA)。微电极记录被放置到PAG。刺激和记录电极对被安置在两个半球。此外,头骨螺丝被放置在嗅球作为地面和引用。刺激电极被扭曲的双相不锈钢(直径0.125毫米,塑料)旨在CeA。记录电极不锈钢微电极(1
μ
齿顶圆直径,0.6 - 1 MΩ,弗雷德里克·哈),旨在PAG(验证坐标出现在桌子上
1 )。老鼠被放置在屏蔽盒刺激和记录实验。温度保持在36 - 37
°
C
由直肠热敏电阻连接到一个数字温度计和反馈控制直流加热垫(弗雷德里克ha)老鼠。东航是使用一个两相的恒流脉冲刺激(宽度。2毫秒)在1/5秒的强度(.025 - 2.5 mA), 10刺激/强度。诱发电位被计算机,后来分析采样数据存储在计算机使用DataWave软件(参见Adamec et al。
27 ]为进一步方法细节)。
表1
意味着(SEM)在集团和半球电极坐标平均。
大脑区域
的意思是
扫描电镜
东航美联社
2.37
0.036
东航侧
3.98
0.037
东航垂直
7.92
0.027
PAG美联社
6.1
0.061
PAG侧
0.33
0.02
PAG垂直
5.62
0.034
记者:前后平面(毫米前囱后面);横向:横向平面(mm侧中线);垂直:垂直面(毫米低于前囱);东航:中央杏仁核;PAG:中脑导水管周围灰质
记录结束时,老鼠过量与水合氯醛(1000毫克/毫升,1毫升,IP)和灌注冷Para-formaldehyde磷酸盐缓冲盐水和4%。大脑被提取,沉没在20%蔗糖隔夜−4
°
C
然后储存在−70
°
C
。随后大脑病理检查对电极位置,在绿色荧光显微镜观察GFP生产和免疫组织化学研究pCREB表达式。
2.7.1。电生理学分析方法
诱发电位的大小的主要措施是峰高(PH)。各强度峰高被计算机从领域潜在的平均值如图
4 。原始的PH值在每个强度表示为一个比PH值观察到阈值(见[
23 ,
27 ])。
2.8。免疫细胞化学
厚厚的冰冻日冕部分(40
μ
m)从5.8减少到6.8毫米后,前囱[
44 PAG)来捕获相同的地区的研究在过去的捕食者压力实验,和捕获目标的病毒注入和电生理记录。前后(美联社)平面位置确定通过计算部分的交叉前连合(美联社从前囱−0.26,
44 所需的美联社平面])。这个计算的部分允许美联社平面位置的估计最近的40岁
μ
在切割。每个第二部分保存,提供12个部分从每个大脑进行处理。以确保均匀分布三的倍数的大脑(每组一个大脑)被切断,并在同一时间处理。
切片后,从每组一段是放置在一个塑料管一端与尼龙覆盖,然后沉浸在一个塑料含有磷酸盐(PBS)。每个管包含三个部分,同时进行处理。管子被玷污,淹没在一个解决方案的正常山羊血清和特里同x - 100和放置在一个摇臂1小时。部分是用PBS,玷污和孵化−4
°
C
24或48小时(重用抗体)的主要磷分子抗体(北部/ Chemicon)。符合过去的工作(
23 ,
32 ),1/500的主抗体的稀释使用。孵化后,部分与PBS再次清洗,涂抹,然后沉浸在二级生物素化的抗体(山羊antirabbit) 1 h。部分被清洗,涂抹,放置在ABC(向量污点工具包)解决方案1 h摇臂。最后,部分与PBS第三次清洗,涂抹,淹没在diaminobenzadine做最小的(DAB)解决方案,监测染色。部分然后再用PBS,安装到幻灯片之前,脱水和下滑。
2.8.1发布。图像分析(微)
彩色部分分析了忽视组分配使用图像分析软件(MOKA软件,Jandel)。半球分别测定。PAG分为腹侧、背侧和外侧区域,以反映Depaulis Bandler和描述的功能柱状组织(
