依照英国动物实验(科学程序)法案1986年,1986年欧洲社区理事会指令(86/609 / EEC)和巴斯大学的伦理审查文档。片含有EC和海马体是准备从雄性Wistar鼠(P28-35),被麻醉的肌内注射氯胺酮(120毫克/公斤)+甲苯噻嗪(8毫克/公斤)和斩首。大脑迅速删除,沉浸在含氧人工脑脊液(aCSF)冷冻4^°片(350 - 400年 μ 使用Vibroslice m)被削减,并存储在aCSF充溢O为95%₂/ 5%股份有限公司₂,在室温下。复苏后至少1小时,个别片被转移到一个记录室安装在舞台上的蔡司Axioskop FS或一个奥林巴斯BX50WI显微镜。室是灌注(2.0毫升/分钟)和含氧aCSF (pH值7.4)33节^°c . aCSF包含(毫米)氯化钠(126),氯化钾(3),不₂阿宝₄(1.4),NaHCO₃(19),MgSO₄(2)CaCl₂(2)、葡萄糖(10)。神经元是可视化使用微分干涉对比光学和红外摄像机。

补丁吸量管救出硼硅玻璃燃烧/棕色微电极拉手。记录自发(sEPSCs)或诱发(eEPSCs)兴奋性突触后电流,吸量管满心Cs-gluconate-based解决方案包含(毫米)D-Gluconate(100),玫瑰(40),qx - 314 (1), EGTA(0.6),氯化钠(2),MgCl₂(5)、TEA-Cl (1), phosphocreatinine (5);ATP-Na (4), GTP-Na (0.3), mk - 801(2)。解决方案调整到290 mOsmol,并与CsOH pH值7.3。全细胞电压钳记录(持有潜在−60 mV,除非另有说明)是由神经元在第五层的内侧的EC,使用一个Axopatch 200 b放大器(美国加利福尼亚州分子设备)。串联电阻补偿没有使用,但阻力(10 ~ 30 MΩ)在每个记录和定期监测细胞被丢弃的分析如果它改变了超过±10%。液体接界电势(12.3 mV)估计使用接界电位pClamp-8软件中所包含的计算器(美国加利福尼亚州分子设备)和补偿的潜力。

eEPSCs被电刺激引起(双相脉冲,10 - 50 V, 0.02毫秒时间)通过一个双钨电极放置在表面的片层横向EC的V。轻快的刺激强度调整给高频(约。50 - 60%最大振幅)的反应。

在所有这些实验中,mk - 801(2毫米)包含在补丁阻止突触后NMDAr吸管的解决方案。这允许我们记录AMPA-receptor介导反应隔离,并监督活动preNMDAr受突触后受体的影响。这种方法是由我们( 16, 35, 42),并已成功应用被其他人阻止突触后NMDAr在记录的神经元 17, 27, 28, 32, 33, 40]。全细胞访问获得时,神经元电压夹在0 mV,突触刺激交货2赫兹30 - 40秒钟允许封锁的突触后NMDAr mk - 801透析进入细胞通过补丁吸管的解决方案。膜电位被夹在−60 mV和单一的冲击刺激在低频率(0.05赫兹)唤起AMPAr EPSCs介导的。在2到3分钟的间隔,取代单一的冲击和刺激3赫兹10秒钟。这样的刺激导致的频率相关便利AMPAr-mediated EPSC,之前我们证明依赖激活preNMDAr [ 35]。我们使用的频率相关便利化程度AMPAr-mediated eEPSCs preNMDAr激活的定量测量。

在这些实验中,mk - 801是省略了补丁吸管的解决方案。全细胞访问了时,控制eEPSCs记录持有−60 mV的潜力,在添加AMPAr拮抗剂之前,NBQX,伽马氨基丁酸_一个r-antagonist,荷包牡丹碱浴灌注。10 - 12分钟后,控股可能更改为+ 40 mV记录孤立NMDAr-mediated EPSCs正向的电流。这些都是诱发在低频率(0.05赫兹),直到稳定的振幅都被记录下来,在增加拮抗剂浴。

