实验动物管理协议和被依照美国国立卫生研究院指导实验室动物保健和使用的( 31日),并经伦理委员会批准使用实验动物,落脚,智利大学。女性Sprague-Dawley老鼠纯化等热量的饮食包含正常(25%酪蛋白,提供22.5%的蛋白质)或低(8%酪蛋白,提供7.2%的蛋白质)的蛋白质。纯化的其他组件饮食如下。(我)正常饮食:碳水化合物,50.2%;脂肪,15.0%;维生素混合,1.0%;盐混合,4.7%;水、1.7%;纤维素、4.2%;L-methionine, 0.4%。 (ii) Low protein diet: carbohydrate, 66.5%; fat, 15.0%; vitamin mix, 1.0%; salt mix, 4.7%; water, 1.0%; cellulose, 4.2%; L-methionine, 0.4%. Both diets provide about 4.3 Kcal/g. The dietary paradigm was started 1 day after mating and continued throughout pregnancy. The body weight gain of the pregnant mothers was controlled daily. At birth, all pups were weighed and litters were culled to 8 pups (4 males, 4 females). Afterwards, pups born from mothers fed the 7.2% protein diet were fostered to well-nourished dams (22.5% protein diet) giving birth on that day. Pups born from mothers receiving the 22.5% protein diet were also fostered to well-nourished dams in order to equalize among groups other factors that may depend on the rearing conditions (i.e., stress due to cross-fostering). After weaning, at 22 days of age, all pups were fed a standard laboratory diet providing 22.5% protein.

实验进行了16正常和营养不良大鼠则高达55 -天的年龄。大鼠的体重,和1.5克/公斤ip聚氨酯麻醉,放置在一个立体定位器在人工通风。强化麻醉实验期间没有必要因为手术和录音持续不超过3个小时,在我们的经验中,1.5克/公斤ip聚氨酯引发深刻的麻醉持续超过6小时。动物从来没有恢复意识,没有心率的变化,以应对刺激发现整个实验。

现场反应的电刺激诱发左内侧EC侧枕叶皮质区或侧腹CA1海马区域,在一个交替的方式。左侧枕叶接触后,枕叶皮层电刺激和腹侧CA1海马区域进行并排通过两个独立的双极电极由每两个粘,parylen-insulated, 50 - μ 米钨线0.8毫米分离。一个刺激电极放置在左侧枕叶皮质区坐标 一个 = − 5.8 , l = − 3所示。5 毫米,以这样一种方式,不再提示渗透皮层,1.0毫米。另一刺激电极是先进的腹侧CA1区坐标 一个 = − 5.5 , l = − 5.0 , V = 7.0 在毫米。最近指出,越来越腹CA1区刺激活动越来越内侧的内侧区域内嗅区( 32),进而获得更多强烈的视觉输入通过海马旁皮质(postrhinal皮质大鼠( 7])。