47 ]。这样做是使用外侧渡槽作为指南。水平线被来自顶部的渡槽PAG的外边缘和底部的外边缘的渡槽PAG的左右半球(参见[
23 ])。顶部部分被认为是背PAG,中间部分是横向PAG腹PAG和底部部分。
生pCREB lir微数据的每一列在每个半球被转换为光密度(OD)单位相对于整个部分。这样做是将整个生PAG和生节微数据OD楔形单元通过校准步骤。图像的校准步骤楔拍摄的同时为每个大鼠部分图像。指数符合原始传输值(
x )校准OD值由计算机(表曲线程序,Jandel)。所有符合很好(df调整
r
2
>
。9
,
P < . 01)。指数被用来插入和原始传输值转换为OD单位。分析的比率平均OD值特别是PAG地区平均OD值为整个部分。
3所示。结果
3.1。EPM的焦虑行为
组不同措施的开放臂exploration-ratio时间和比例(所有条目
P (9)≥14.78,
P < .002)。捕食者的压力减少比时间和比EPM条目,与许多过去的研究(图一致
1 面板右上角,比只显示时间,比条目调查结果非常相似)。捕食者的压力减少开放臂勘探(焦虑)最相对于控制(GFP)处理。注入HSV-CREB仅在正确的PAG也是anxiogenic EPM,减少比时间和条目Handled-CREB鼠之间水平处理GFP和捕食者强调GFP老鼠(图
1 ,图基克雷默测试,
P < . 05)。
策划/组织的意思
±
SEM的EPM和孔板的行为。意味着标有不同字母(不同于对方
P < . 05)。(a),显示频率的封闭的手臂条目(左)和时间比例EPM(右)。(b),后面的频率(左)和头部下降(右)在孔板测试。
(一)
![]()
(b)
![]()
关于风险评估的频率比,尽管没有组效果(
F (9)= 2.58,
P < 13)计划
t 以及对比两个处理组的捕食者强调集团联合(没有差别)表明,捕食者的压力减少风险评估相对于两个处理组(图
2 ;
t (9)= 2.19,
P < .029,1跟踪)。这一发现减少的风险评估后掠食者压力与许多先前的研究是一致的。
图2
策划/组织的意思
±
SEM EPM的风险评估的行为。意味着标有不同字母(不同于对方
P < . 05)。
![]()
3.2。探索和活动EPM和孔板
组间没有差异在封闭的手臂条目(活动)的EPM(图
1 左面板(a))。同样,饲养组没有差别(活动)和头部下降(勘探)孔板(图
1 ,(b)两个面板)。这些数据表明,组差异在开放臂勘探的EPM并不改变活动或探索的结果。
3.3。声惊吓反应
惊吓的光明与黑暗试验没有差别,所以在光明与黑暗试验综合分析。
3.3.1。惊吓振幅
组间惊吓数据不是正态分布(综合正常测试= 148.07,
P <。)。因此,克鲁斯卡尔-沃利斯非参数方差分析方法之一的中位数惊吓峰值振幅在试验使用。组不同(
χ
2
(2)= 119.90,
P <措施)。计划比较(克鲁斯卡尔-沃利斯多重比较
z 以及
z > 3.98,
P < . 01)表明,捕食者的压力增加惊吓在处理组(图
3 左面板底部)。然而惊吓振幅处理分子老鼠也高于GFP处理,但低于捕食者强调动物(图
3 左面板,(b))。
(一个)显示例子符合(实线)的FFT平滑(20%)函数(虚线)的惊吓峰值振幅(虚线)20多个试验处理GFP控制(左)和捕食者强调老鼠(右)。在(b)策划的惊吓峰值振幅(左)和中位数
τ
±
SE
(右),从指数函数下降,估计在每个实验组大鼠。中位数和τ值标有不同字母不同(
P < . 05)。
(一)
![]()
(b)
![]()
右下角是一个计算机的平均CeA-PAG诱发电位说明如何峰高(PH)是通过计算机来衡量的。绘制图表的意思