数据记录到计算机硬盘使用Axoscope软件。Minianalysis(美国Synaptosoft迪凯特,Ga)是用于EPSCs离线分析。preNMDAr研究中,平均8响应的振幅峰值每集3赫兹刺激之前确定。期间3赫兹刺激,8的振幅最大的事件是决心和规范化的平均振幅前低频事件获得定量测量的频率相关便利的存在和没有对手。在这些研究中,我们分析了AMPAr-mediated sEPSCs,通过确定interevent间隔(迅速),振幅,增加(10 - 90%)和衰减时间。sEPSCs使用threshold-crossing自动检测算法。阈值变化从神经元到神经元,但始终保持在一个恒定的水平在任何给定的记录。至少200事件取样连续记录期间每个每个条件下神经元。累积概率分布迅速使用Kolmogorov-Smirnoff测试比较。在突触后NMDAr实验,反应被测量平均峰值振幅量化至少5 NMDAr-mediated eEPSCs唤起整个研究在低频率间隔。 In these studies, the vast majority of sEPSCs were blocked, as recordings were conducted in the presence of NBQX. Occasional slow sEPSCs mediated by NMDAr were recorded, their frequency was very low (2-3 per minute) and precluded meaningful analysis.

盐用于制备aCSF“Analar”和从默克公司购买/ BDH级或费舍尔科学(英国多塞特郡)。所有药物都适用于浴灌注。mk - 801、门冬氨酸、NBQX D-2-AP5,荷包牡丹碱methiodide,和Ro 25 - 6981 ( αR, βS) - α(4-hydroxyphenyl) β盐酸(-methyl-4) - phenylmethyl 1-piperidinepropanol)获得Tocris(英国布里斯托尔)。TPEN (N, N, N^′N^′-Tetrakis - (2-pyridylmethyl)乙二胺)是获得σ(英国)。UBP302 ((S) 1 - (2-amino-2-carboxyethyl) 3 - (2-carboxybenzyl) pyrimidine-2 4-dione)是一种礼物从戴夫博士简,布里斯托尔大学和NVP-AAM077 ((R) - (1 - (4-bromo-phenyl) -ethylamino] (S) - (2 3-dioxo-1 2 3 4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)甲基]ph - osphonic酸)是一个礼物从Yve博士Auberson在诺华(瑞士巴塞尔)。

图 1(一)显示eEPSCs唤起在3赫兹,第五层神经元和突触后NMDAr在内部被透析mk - 801。第一个6反应诱发在火车30 3赫兹显示演示便利化看到在这个频率相对较低。先前报道( 35的便利,AMPAr-mediated eEPSCs完全依赖于突触前NMDAar激活,因为它可以废除2-AP5 ( n = 5 ,图 1 (b))。同样,NMDAr通道阻滞剂,mk - 801,还废除了频率便利( n = 10 ,图 1 (b))。在某些神经元,促进取代弱频率相关的抑郁eEPSCs阻滞剂的存在。这可以被视为减少意味着振幅的eEPSCs阻滞剂的存在(例如,图 1 (b))。进一步5神经元,我们证实了特异性的影响通过测试GluR5亚基的影响特定kainate受体的拮抗剂(UBP 302年20 μ 米),因为我们最近表明,这些受体调节类似的短期促进谷氨酸传播在第三层的EC - 5赫兹(张伯伦S.E.L和琼斯R.S.G.未发表)。UBP 302没有影响便利层V(图中未显示)确认NMDAar的依赖。有趣的是,2-AP5没有影响频率便利化的第三层EC(没有显示),所以尽管类似短期可塑性被认为在这两个层,其底层机制是lamina-specific。