场反应记录从左边内侧EC并肩与另一个双极电极(两个粘,parylen-insulated 50 - μ 米钨线0.8毫米提示分离)定位坐标 一个 = − 7.5 , l = − 5.0 , V = 6.5 越长,提示大脑腹侧表面以上0.1 - -0.2毫米。配置和定位记录电极对进入欧盟允许一个双极电极的尖端到层ii iii和附近的其他提示层诉虽然双极电极装置不允许执行层流分析潜在的逆转,它最大化场记录相应的神经元去极化(活跃的内向电流或水槽)位于靠近一个电极,同时最小化这些遥远的当前发电机生产的影响,而同样的两个电极的技巧。因此,双极电极似乎特别适合铺排记录从层流皮质结构如欧共体、微分激活的神经元层ii iii neocortical-EC通路,或层V CA1-EC传入,将创建,分别浅和深水槽。Rostrocaudal ( 一个 )和横向( l )坐标是相对于前囱,而垂直( V )坐标是相对于皮质表面,所有来自Paxinos和华生( 33]。图 1显示了一个方案,老鼠大脑的两个冠状面说明刺激电极的位置在枕叶皮质区和腹侧左半球的CA1区,以及记录电极的位置在侧EC。测试刺激,交替应用于枕叶皮层(在2.5分钟)或腹侧CA1区(2.5分钟)期间,由100微秒的时间产生的方波脉冲在0.2赫兹的草S11刺激器与草SIU-5刺激隔离单元和草1情事属实者,恒流单元(Astro-Med Inc .)、西沃里克,RI,美国)。双相记录电子商务领域的枕叶皮层刺激的反应包括一个更大的上行负波向下,后跟一个正组件。表面负反应已经记录在体内EC的老鼠在梨状皮质的刺激( 34]。反过来,电子商务领域应对CA1刺激开始显著下降表面积极向上偏转,后跟一个晚负表面波的振幅小。体内表面正场的记录反应EC的老鼠在CA1刺激最近报道( 35- - - - - - 37]。因此,只有负抗枕cortex-EC响应和积极的抗CA1-EC反应测定在目前的实验。在开始每个实验之前,两个完整的输入输出系列、枕叶皮质区和其他CA1,进行200 - 1200的刺激强度 μ 答:测试与抗刺激和刺激强度屈服EC反应峰值振幅最大的50%被用于实验的其余部分。因此,测试刺激应用于枕叶皮质区相同频率和持续时间的应用于CA1,而是不同的强度。EC反应诱发枕叶皮质区和CA1区也受到10-pulse, 30 Hz刺激为了测试响应遵循重复刺激的能力。像其他地方显示 34, 38),多突触的组件通常失败频率< 40 - 50赫兹,而单突触的组件应该遵循频率在100赫兹。在30分钟的稳定时间的交替枕叶皮质区和CA1刺激与测试刺激,2.5分钟控制时期的EC基底反应(30平均响应)诱发的枕叶皮层记录,其次是另一个2.5分钟控制时期的EC基底反应(30平均响应)诱发的CA1区。此后,LTP是在内侧EC应用强直刺激诱导的枕叶皮质区(8正常和8营养不良大鼠)或腹侧CA1区(8额外的正常和8额外营养不良大鼠)。强直刺激由三个高频列车(100微秒方波脉冲在312 Hz) 500毫秒的时间,应用每30秒刺激强度为50%高于各自的测试。这样一个刺激协议已被证明诱导饱和LTP EC,至少在梨状皮层的激活EC清醒大鼠,这意味着后续应用程序的额外列车未能诱发进一步增加现场响应( 34]。密切相似的刺激协议(3列车200毫秒的刺激在250 Hz intertrain间隔30秒)应用于CA1海马区域已报道产生可靠的LTP感应uretanized EC的老鼠( 37]。

录音被草p - 511前置放大器放大(0.8 -1000赫兹的带宽),并显示和平均飞利浦3365点数字示波器。他们也数字化10000 /秒的速度由a / D转换器界面上的宏碁电脑,为检索和存储和离线分析。在所有的实验中,体温和过期有限公司₂被监控,保持在正常范围内。早期组件的延迟和峰值振幅峰值平均场的响应测量使用时间和电压数字示波器中提供的游标。斜率确定振幅/时间比在最近的样本之间的10%和90%的水平游标设置开始和早期的正面或负面的波的峰值(见图 1第一和第二箭,分别地。录音(A和C))。火车引起强直性痉挛的功效,加强大脑皮层诱发反应是评估通过测量峰值振幅和最大斜率增加。结果相似但前过程的可变性较低意味着通过统计方差(显示),所以振幅被用于实验的分析。

两个小时后枕叶皮质区或CA1 tetanization,电生理实验完成后,这些动物被斩首了,大脑迅速删除和重,左和右ECs解剖。平均的平均体重切割内嗅区(不考虑左或右大脑半球的起源) 5.77 ± 0.61 对正常大鼠和 5.30 ± 0.50 营养不良的动物(平均±SEM)。这些样本存储 − 80年 ° C 之前使用。后来,组织检查由ELISA BDNF蛋白的表达水平。

整个欧共体在冰冷的均质样品裂解缓冲,包含137毫米氯化钠,20毫米Tris-HCl (pH值8.0),特里同x - 100 1%, 10%的甘油,2 μ L /毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒P8340 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。组织匀浆的解决方案在14000 x g离心5分钟 4 ° C 。收集上清液和稀释在缓冲DPBS 1/5,然后在1 N盐酸酸化。然后他们被孵化15分钟在室温和1 N氢氧化钠中和直到pH值7.6。脑源性神经营养因子是评估使用E-Max免疫测定系统酶联免疫试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊Promega,有限公司)。简单,标准96 -乘NUNC-immuno maxisorp一夜之间,ELISA板被孵化 4 ° C 单克隆抗体anti-BDNF。盘子都被孵化1小时在室温下(RT)一块1 x和样品缓冲。连续稀释的已知数量的BDNF从0到500 pg / mL进行重复测定标准曲线。井包含标准曲线和脑组织匀浆上清液在室温下2小时孵化,指定的协议。然后他们被孵化与二次反人类的BDNF在室温下2小时多克隆抗体,为指定的协议。一种特异的抗体结合辣根过氧化物酶被用于叔在室温下反应1小时后这孵化的一步。三甲一个解决方案是用于开发井的颜色。这个反应被终止1 N盐酸在一个特定时间(10分钟)在室温下,然后吸光度是记录在450 nm标40分钟内停止反应。生成值测定与BDNF的回归线,表示为pg BDNF / mg湿重。使用这个工具,BDNF可量化的7.8 -500 pg / mL。