±
SEM CeA-PAG诱发电位的PH值表示为一个阈值比PH值和强度的刺激
μ
C /脉冲(计算强度
μ
一次脉冲宽度在微秒脉冲宽度强度测量)。意味着分别策划组和在一个组分别半球。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.3.2。习惯化的声音惊吓反应
捕食者压力延长习惯惊吓(
6 ,
15 ,
16 ,
48 ]。因此,习惯在三组惊吓决心和比较。指数下降的功能形式
(1)
y
=
y
0
+
一个
e
−
t
/
τ
是适合惊吓振幅峰值平均每组20个试验的数据(结合光明与黑暗惊吓试验)使用Jandel表4.0 V曲线。在(
1 ),
y 和
y
0
惊吓振幅峰值,
一个 是一个常数,
e 自然对数的基础,
t 试验数量和吗
τ
试验常数,或试验的数量下降到37%的最大惊吓振幅峰值。改善健康,一个FFT滤波函数提供的程序应用FFT光滑(20%)。被小心地确保平滑不扭曲(图的数据
3(一个) )。所有符合很好(自由度调整
r
2
>
点
;所有符合
F (17)> 58.3,
P <措施;
t (38)≥6.18,
P < . 01所有
t 测试的差异从零的
τ
)。的估计
τ
包括标准估计误差。这些标准错误是用于执行计划正反
t 测试使用不同团体之间
τ
值(图
3 (b) 右面板)。的模式分析的结果是令人惊讶的。处理分子和捕食者强调组明显比处理GFP更长时间去适应控制。虽然这结果是预期对于捕食者强调组给定的以前的工作,处理的分子组比捕食者强调需要更长的时间去适应组异常振幅的发现。
3.4。电生理学
3方差分析方法比PH CeA-PAG诱发电位的数据。检查因素组(GFP处理控制,捕食者强调,和处理分子),半球(左、右)和强度的刺激。有一个重要的群体
x 半球
x 强度交互(
F 现年54岁的(12)= 2.24,
P < .04点)。显示在图的交互
4 。刺激强度表达
μ
C (micro-coulombs) /脉冲。所有组织都使用相同的刺激强度系列,所以组差异不能归咎于不同强度的刺激。
计划的比较
t 以及平均对比被用来检查通过比较三组的交互在每个每个半球强度。所有组显示相同的比率PH值在两个半球强度1。此外,比PH值在两个半球处理GFP控制都是平等的,在东航强度刺激(图不变
4 (c) )。同样,左半球比PH值的处理分子老鼠并没有改变在强度和PH值没有不同于比右或左半球处理GFP的控制。相比之下右半球比PH值的处理分子老鼠上升强度(
t (54)= 5.61,
P < . 01,比较强度1和10),不同于自己的左半球比PH值超过强度2 - 10(所有
t (54)> 2.80,
P < . 05;图
4 (b) 面板右上方)。因此,注射本身分子选择性强右脑CeA-PAG诱发电位相对于左半球和相对于GFP处理控制,没有不同于分子老鼠在左半球处理。
从以前的工作预期,捕食者压力强右和左半球CeA-PAG诱发电位(图
4(一) 左面板上)。在左右半球玫瑰比PH值强度(所有
t (54)> 4.68,
P < . 01,比较强度1和10)。然而,右半球的反应超过了在第4 - 9强度(所有
t (54)> 2.09,
P < . 05)。这表明,左半球势差现象在捕食者强调老鼠消失相对于右半球增强作用后两天治疗。然而,捕食者压力强离开CeA-PAG比PH值在这看到的左半球处理分子老鼠或左右半球的GFP控制处理老鼠,在左比酸碱的捕食者强调老鼠超过比率的分子处理大鼠(PH值和左和右比处理GFP控制)老鼠强度3、5、9(所有
t (54)> 2.04,