因为2-AP5和mk - 801都没有选择性NR2A v NR2B亚单位( 5),没有数据表明负责短期frequency-facilitation NMDAr的亚基组成。确定受体参与,我们检查了更具体的对手的效果。首先,我们测试了Ro 25 - 6981的影响。这是一个变构抑制剂的门冬氨酸受体,结合网站的n端结构域NR2亚基,具有高度的选择性(> 3000倍)对NR2A NR2B [ 38]。图 2(一个)表明Ro 25 - 6981在500海里废除eEPSCs频率便利化,再次揭示薄弱的萧条。较低浓度(200海里, n = 3 Ro 25 - 6981年)导致平均最大减少frequency-facilitation 69±7%。这些浓度的药物应该有很少或没有影响NR2A亚单位( 38),强烈建议NR2B-containing受体主要是负责这种形式的短期在第五层突触可塑性。这个同意先前的研究已经表明主音facilitatory影响自发释放可能是NR2B-mediated [ 16, 35, 43]。因此,Ro 25 - 6981导致大幅增加sEPSCs迅速从277±82毫秒( 5.5 ± 1。9 赫兹)到764±261毫秒( 2.1 ± 0.7 赫兹)记录在相同的神经元(cf。 36, 43])。KS累积概率分布的分析证实了非常明显的变化。没有并发平均振幅的变化,上升,或衰减时间(没有显示)。

接下来,我们检查NVP-AAM077 5神经元的影响。这是一个竞争对手显示一些包含NR2A亚型受体的选择性。最初的报道表明化合物的选择性大于100倍NR2A在NR2B [ 39, 44]。然而,最近,它已经表明,选择性更接近10倍时,谷氨酸的亲和力的两个亚型([占 41],参见[ 45, 46])。因此,在这里采用的浓度(400海里),我们可能期望几乎完全的封锁NR2A受体,但有可能大幅抑制NR2B也会发生( 41]。然而,NVP-AAM077没有明显影响的频率相关便利eEPSCs(见图 2 (b))。如果有的话,便利化略增加(尽管不明显)。这些数据表明,NVP-AAM077可能合理的选择性受体NR2A在我们的准备,但这些受体不参与突触前短期在第五层突触可塑性。进一步支持这是来自sEPSCs分析。意思是迅速的控制是443±230毫秒( 4.0 ± 0.9 Hz),这略微下降到377±180毫秒(4.5赫兹)的NVP-AAM077。同样,没有改变振幅,上升,或腐烂的时候sEPSCs(没有显示)。

针对争议NVP-AAM077的选择性,我们还测试了( n = 5 )锌的影响^{2 +}已被证明能够区分NR2A和NR2B受体。喜欢Ro 25 - 6981 NR2B亚单位、锌^{2 +}结合NR2A亚单位的n端结构域施加voltage-independent抑制> 100倍选择性NR2B [ 47- - - - - - 49]。然而,与NVP-AAM077一样,一个相对高浓度的锌^{2 +}(300海里)未能改变频率相关促进eEPSCs(见图 2 (c))。此外,它几乎没有影响迅速(200±150 ν298±170毫秒,见图 2 (d)),振幅( 17.7 ± 3所示。4 ν 15.4 ± 2.2 pA)上升( 1。9 ± 0.3 ν 2.1 ± 0.4 毫秒)或衰减时间( 24.6 ± 1。6 ν 27.3 ± 1。3 毫秒)sEPSCs (cf。 43])。因此,数据来自NVP-AAM077和锌^{2 +}研究影响强烈反对NR2A受体的作用在突触前频率相关便利层EC的V。Ro 25 - 6981块的能力促进强烈表明,突触前只在这些突触可塑性依赖NR2B-containing受体。

最近的一篇论文( 50]表明,激活突触后受体NR2B-containing以相似的频率(3.3赫兹)受雇于我们引起频率相关便利诱导NMDAr-mediated电流本身的长期萧条(主要是通过减少部分^{2 +}电流由受体)。我们想看看重复激活突触前NR2B-containing受体诱导任何衰减的频率在第五层突触便利化。在5个神经元,我们诱导便利化eEPSCs和监控的便利化程度但不添加任何阻滞剂。总有一个初始的便利化程度减少AMPAr-mediated eEPSCs从第一到第二集,但之后是非常一致的(参见图 3(一个))。然而,当我们看着eEPSCs绝对振幅,有一个小,但一致的,增加的研究。这适用于事件诱发低和高频率(见图 3 (b))。我们还研究了这些神经元的变化检测的时间进程与2-AP5(见图 4)。拮抗剂似乎防止低频事件的逐步增加振幅的同时阻止频率相关便利化。这有限的协议可能会建议短期频率相关便利可以构成一个长期增强谷氨酸的传播。作为突触后NMDAr已经封锁(通过内部mk - 801),这可能包括突触前,NR2B-containing受体。

