大麻素受体是一个家庭的g蛋白耦合,突触前受体( 1, 2]。放射自显影法研究使用大麻素受体配体CP55,940 [ 3- - - - - - 5]表明CB1Rs分布在神经组织。这些研究报告一个密集的绑定CP55,940在基底神经节,特别是黑质 帕尔斯试苍白球(GP)和小脑。在大脑中,海马结构和内嗅皮层(EC)显示CB1R最高密度的染色。

大麻类已知施加强大的控制gaba ergic抑制性信号在中枢神经系统 6- - - - - - 8,据报道,CB1R GABA的抑制_一个受体介导的突触发生传播通过压敏电阻器的抑制钙通道(VGCCs;( 6])。在海马体,激活突触前CB1R抑制GABA释放到突触后靶细胞( 9, 10),在这些研究中,内生和外生CB1R受体激动剂可以减少gaba ergic自发的抑制性突触后电流的振幅和频率(sIPSCs),但不影响action-potential-independent迷你(m)万能。其他研究已经表明,大麻素受体激活增强网络振荡活动( 11]。然而,海马旁地区(PHR),大麻素受体的影响并没有得到很好的描述。在这里,我们调查了cbr的功能作用在体外神经元网络活动建模kainate (KA)诱导持续振荡( 8, 12]。持续振荡活动伽马频带(30 - 80 Hz)最常见的报道和研究体外片形式的网络活动准备,并且可以引起metabotropic谷氨酸受体( 13红藻氨酸(的)或应用程序 8, 12]和/或毒蕈碱的受体激动剂氯化氨甲酰胆碱神经元网络振荡活动反映了形势的主要细胞的抑制gaba ergic中间神经元,该法案使乘火车和同步主细胞活动(柯布et al ., ( 14])。mEC报道表达伽马振荡(30 - 100 Hz)针对应用程序的摩尔浓度kainate [ 15, 16),振荡功率最大的表层II / III ( 15]。

结合EC-hippocampal片是由雄性Wistar鼠(50 - 110克)如前所述 17]。按照英国的所有实验动物科学(过程)法案1986年和1986年欧洲共同体委员会指令(86/609 / EEC)。老鼠犀牛与异氟烷和N₂/ O₂,直到心肺衰竭,斩首。大脑迅速删除,沉浸在含氧人工脑脊液(ACSF)冷冻4^°c片(450 μ 米)被使用振动切片机(德国MicroM),并存储在ACSF不断沸腾O为95%₂/ 5%股份有限公司₂,在室温下。恢复期至少1小时后,个别片被转移到一个记录室安装在奥林巴斯的阶段(BX50WI)正直的显微镜。美国商会在30 -持续灌注和氧合ACSF^°C,大约2毫升/分钟的流量。ACSF包含以下(毫米):氯化钠(126),氯化钾(3.25),不₂阿宝₄(1.25),NaHCO₃(24),MgSO₄(2)CaCl₂(2.5)和葡萄糖(10)。解决方案是不断沸腾O为95%₂/ 5%股份有限公司₂保持pH值为7.4。神经元是可视化使用微分干涉对比光学和红外摄像机。

膜片箝电极救出硼硅玻璃(1.2毫米,0.69 ID;哈佛装置),打开提示抗性4 - 5米 Ω 。他们充满了一个解决方案包含以下(毫米):中海(90),玫瑰(33),qx - 314 (5) EGTA (0.6), MgCl₂(5.0),TEA-Cl (10), phosophocreatine (7) ATP(4)、三磷酸鸟苷(0.4)。解决办法是调整到290 mOsmol蔗糖和与CsOH pH值7.4。全细胞电压钳记录是由神经元层第二和第五章的EC的内侧部,使用一个Axopatch 700系列放大器(美国分子设备)。控股可能在所有情况下都是-70 mV。在这些实验条件下,层II / V神经元sIPSCs展出,通过GABA作用主要在GABA介导的_一个受体。

数据直接记录到计算机硬盘使用AxoScope软件(美国分子设备)。迷你分析(美国Synaptosoft)用于sIPSCs离线分析。sIPSCs使用threshold-crossing自动检测算法,以及他们的频率和振幅进行了分析。200 sIPSCs取样连续记录期间每个每个条件下神经元。非参数Kolmogorov-Smirnoff (KS)测试是用来评估的意义变化的累积概率分布interevent间隔(迅速)。药物和控制之间的差异的情况下研究sIPSCs评估通过单向方差分析。所有错误值表示在文本参考S.E.M.