P < . 05)。
比较右半球比PH值的处理分子和捕食者应激大鼠显示几乎相等的增强作用。组没有在强度不同1 - 2和4 - 8人,但处理分子比PH值超过了捕食者强调的强度3、9和10(所有
t (54)> 2.15,
P < . 05)。因此对PAG注入分子本身是有效的,甚至更有效,比其余对捕食者的压力CeA-PAG诱发电位。
3.5。组织学验证电极和套管的位置
的刺激和记录电极被可视化显微镜下组织部分和绘制到老鼠图集部分(
44 ]。从所有三组大鼠有正确放置电极,允许使用每个主题进行数据分析。双向方差分析进行研究集团和半球因素单独分析每架飞机的坐标(美联社,横向和纵向)为每个电极的目标。横向和纵向坐标被来自atlas部分而美联社平面计算部分号码。半球,没有组织或团体
x 半球互动观察。CeA刺激电极正确放置在内侧中央核记录电极在左右PAG的侧栏。的平均位置提示刺激和记录电极出现在桌子上
1 。验证套管位置几乎以相同的方式完成,平均坐标出现在桌子上
2 。此外,绝对记录电极的距离非常小(表
2 )表明电生理记录拍摄从一个位置接近病毒注入。
表2
意味着(SEM) PAG插管坐标和PAG电极。
对套管
的意思是
扫描电镜
平均绝对距离(毫米)
扫描电镜
从右边PAG电极
PAG美联社
6.13
0.068
0.28
0.034
PAG侧
0.36
0.032
0.09
0.026
PAG垂直
5.62
0.04
0.11
0.028
记者:前后飞机前囱后面(毫米)
横向:横向平面(mm侧中线)
垂直:垂直面(毫米低于前囱)
PAG:中脑导水管周围灰质
3.6。pCREB lir免疫组织化学微密度分析
相对OD数据分别分析了PAG的三列。外侧柱主要关心的是由于这是蛋白质分子的地方表达增强(图
5(一个) 前左面板)。右半球的一维方差分析数据显示组(之间的显著差异
F (41)= 3.30,
P < . 05)。相比之下,左半球组没有差别(
F (41)= 1.88,
P <。)。捕食者强调老鼠更pCREB lir比GFP控制处理处理分子老鼠落在这两组之间,不同于没有(Tukey-Kramer测试,
P < . 05)。在处理分子的均值pCREB lir老鼠测量在HSV注射后5天可能低估了其价值在高峰的分子的表达,这发生在HSV注射3天后,治疗发生时(压力或处理),并消失之后(
43 ]。
的意思是
±
SEM相对光密度单位(PAG光密度单位除以总PAG部分光密度单位)在所有三列实验组织策划。左边的面板显示右半球的数据时的右侧面板数据说明了左半球。对于一个给定的列,意味着标有相同字母不不同,但不同于那些不同的字母,而意味着标有两个字母不不同于意味着标有字母(Tukey-Kramer测试,
P < . 05)。意味着标有“@”显示在组不同半球(
P < 0。1跟踪测试)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
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一个跟踪
t 测试被用于比较内组横跨半球基于预测,右列pCREB-lir会增加捕食者强调根据以往的发现,老鼠和预测,增加分子表达分子老鼠将增加pCREB-lir处理。捕食者强调和处理大鼠表现出更多的分子pCREB lir右边/左边(所有
t ,
P < .04点,1t一个iled), whereas there were no hemisphere differences in the Handled GFP control group.
