心肌梗死 炎症介质 1466 - 1861 0962 - 9351 Hindawi 10.1155 / 2022/9241261 9241261 研究文章 研究Anti-demyelination Bu-Shen-Yi-Sui机制胶囊在中枢神经系统基于网络药理学和实验验证 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7497 - 2441 咋 郑 1 刘 Yi-Jiang 1 刘 如果像 1 张 南 1 李 Jun-Ling 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7941 - 5289 气 方 1 金 Liang-Yun 2 雪 必应 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 0013 - 1134 杨 道 3 方ydF4y2Ba Yong-Ping 3 赵 回族 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 5331 - 0318 王 Lei 1 张 冯 1 中国传统医学的学校 北京重点实验室理论研究中医抵押品疾病 首都医科大学 北京100069年 中国 ccmu.edu.cn 2 核心设备中心 首都医科大学 北京100069年 中国 ccmu.edu.cn 3 北京天谭医院 首都医科大学 北京100070年 中国 ccmu.edu.cn 2022年 12 7 2022年 2022年 13 4 2022年 16 6 2022年 12 7 2022年 2022年 版权©2022郑咋et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景/目的。多发性硬化(MS)和视neuromyelitis(动)是最常见的自身免疫性脱髓鞘疾病的中枢神经系统(CNS),和一些类似的病理和临床特征。Bu-Shen-Yi-Sui (BSYS)胶囊,中药处方,已被证明是一个潜在的治疗代理与动女士。然而,其antidemyelination机制在中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病尚未完全阐明。本研究旨在探索的关键部件和潜在机制BSYS治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病(CNSD)基于网络药理学。 方法。的潜在活性成分和相应的潜在目标BSYS胶囊从TCMSP获得,BATMAN-TCM、瑞士目标预测平台,和文学研究。疾病的目标CNSD探索通过GeneCards和DisGeNET数据库。匹配的目标在CNSD BSYS从文氏图确定。蛋白质的相互作用(PPI)网络是使用生物信息学方法构造。基因本体论()函数和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路富集分析预测BSYS的机制。此外,BSYS的神经保护效应进行评估使用细胞模型的过氧化氢(H2O2-)在oln - 93细胞诱导细胞死亡。 结果。共有59 BSYS胶囊的潜在生物活性成分和227十字路口的目标。拓扑分析表明,AKT PPI网络连接度最高。富集分析显示,BSYS治疗的目标CNSD PI3K-Akt和MAPK信号通路,以及其他途径。去分析结果表明,目标是与各种生物过程,包括细胞凋亡、活性氧代谢过程,和氧化应激反应等。科汉解释说实验结果表明BSYS含药血清H减轻2O2增加全身的LDH、MDA和ROS水平和逆转SOD和线粒体膜电位的下降引起的H2O2。BSYS治疗也TUNEL(+)细胞的数量减少,bcl - 2表达下调表达,调节伯灵顿和c-caspase-3表达式通过促进一种蛋白激酶磷酸化。 结论。BSYS胶囊缓解H2O2全身oln - 93细胞损伤通过增加一种蛋白激酶磷酸化,抑制氧化应激和细胞凋亡。因此,BSYS可能用于CNSD治疗。然而,这项研究的结果只是来源于体外实验,缺乏体内动物模型的验证,这是我们研究的一个限制。我们将进一步核实BSYS的潜在机制在动物实验中在未来。

 中国国家自然科学基金 81873252 1。介绍

多发性硬化(MS)和视neuromyelitis(动)是主要的中枢神经系统脱髓鞘疾病(CNSD) [ 1),这是最常见的神经系统残疾的原因在年轻人 2]。女士与动是慢性神经系统疾病,其特征是脱髓鞘和轴突损伤中枢神经系统(CNS) [ 3]。他们可能会出现四肢无力、视力障碍、疲劳、和共济失调( 4, 5]。因此,与动女士对个人和社会产生沉重的负担。除此之外,它已经表明,持久的成熟的少突胶质细胞凋亡病变病灶导致进步的髓鞘脱失( 6]。现代医学使用免疫抑制剂和免疫调制剂作为CNSD[的主要治疗方法 7),旨在缓解神经免疫活动。然而,总体结果并不令人满意。因此,有必要探索更有效和更安全的治疗药物以减少少突胶质细胞的凋亡,导致患者的慢性髓鞘脱失女士与动。