中使用的所有盐制备的ACSF Analar品位和购买从默克/ BDH(英国)。LY320135和ACPA获得Tocris Cookson(英国)。

振荡活动的现场录音,切片放入一个接口室(英国Digitimer BRSC-1)和室与含氧ACSF在30 -连续灌注^°C,大约1 - 2毫升/分钟的流量。人口记录是用玻璃微电极细胞外充满aCSF,抵抗的1 - 3米 Ω 。信号被放大1000倍,记录过滤。低振幅50 Hz干扰被使用欺骗(追求科学、加拿大)。信号被数字化并记录10 kHz使用NPI EXT-02F放大器(NPI、德国)和pClamp 10软件(美国分子设备)。30 - 90分钟后控制稳定的振荡活动的时期,药物应用于浴在已知浓度的溶液。药理分析了振荡活动使用快速傅里叶变换(FFT, Clampfit 10),互相关分析和Morlet-wavelet时频光谱图分析(MatLab 2007 r, Mathworks)。学生 t测试进行了确定统计学意义。

我们分析了振荡β(15 - 29 Hz)和γ(30 - 90 Hz)乐队,使用带通滤波器(Clampfit 10.1)和功率谱曲线下的面积测量Sigmaplot 8.0。

同时记录层二世和V的mEC,我们应用CBR兴奋剂arachidonylcyclopropylamide (ACPA) 10 μ 米,上片的稳定放射性被300 - 400 nM kainate诱导。如图 1(一个)显示,KA-induced伽马振荡层二世被广泛的类似报道坎宁安et al。 15]。因此,权力意味着区域 γ乐队是561±179 μ V²和平均控制γ频率 40.7 ± 2。4 赫兹。40 - 60分钟后洗澡ACPA的应用,我们应用CB1R-specific反兴奋剂LY320135(500海里;( 18])。图 1(b)显示了活动之间的带通滤波的功率谱密度2 - 100赫兹,和图 1在γ(c)显示了类似的数据过滤频率(30 - 90赫兹)。如图 1(c)显示,有一个倾向增加伽马权力ACPA在一些录音,但这不是重要的整体( P≥.19, n= 9)。在汇集数据,ACPA显著降低意味着伽马峰值频率 35.6 ± 1.8 赫兹( P≤.04点, n= 9),尽管这种影响是变量,和一些录音显示多个峰值。

CB1R-specific逆灌注的受体激动剂LY320135之后,有一个明显减少正常伽马权力 39.4 ± 10.1 %的控制,这是非常重要的( P≤考虑, n= 9)。此外,平均峰值频率回到 41.2 ± 1.8 赫兹( P≤.04点, n= 9)。

β第二权力层测量时,我们注意到一个类似的模式的放射性药物反应观察。意味着权力在β频带面积低于放射性26岁±6 μ V²在控制条件和平均峰值测试频率 25.6 ± 1.4 赫兹。图 2(一个)显示活动的功率谱密度之间的带通滤波2 - 100赫兹,和图 2(c)显示了类似的数据过滤测试频率(15 - 29赫兹)。如图 2(c)显示,没有显著改变β在ACPA(81.4±15%的控制, P≥.14点, n= 9),ACPA意味着β峰值频率(没有显著影响 27.6 ± 1.43 赫兹, P≥二十五分, n= 9)。然而,当我们增加了CB1R-specific反兴奋剂LY320135,有正常的减少β权力57±13%的控制,这是非常重要的( P≤.008, n= 9)。LY320135没有影响平均峰值频率( 27.9 ± 0.52 赫兹, P≥。4, n= 9)。

在上面的实验中,我们同时记录振荡活动深内嗅皮层(层V)振荡活动层V低功率在层与层二世,意味着权力只是60±10区γ μ V²和平均峰值频率相似层二世 39.19 ± 3所示。1 赫兹。