数据分析了脊柱的PAG以同样的方式有点不同的结果(图
5 (b) 面板右上方)。右半球的一维方差分析数据显示组间显著差异(
F (41)= 3.66,
P < .04点),而左半球又没有组差异(
F (41)= 0.74,
P < 49)。比较组的右半球透露,捕食者强调鼠升高pCREB lir是大于处理组没有差异(Tukey-Kramer测试,
P < . 05)。此外,组在两个半球的比较显示,像侧列,强调和处理分子组升高pCREB lir的右脑比左(所有
t ,
P < .04点
t 跟踪)处理GFP对照组半球又没有区别。
表达式的pCREB PAG腹侧列提出了另一个模式(图的结果
5 (c) ,下半部分)。右半球的一维方差分析显示组间显著差异(
F (41)= 6.93,
P < .003)。然而,在这种情况下,强调老鼠pCREB表达显著低于处理分子与GFP处理对照组大鼠在下降,不同于没有(Tukey-Kramer测试,
P < . 05)。就像其他两个列,左半球组之间无差异(
F (41)= 1.36,
P <陈霞)。比较组在半球内显示,GFP处理控制和处理老鼠增加了分子pCREB左半球(所有正确的
t ,
P < . 01),而没有捕食者强调老鼠半球差异。这些镜子前腹侧列结果发现除了半球的差异(
40 ]。处理的分子集团没有不同于GFP控制处理表明,分子不得在本专栏中产生了影响。这也表明,地区差异的途径控制分子的磷酸化可能依赖于捕食者的压力。
3.7。GFP的可视化
验证基因的表达是通过检查所有PAG部分绿色荧光记者GFP的表达的证据。绿色荧光的PAG验证的GFP基因表达发生在HSV注入附近的注入套管和PAG记录电极(图
6 五天后,如HSV注入)。因为荧光范围从套管PAG电极,可以推出一种美联社平面范围的基因表达PAG电极位置相对于套管。指表
2 ,基因表达的证据HSV注射后五天出现的范围
±
陈霞
±
.034毫米(平均
±
SEM)美联社插管的飞机。这代表了一系列那样广泛的在以前的试点工作,发现基因表达高峰的时候(HSV注射后三天),GFP表达本地化PAG的右边侧列在AP飞机的范围
±
.35点毫米套管。
图6
描述图中的荧光显微照片说明绿色荧光蛋白(GFP)局部正确的侧栏中脑导水管周围灰质(PAG) 5天后HSV注入正确的横向PAG。6.5和25倍的放大(
×
)。
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3.8。力量与重要的相关结果
考虑到小n组,功率(
α
= . 05)计算的所有重要的发现。重大行为和电生理学的研究结果都有超过of.90功率值。权力与pCREB表达式分析随PAG的列,从.82在背侧和腹侧列点减少权力横向列.60的结果。
一个测试的力量取决于类型的值(这里我错误
α
= . 05),样本大小,标准偏差,影响的大小反映在测试级的平均差异。大多数研究结果看起来很健壮与权力值超过.80,暗示健壮的捕食者的压力和病毒诱导分子表达的影响对大脑和行为。减少权力的横向列pCREB发现表明在本专栏中衰落的影响。
4所示。讨论
本研究的主要目的是检查的功能意义pCREB PAG对侧列内的变化。这是通过基因诱导表达的增加,分子通过病毒引导和决定行为、电生理和pCREB GFP表达变化相比,捕食者强调和处理控制老鼠。
4.1。病毒矢量分子行为的影响
病毒定向诱导分子表达的正确的侧列PAG产生类似那些在捕食者强调大鼠行为的影响。处理大鼠显示分子增加开放臂回避的EPM(减少比时间和条目)相比GFP控制处理。然而,捕食者压力更有效,提高开放臂避免在处理大鼠分子。焦虑组之间,尽管,这个分级变化措施+活动和探索的迷宫或孔板(图没有什么差别