所有统计分析GraphPad Instat version 3.00 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。饮食治疗对身体和大脑的影响的权重,使用未配对学生的组间比较 t 以及。LTP的时间进程的分析研究中,社会团体内部的比较进行了单向方差分析Dunnett紧随其后的事后多重比较检验。分析BDNF蛋白表达的结果,组间比较正常,营养不良组用未配对的学生 t 以及,tetanization的影响评估时使用非参数方差分析(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)其次是邓恩的事后多重比较测试。

身体和大脑重量测量显示,没有明显差异在孕妇体重增加获得7.2%或22.5%的蛋白质饮食(数据未显示)。完整的数据这种饮食治疗对孕产妇的影响体重增加在第一,第二,第三周的妊娠发表在其他地方( 26]。天1 8则高达55 -产后的生活,没有发现显著差异在身体和大脑重量之间出生的老鼠从母亲获得7.2%或22.5%的蛋白质饮食(表 1)。

在老鼠的则高达55 -天的时代,双相记录基础电子商务领域的枕叶皮层刺激反应由一位著名的向上负波紧随其后的是一个积极的组件。这符合并排排列的双极电极位于EC,不再提示的地方将记录早期浅水槽内星状和锥体主要神经元的去极化产生的输入层ii iii(有关,而沉默深层)。相比之下,基底EC反应CA1刺激开始显著下降正偏转,后跟一个后期表面负表面波,这是符合记录通过短尖锥体细胞的早期去极化产生的深沉在输出层图 1(一)显示典型的录音基底(A和C)和强(B和D)平均电子商务领域反应的刺激所激活的枕叶皮质区(A和B)或CA1区(C和D)。在正常的富营养的老鼠,出现和峰值延迟早期的消极成分基底EC反应诱发的枕叶皮质区 18.7 ± 2。2 和 30.6 ± 1。8 分别毫秒,而早期的发病和峰值延迟在基底反应诱发从CA1正波 9.6 ± 0.7 和 17.9 ± 0.8 毫秒(图 1 (b))。对于两种类型的反应,延迟增强作用前后的差异没有统计学意义(成对的学生的 t 以及, N = 8 )。形状、延迟和波振幅基础领域的反应诱发的EC先天营养不良的老鼠,从枕叶皮质区或CA1区,没有不同于正常的富营养的老鼠(未配对的学生的 t 以及, N = 8 在每组)。频率的测试表明,早期的组件EC潜在诱发枕叶皮质区与刺激30赫兹的频率下降迅速,因此建议多突触反应的性质。相比之下,欧盟的早期组件响应引起CA1能够遵循30 Hz刺激频率降幅不到20%,这是单突触的反应的特征。

在正常动物,强直刺激适用于枕叶皮质区或CA1海马区域产生的振幅峰值大幅提高组件诱发侧内侧EC的早期,在录音期间保持不变(图 2)。引起强直性痉挛后枕叶皮质区,早期负波枕叶皮质区测试刺激强皮层测试刺激所有块在时间进程(从107年的136%,Dunnett多个对比测试)除了2.5块5分钟,虽然没有明显的增强作用CA1刺激早期组件EC中可观察到反应(Dunnett多个对比测试);然而,短暂但完全抑制早期观察块0 - 2.5分钟。引起强直性痉挛后腹侧CA1, EC的早期正波反应CA1测试刺激强在所有块在时间进程(从59到72%,Dunnett多个对比测试)除了2.5块5分钟,虽然没有明显的增强作用枕叶皮层刺激被观察到。

发生在正常对照组相比,无显著增加早期的电子商务领域的组件反应诱发的枕叶皮质区或CA1区( P > 0。 块,观察Dunnett多个对比测试)在动物营养不良应用皮层和海马强直刺激(图 3)。

连续稀释已知数量的BDNF的范围从0到500 pg / mL允许确定一个标准曲线证明直接光密度和BDNF浓度之间的关系( r 2 = 0.9106 )。

表 2显示应用程序的强直刺激左CA1区在正常大鼠的BDNF浓度导致显著增加身体的同侧的EC ( P < 0。 ,邓恩的多个对比测试)tetanization后两个小时,而应用程序的强直刺激左侧枕叶皮质区没有明显修改侧EC BDNF水平。相比之下,强直刺激适用于枕叶皮质区或CA1营养不良大鼠海马区是无效的在修改同侧EC BDNF浓度。表 2还表明,在天则高达55 -产后的生活,营养不良大鼠表现出显著的低浓度的BDNF蛋白的内侧EC(对应nonstimulated大脑半球)比正常动物中观察到相同的年龄( P < 0。 ,未配对学生的 t 以及)。