当我们应用ACPA同时记录在第五层,我们观察到显著增加意味着伽玛电源(图 3(a)) 38.1 ± 13.4 %的控制( P≤0。, nγ= 9),然而,基线功率很低在这一层,和γ的绝对变化很难辨别。峰值频率又略有减少 36.0 ± 2。4 赫兹,但这不是重要的 P≥。31, n= 9)。在后续添加CB1R-specific反兴奋剂LY320135,有强劲增长正常化伽马108.4±58%的控制,这达到意义( P= .049, n= 9)。再次,LY320135没有明显改变意味着伽马峰值频率( 35.7 ± 2.41 在LY320135赫兹, P≥。45, n= 9)。

当β权力层V进行了分析,我们注意到一个类似的模式观察放射性药物反应。意味着权力在β频带面积低于伽马活动 9.6 ± 0.6 μ V²测试频率和平均控制 27.9 ± 0.52 赫兹。图 4(一个)显示字段记录振荡在第五层药物应用和ACPA和LY320135时期。图 4(b)显示了活动之间的带通滤波的功率谱密度2 - 100赫兹,和图 4(c)显示了类似的数据过滤测试频率(15 - 29赫兹)。如图 4(c)显示,有轻微倾向增加β权力(27±14%)ACPA在一些录音,但这不是重要的整体( P≥0。06, n= 9)。ACPA意味着β峰值频率(没有显著影响 28.4 ± 0.7 赫兹, P≥0。5, n= 9)。接下来应用反向激动LY320135时,我们注意到增加正常化beta 142.4±88%的控制,这就没有意义( P≤。07, n= 9)。LY320135 ( 26.3 ± 1.5 赫兹, P≥。3, n对峰值频率= 9)没有影响。

我们提出的缺乏影响ACPA第二层可能反映出本构或滋补激活CBR,或许是由于持续kainate-induced锥体神经元的激活。为了验证这个假设,我们应用LY320135 ACPA的缺失。应用LY320135抑制伽马乐队活动19.5±11%的控制,这是非常重要的( P≤幅, n= 5)。当β活动测量时,很明显,在LY320135,显著减少意味着正常化β权力(58.4±12%的控制; P≤.04点, n= 5)。

到目前为止提供的数据表明,在一般情况下,γ和β力量减少层二世为了封锁或逆CB1R激动,在第五层,相反的是,γ和β增加力量。数据 5(一个)- - - - - - 5 (b)条形图显示总结指示ACPA和LY320135正常化的影响意味着权力在区域γ和βmEC的乐队在第二层次和V。

我们提出改变振荡功率在药物应用程序将与ACPA的影响和LY320135 sIPSCs撞击在深度和表面内嗅皮层神经元。衡量这些影响,我们执行sIPSCs全细胞电压钳记录,而浴应用ACPA和LY320135浓度类似上面使用的。

图 6(一)显示了典型的录音内sIPSCs由一层二世锥体神经元。如图 6 (b)所示,ACPA(10的应用 μ 米)在层二世sIPSCs微妙的影响,减少他们的频率不影响意味着振幅。累积概率情节sIPSC振幅在ACPA的存在(图 6 (c))表示振幅分布的变化,和平均振幅显示略有增加 101.7 ± 3所示。2 爸爸在控制 108.3 ± 3所示。4 在ACPA pA,但这是不重要的( P≥。168,一个NOVA). When we analysed amplitude distribution using the nonparametric Kolmogorov-Smirnov test, the shift towards higher amplitude sIPSCs was just significant ( P≤。021 KS测试)。对于interevent间隔(迅速;频率的倒数),我们注意到转向正确的累积概率图(图中 6 (d)),表明增加的可能性更加迅速的值(减少频率)。意味着值迅速增加 34.6 ± 5。5 在控制毫秒 47.6 ± 9.7 在ACPA毫秒( P≤。0001年,方差分析, n= 5),迅速的增加时间分布对高值是非常重要的( P≤。006年,KS测试)。当我们进行了类似的实验使用LY320135(500海里),我们指出影响倾向于相反ACPA所报道的,也就是说,增加sIPSC振幅和频率。图 7(一)显示了一个典型的录音内sIPSCs由layer-II锥体神经元。如图 7 (b)所示,应用LY320135 sIPSC频率和振幅增加。意思是振幅增加从 51.7 ± 3所示。6 爸爸在控制 69.0 ± 5。9 在LY320135 pA,这是重要的( P≤。013,一个NOVA, n= 6)。同样的,对于较大的振幅分布的转变是非常重要的( P≤。002年,KS测试)。平均中位数迅速出现了轻微的下降 86.6 ± 15.8 在控制毫秒 80.6 ± 16.1 毫秒LY320135,但这种迅速的下降时间不显著( P≥。116,一个NOVA, n= 6)。