1 )。这种模式的结果表明开放臂的变化探索EPM(焦虑)不是由于活动或探索性的变化趋势,与先前的研究一致的使用“捕食者”强调老鼠在类似的测试情况
5 ,
9 ,
15 ,
23 ,
25 ,
32 ]。
分子本身的能力增加开放臂避免在没有捕食者的压力是一个了不起的发现。这表明一个直接的作用和可能的分子pCREB表达式(
32 在行为变化所产生的压力。捕食者的压力可能诱发分子信号的变化,然后通过NMDA受体激活行为变化的PAG [
7 ,
23 ,
25 ,
40 ]。在目前的研究中,压力影响模仿通过直接绕过NMDA受体激活,激活分子介导的过程。
并不是所有的捕食者压力的影响被PAG感应分子模拟,然而。通常捕食者压力降低率频率NMDA receptor-dependent地风险评估(
5 ,
7 ,
16 ,
25 ,
26 ]。捕食者的压力在本研究也降低了风险评估,风险评估分子处理大鼠的影响并没有不同于GFP控制(图处理
2 )。缺乏一种捕食者的压力响应处理老鼠表明分子增加分子表达PAG可能不是唯一的因素介导抑制风险评估,或者可能只影响一些EPM的行为。其他必要的因素可能包括腹侧海马杏仁核pCREB表达和增强作用的变化,BLA传播,这两个跟随捕食者压力(
32 ]。此外,风险评估的变化产生的捕食者压力高度预测的右半球在CeA-PAG和海马BLA变化传播途径(
9 ]。因为只有PAG操纵在处理老鼠,分子很可能这些其他因素不参与,但参与捕食者强调老鼠。也许风险评估要求所有更改发生的变化。改变海马空间信息转移到BLA可能是有意义的,因为风险评估被描述为一种抽样的直接环境的潜在威胁(
49 ]。其他可能的原因包括以下。处理分子老鼠比在EPM处理GFP控制焦虑,但是他们的焦虑水平没有捕食者强调老鼠一样大。更高层次的焦虑可能会更少的风险评估(
49 ),所以更焦虑捕食者强调老鼠显示减少风险评估。需要进一步的测试来决定这些可能性之间。
处理分子老鼠也有升高值惊吓振幅峰值相比GFP对照组处理。此外,捕食者强调集团呈现出惊吓振幅超过处理分子的老鼠。这种分级反应增强的惊吓的组织让人想起打开手臂EPM回避,并支持认为诱导分子表达本身引发的焦虑状态好过,捕食者所产生的压力。原因直接操纵PAG的温和影响捕食者相比,压力可能平行上面提出的那些解释风险评估的差异。最后,惊吓振幅的增强捕食者强调老鼠是与以往的研究一致
6 ,
23 ,
26 ,
27 ]。
捕食者压力的习惯也可靠地降低率声惊吓反应(
15 ,
16 ,
48 ]。显示数据与这些研究结果是一致的,捕食者强调老鼠明显比处理GFP更长时间去适应控制(图
3 )。这个复制进一步掠夺者过度压力的模型反应的有效性方面的创伤后应激障碍,因为延迟习惯惊吓也观察到在PTSD患者(
50 - - - - - -
53 ]。
令人惊讶的是,处理组分子甚至超过了捕食者强调大鼠适应吓了一跳。这一发现涉及相关的分子机制延迟的惊吓习惯化,可能门冬氨酸receptor-dependent,鉴于CPP前30分钟服用捕食者压力块延迟惊吓习惯以及增加对横向PAG pCREB表达式(
16 ,
40 ]。然而,这一发现也显示一些差异机制诱导的神经变化的分子在PAG潜在的增强惊吓振幅和拖延的习惯。延迟惊吓习惯已经观察到在没有增加惊吓振幅使它可能不同的神经回路/调解机制的变化这两个反应声惊吓(
7 ,
16 ]。此外,最近的研究表明,单独的部分CeA-PAG途径调解压力诱导惊吓振幅的变化和惊吓习惯化
7 ]。另一个可能的解释可能是以下。尽管NMDA receptor-dependent势差现象杏仁核的传出传输PAG介导惊吓振幅的增加(
9 ,
23 ,
26 ),同源性突触抑郁症在脑干惊吓通路构成习惯(