我们现在想确定NMDAr NR2A / B亚基的贡献在层V (EC的突触后的网站,所以我们测试了相同的对手在突触前实验中用于影响孤立NMDAr-mediated eEPSCs。正如所料,非特异性阻滞剂2-AP5 ( n = 5 )和mk - 801 ( n = 9 )同时废除了缓慢eEPSCs记录+ 40 mV NBQX和荷包牡丹碱(没有显示)。Ro 25 - 6981 ( n = 5 )也引起浓度依赖减少突触后NMDAr反应的浓度将保留选择性NR2B-containing受体(见图 5(一个))。缓慢eEPSCs基本上废除了Ro 25 - 6981在500海里。这表明NR1 /在突触后受体NR2B主导的网站presynaptically一样。然而,当我们测试NVP-AAM077 ( n = 6 ),我们再次发现concentration-related减少突触后反应抑制约80%在500 nM(见图 5 (b))。比较的数据Neyton和Paoletti [ 41]表明NVP-AAM077的影响可以解释通过封锁NR2B和受体NR2A自500海里足以废除NR2A反应在卵母细胞,但也对块NR2B 60%左右。然而,这是不符合其未能改变preNMDAr-dependent便利化,这显然是一个NR2B-mediated响应。研究锌^{2 +}( n = 6 )未能充分阐明。二价阳离子也引起浓度减少缓慢eEPSCs(见图 5 (c))。使用的浓度产生大约80%的voltage-independent块NR2A受体卵母细胞中表达,但保留了相当程度的选择性对块NR2B受体( 47, 49]。这些数据表明一个角色在突触后受体NR2A站点,但它也令人费解,Ro 25 - 6981基本上废除NMDAr EPSC,当它将对受体NR2A几乎没有影响。

我们进行了两组实验来进一步来探讨一下这个问题。在5个神经元中,我们第一次灌注低浓度的Ro 25 - 6981(200海里),部分阻塞NMDAr EPSC。然后,我们添加了一个低浓度的锌^{2 +}(100海里)。在这些神经元,Ro 25 - 6981导致抑制约45%,锌的加入^{2 +}有进一步减少约90 - 100%,这显然表明NR2A和NR2B的作用调节突触后反应(见图 5 (d))。最后,有证据表明,在控制条件下,NR2A-containing受体可能大幅被锌^{2 +}、现在在ACSF由于污染其他盐使用的准备( 47]。虽然添加锌^{2 +}明显减少缓慢eEPSCs在我们的实验中,我们还研究了是否存在显著的封锁NR2A受体控制录音测试锌的效果^{2 +}螯合剂,TPEN (2 μ 米),3个神经元。这个没有影响的平均振幅NMDAr eEPSCs ( 125.3 ± 25.1 ν 111.9 ± 26.1 pA)说,我们的研究结果与对手不太可能被锌蒙羞^{2 +}污染。

最后,如上所述,相对较低的频率,重复激活NR2B可以诱发抑郁症的突触后受体门冬氨酸反应本身( 50]。在7个神经元,我们决定一段时间重复刺激的影响(3赫兹,40秒)突触后NMDAr eEPSCs 5神经元。总的来说,在重复的刺激有一个小(15%),逐步减少在第一个10 - 15秒,然后振幅达到高原(见图 6(一))。然后我们记录NMDAr eEPSCs在低频率(0.05赫兹)在随后的30分钟。有一个初始阶段(5分钟),反应似乎有点沮丧,之后复苏紧随其后复苏之前略有增加(见图来控制水平 6 (b))。然而,除了短暂大约20分钟来控制相比没有显著差异。