的累积概率情节sIPSC振幅(图 7 (c)),并迅速的(图 7 (d))在LY320135表明这些参数的变化分布在LY320135的存在。

与观察到的影响在一层一层二世和V我们提到显著减少sIPSC频率响应ACPA应用程序。如图 8(一个)显示,sIPSCs在第五层相当少比层二世(看到Woodhall et al ., ( 17])。ACPA应用时,sIPSC频率大大减毒(图 8 (b)),但没有证实了整体振幅分布的变化(无意义的KS测试( P≥23)))。平均幅度小幅上涨 59.41 ± 7.33 爸爸在控制 70.49 ± 8.89 在ACPA pA,但这并没有显著增加( P≥。33,一个NOVA, n= 6)。当我们分析迅速,分布的变化对大迅速的值是重要的( P≤。0001 KS测试),意味着平均迅速被发现明显增加从792±41毫秒控制ACPA(1317±75毫秒 P≤。0001年,方差分析, n= 6)。这种效应的ACPA迅速在第五层在所有记录是一致的。累积概率情节sIPSC振幅(图 8 (c)),并迅速的(图 8 (d))说明ACPA sIPSC振幅和迅速的影响。

当我们进行了类似的实验使用LY320135(500海里),我们再次强劲的影响,指出反对ACPA所报道的,也就是说,增加sIPSC振幅和频率。图 9(一个)显示了一个典型的录音内sIPSCs由layer-II锥体神经元。如图 9 (b)显示,sIPSCs LY320135有显著影响的应用程序层V,增加他们的频率和振幅。意味着sIPSC振幅在第五层增加从47.0 pA±3.0到87.9 pA±7.4 pA LY320135,这增加显著( P≤。001年,方差分析 n= 7)。累积概率情节sIPSC振幅在LY320135的存在(图 9 (c))显示振幅分布的变化,这是确认统计( P≤。0004年,KS测试)。在迅速的情况下,我们注意到左移的累计概率图(图 9 (d)),指示的增加迅速下降的可能性值(频率增加)。在LY320135应用均值中值迅速下降 477.1 ± 108.0 在控制毫秒 300.0 ± 71.5 毫秒LY320135显示一个整体sIPSC发生频率的增加。的减少意味着值之间迅速控制和LY320135时期是重要的( P≤。014一个NOVA, n= 7)分布的变化( P≤。016,KS test).

我们发现大麻素受体激动剂ACPA几乎没有影响突触抑制振荡活动或在mEC的肤浅的层,这影响深度层更强劲,尤其是在sIPSC频率。然而,反兴奋剂,LY320135强烈抑制振荡活动表面mEC即使对sIPSC频率和振幅的影响并不大。我们还观察到抑制振荡活动层二世的LY3201235伴随着增加振荡权力层的V,而抑制sIPSCs由LY320135 ACPA和随后的增强在这一层明显。

我们以前报道 17],自发的抑制是mEC表面层二世的大得多比深层V .此外,超过90%的第二层的细胞则是动作电位(AP)独立,而在第五层,AP-dependent事件组成更大的(> 50%)的sIPSCs比例。鉴于cbr法只在Ca^{2 +}释放GABA和没有影响依赖mIPSCs ([ 8];似乎大麻素配体深度层中表现出更大的作用,在基线活动低,调制可能更敏感,因为它更有可能是AP-dependent。