54 ],直接表达分子PAG有力地参与这样的抑郁症超过每秒捕食者的压力。
4.2。病毒的影响定向分子CeA-PAG传输
一个有趣的发现是,病毒分子的定向诱导的增强作用CeA-PAG通路在右半球(图
4 )类似于后看到捕食者的压力。此外,增强作用在这个组被局限于同一半球注入。事实上,诱发电位的左半球处理分子老鼠没有从这些差异中观察到绿色荧光蛋白处理控制。这意味着任何行为变化观察到这一组可以归因于传播的变化由于感应分子在右半球。
在过去的研究中,CeA-PAG增强作用的压力已被证明是NMDA receptor-dependent捕食者。CPP政府之前捕食者压力块anxiogenic效果和和CeA-PAG势差现象(
7 ,
16 ]。此外,鉴于捕食者压力诱发NMDA receptor-dependent对PAG pCREB表达式,它也表明,长久的对CeA-PAG途径增强作用取决于pCREB表达式(
7 ,
40 ]。现在发现处理分子老鼠支持这一假设。
本研究还增加了新数据的时间进程CeA-PAG途径增强作用在捕食者强调老鼠。目前的结果表明,正如所料,捕食者强调老鼠表现出增强作用正确的CeA-PAG通路两天后捕食者的压力(图
4 ),补充这些研究复制这一发现,9和12天邮报捕食者压力(
9 ,
23 ,
32 ]。一项新的发现褪色,但仍然存在,增强作用在捕食者的左CeA-PAG强调老鼠。左半球的势差现象的存在增加了先前的研究显示一天后离开了CeA-PAG捕食者压力(
27 ),但完全消退了9天(
7 ]。现在发现一个左半球势差现象持续至少两天。
双边CeA-PAG通路的存在增强作用在捕食者强调老鼠和单边诱导CeA-PAG途径增强作用在分子处理大鼠的焦虑测试可能占的一些差异在开放臂回避、风险评估和团体之间的惊吓反应。这尤其担忧没有减少风险评估分子处理组,因为NMDA阻止左背外侧杏仁核前30分钟捕食者压力阻止压力影响的风险评估(
26 ]。此外路径分析表明,开放臂勘探和风险评估的变化可能取决于bihemispheric边缘传输变化后的早期阶段捕食者压力(
27 ]。
长久的增强作用正确的CeA-PAG通路通过捕食者压力一直建议反映一些,但不是全部,anxiogenic捕食者的压力(后神经可塑性变化
9 ,
23 ]。综合目前发现借大力支持这一观点。
4.3。病毒的影响定向分子在pCREB lir
鉴于捕食者压力增大pCREB lir选择性正确的PAG的横向列,这CeA-PAG势差现象持续时间在右半球,有人建议,增加生产pCREB背后CeA-PAG势差。此外,pCREB度表达式和右CeA-PAG势差现象与相同的捕食者压力措施紧密相关的经验表明这两种现象之间的密切关系(
23 ]。
在目前的研究中,微密度分析显示右/左外侧PAG增加pCREB lir处理分子和捕食者强调群体。从而增加分子直接表达和基因的横向PAG也增加了pCREB模式类似于捕食者的压力集团没有捕食者的压力。此外,在处理老鼠,分子的增加pCREB正确但不离开的横向列PAG是一致的增强作用正确的但不离开CeA-PAG通路在这个组。pCREB表达正确的这一事实中的横向列分子组中间处理,既不同于捕食者强调集团和GFP处理控制,符合他们的温和比EPM的捕食者强调老鼠增加焦虑和声学惊吓测试。综上所述,这些研究结果支持建议pCREB升高导致神经可塑性变化,诱发对CeA-PAG势差现象和焦虑
23 ,
32 ]。
这个结论也必须考虑减少权力与横向列重大发现。减少权力这可能反映出减少的效果体现在小意味着差异分析中遇到的。正如上面指出的(部分
3所示。6 )的均值pCREB lir在处理大鼠测量分子5天邮报HSV注入可能低估了其价值在高峰的分子的表达,这发生在HSV注射3天后,治疗发生时(压力或处理),并消失之后(
43 ]。此外,影响捕食者强调pCREB表达明显在20分钟后压力和消退之后(20和未发表的观察)。由于瞬态NMDA受体阻断防止捕食者压力对大脑和行为的影响和抑制pCREB表达式(
7 ,
25 ,
26 ,
40 ),很可能大脑和行为的变化依赖于直接的影响增加pCREB表达式,在这项研究之前可能会开始pCREB测量的时间。进一步研究分子和pCREB表达在横向PAG HSV注射后1 - 3天需要澄清目前的发现。
现在发现镜子与以前的工作对PAG的侧栏。然而,脊柱结果相比需要更多的解释。脊柱的模式pCREB变化鲜明对比发现捕食者的压力并不能改变pCREB lir在本专栏时测量20分钟后掠食者压力(
23 ,
40 ]。在当前的研究中捕食者强调老鼠pCREB表达正确的背PAG升高,而两个处理组和类似的较低水平的表达两天治疗后(图
5 )。右/左半球表达效果观察在捕食者强调和处理分子组织,类似于横向列。右边超过左边这一事实的处理老鼠表明分子对侧列pCREB增强可能蔓延到脊柱,但不足以不同于GFP控制处理。其他解释包括潜在泄漏插管道或感应分子的可能性,这是一个函数,因为捕食者强调群体展示类似的效果更加明显。右/左pCREB表达的增加捕食者强调老鼠表明EPM有影响脊柱24小时后。这扩展了以前的研究结果显示,脊柱pCREB提升双边在捕食者强调老鼠暴露在20 - 25分钟后举行的EPM捕食者的压力(后7天
55 ]。以前和现在的结果不同,然而,在目前的研究中,没有pCREB增加控制权在捕食者的左半球强调老鼠。这表明,捕食者之间的时间间隔增加压力经验和EPM测试可能允许左半球pCREB水平增加。相反,在目前的研究中24小时运行之间的EPM测试和pCREB测试。也许离开脊柱pCREB表达消失了在这个时间间隔。进一步研究时间进程pCREB变化后捕食者的接触压力和EPM看起来是合理的。
虽然侧和背柱发现有些符合先前的锅,腹侧列的结果并非如此。在目前研究pCREB表达式在捕食者强调老鼠相比下降两个处理组在右半球,和右和左半球表达没有捕食者强调差异老鼠。此外,处理组显示增加pCREB右/左半球(图中表达
5 )。与以前的工作有差异和相似之处检查pCREB表达式处理后20分钟或捕食者的压力。以往的研究显示,捕食者之间没有pCREB差异表达的强调和处理控制在两个半球腹PAG,与右半球表达升高左(
23 ]。也许不同的采样时间pCREB表达占过去和现在的研究结果之间的差异,因为pCREB在本研究测量两天后治疗。
如果减少pCREB表达式在腹侧PAG通常延迟捕食者压力(我们有初步证据,未发表的数据),然后发现这样可以减少独立于提高pCREB表达至少横向PAG直接遗传引起的感应。如果增加侧列和减少腹侧列pCREB表达式并行增强和抑制正常的功能,那么有人可能会怀疑转移防御性反应倾向避免威胁刺激和远离放松不动,的功能柱状背外侧的差异和腹侧PAG Depaulis描述和Bandler [
47 ]。进一步的时间进程的研究似乎防御捕食者后反应偏差应力的转变。
4.4。摘要和结论
总之,目前的研究表明,直接诱导分子(pCREB)表达正确的横向PAG复制行为,大脑和分子变化,相似与捕食者强调老鼠。这些发现表明增加分子(也许pCREB)表达在外侧PAG至少足以产生大脑和行为变化通常由一个简短的捕食者的压力。此外,相似诱导分子表达的影响至少在基底外侧杏仁核在EPM焦虑,报道了华莱士et al。
43 ]。这些数据支持的CREB-pCREB路径正确的横向PAG,也许杏仁核,是重要的入门级分子路径持久anxiogenic捕食者的压力的影响。在某种程度上,食肉动物应激模型的某些方面PTSD,现在发现指向和pCREB通路分子尽可能新的治疗靶点。