层二世相比,自ACPA和LY320135有更深刻的影响突触抑制在第五层,似乎mIPSCs的相对优势层II可能面具CB1R影响的少数AP-dependent sIPSCs在某种程度上。缺乏一个强大的V ACPA对振荡活动层的影响表明,然而,CB1R可能已经被激活的正在进行的网络活动,并进一步尝试激活使用兴奋剂没有增加任何CB1R对振动能量的影响。这似乎是支持反兴奋剂的影响LY320135层二世。这里,我们观察到一个健壮的减少β和γ权力层二世,这表明CB1R确实有助于维持振荡活动在这一层。增强的振荡活动的明显矛盾的结果在第五层在回应LY320125可能与第二次要活动层的影响,例如,Bragin [ 11),体内工作,指出,烧蚀表面的EC导致CA3-CA1振荡活动增强,这可能是一个类似的机制允许抑制振荡的V层二世向全世界揭示活动层,从CA1接收输入。同样,先前的报道( 15]表明,表层(尤其是第三层)显示伽马最强的力量,也许暗示作用在推动在其他层振荡活动。然而,不直接驱动层V层II或III ( 19在第五层),因此任何影响很可能是间接的。

大麻素受体发挥强大的GABA从突触前释放控制终端,与CB1受体可以抑制IPSPs和万能锥体神经元(IPSPs, ( 20.];万能, 8])。内源性大麻素,如2-arachidonyl甘油也叫花生四烯酸乙醇胺抑制抑制中枢神经系统(见[ 21),审查)。大麻类也认为调解depolarisation-induced抑制抑制的现象(DSI;( 22- - - - - - 24])。最近,研究表明,CB1R存在终端从抑制性中间神经元的特定子集。例如,快速飙升(FS)抑制性神经元在大脑皮层表达小清蛋白(PV)但不是CB1R,相比之下,不规则的飙升(是)神经元表达CB1R但不是PV ( 25, 26]。最近,Galaretta et al。 27)表明,突触是神经元之间和锥体细胞表达CB1R和DSI展示,而FS神经元之间的突触和显示CB1R和DSI锥体细胞。FS细胞被认为快速振荡网络速度节奏如γ活动([ 28];是细胞被认为拥有属性,使对nonrhythmic活动( 25, 29日]。一个子集的神经元表达CB1R但不是光伏表达缩胆囊素(CCK),这些神经元已经提出,通过DSI子组锥体细胞分化成神经元组件然后携入的FS细胞(“稀疏编码”电池组件, 30.])。在这个场景中,锥体细胞激活导致神经的合成和释放,抑制单元格输入somata和近端树突的活跃细胞,但允许IS-cell-mediated抑制保持不变(和正在进行的)不活跃金字塔。这种效果,反过来,允许FS-cells乘火车振荡活动只有在锥体细胞的抑制人口,有效地选择子集的节律性活动。

似乎可能的PV−/ CCK + / CB1R +抑制性中间神经元可能同样选择数量的锥体细胞参与rhythmogenesis mEC,其中包含两个光伏+和PV−神经元( 31日, 32和CCK +中间神经元 33],也表达CB1R [ 34]。我们使用大麻素受体选择性逆受体激动剂在全球范围内抑制CB1Rs期间持续γ和β频带mEC的脑切片的振荡。条件下CB1受到封锁或反向激动效应,我们观察到减少振荡在γ和β乐队在第二层。这是符合上述文献[ 27, 30.),我们建议,在层二世,封锁或逆的cbr导致不规则的相位的增加抑制激动就是细胞到锥体细胞,减少可用的人口参与网络振荡功率振荡,从而减少字段。这似乎是由我们的电压钳记录表明LY320135阶段增加gaba ergic抑制在主要的细胞层。

当我们测量振荡活动层V,逆在CBR受体激动剂 增加γ和β权力,这似乎与降低表面的β和γ力量。然而,乍一看,这似乎矛盾的振荡活动在特定薄片不是孤立存在的,我们可能期望之间的相互作用,以及在网络的神经元。Bragin et al。 11)表明,体内,两国消融EC抑制放射性的齿状回(DG),但在CA3-CA1增加伽马振荡。正如前面讨论的,肤浅的mEC项目DG, CA1项目深mEC层。考虑到在我们的实验中,振荡活动表面mEC是镇压,暗示这可能是合理的抑制伽马和/或测试活动在CA3-CA1 DG,提高此类活动。反过来,这将饲料到第五层,γ和β能力增强。因此,尽管阶段抑制层V LY320135似乎增加,可能是这种效果是没有参与选择第五层的神经元振荡活动的程序集;相反,兴奋性输入这个地区从海马锥体细胞活动可能是占主导地位的影响。