由于多组分,multitargeting优势再加上一些副作用与中国传统医学(中医),它已受到更多的关注作为神经退行性疾病的潜在治疗选择( 8]。中医可以发挥显著的疗效在治疗中枢神经系统髓鞘脱失( 9, 10]。中医不仅导致那么严重症状,减少复发,也避免了与免疫抑制剂相关的副作用和不良反应,导致其在中国的长期应用程序作为辅助治疗。例如,Bu-Shen-Yi-Sui胶囊(BSYS)已经被用于临床治疗[女士 11)与动( 12了十多年,取得了良好的疗效改善生存和生活质量。BSYS由几种中药包括 生地黄基数(Dihuang DH), Polygoni Multiflori基数(Heshouwu HSW), Rhei基数等根茎(皇岗,长音), Leonuri草(Yimucao YMC), Fritillariae Thunbergii球(Zhebeimu ZBM), 水蛭(深圳Shuizhi), 天蝎座(Quanxie QX), 天麻(TM),天马 Forsythiae果实(Lianqiao LQ)。我们以前的研究表明,BSYS改善轴突损伤通过抑制NogoA /是和RhoA /岩石信号通路在实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)小鼠( 13]。此外,BSYS起到神经保护作用通过调节T细胞的极化 14和小胶质细胞 15缓解脱髓鞘。然而,中医经常包含不同的组件,可能会有多个目标,从而赋予广泛的药理活性。因此,BSYS及其潜在的神经保护作用机制在治疗中枢神经系统脱髓鞘仍有待阐明。

网络药理学的策略可以帮助在学习复杂的中药化合物和提供一个方法,探索中医的治疗机制( 16]。网络药理学是一种新型的学科,集系统生物学、polypharmacology,计算网络分析( 17]。这是一个新颖的方法用于研究交互网络包括药物,疾病,和目标基因。成功地进行了综合网络分析从系统层面揭示药物的潜在机制( 18]。同样,中医网络药理学提供了一个全面的方法,探索复杂中药的活性成分和疾病之间的关系的目标,适合学习TCM-related问题。

在目前的研究中,网络药理学是用来发现的潜在机制对中枢神经系统脱髓鞘BSYS,这表明antidemyelination BSYS效果与调制Akt-mediated氧化应激有关。在这项研究中,受伤的oln - 93细胞模型建立了H2O2模拟oligodendroglial氧化损伤引起的髓鞘脱失的发生。模型显示,氧自由基增加,线粒体膜电位异常,downregulation Akt通路,少突细胞凋亡。所以,我们测量了水平的氧化应激和细胞凋亡标记oln - 93细胞BSYS治疗后。目前的研究旨在调查BSYS oln - 93细胞的神经保护效应与H2O2全身的氧化损伤和验证的一种蛋白激酶信号通路参与。

 2。材料和方法 2.1。BSYS生物活性成分和目标基因集合预测

中医系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, https://tcmspw.com/tcmsp.php)[ 19)和生物信息学分析工具对中药的分子机制(BATMAN-TCM, http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[ 20.)被用来寻找潜在的生物活性成分BSYS胶囊。原料的筛选标准是基于TCMSP的建议,其中包括 口服 生物利用度 OB ≥ 30. % 和 药物 相似 戴斯。莱纳姆: ≥ 0.18 。然而,根据相关文献报道,我们在BSYS胶囊包括一些其他生物活性成分与实际目标但OB较低或DL。靶基因预测使用TCMSP PubChem数据库( https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[ 21],SwissTargetPrediction数据库( http://www.swisstargetprediction.ch/)[ 22根据化合物的分子结构信息。

 2.2。识别和网络建立疾病的目标

CNSD-related目标集成使用搜索词“中枢神经系统脱髓鞘”GeneCards ( https://www.genecards.org/)[ 23)和DisGeNET数据库( http://www.disgenet.org/)[ 24]。我们概述了BSYS基因目标和CNSD疾病相关的目标,然后他们交叉基因通过文氏图可视化工具( http://www.bioinformatics.com.cn)。之后,我们选择了交叉基因,可能在CNSD BSYS胶囊的潜在目标。进一步定义生物活性成分之间的互动关系和潜在的目标,我们使用Cytoscape 3.7.3软件( 25)构建BSYS-ingredient-target网络交叉target-BSYS target-pathway网络和目标。此外,基于交叉目标BSYS胶囊和CNSD (PPI)蛋白质相互作用网络构造Metascape平台( http://metascape.org/gp/index.html)[ 26]。PPI网络的模块被分成不同的集群基于分子复杂的检测(MCODE)算法。此外,选择关键节点,本研究评估交互网络的拓扑属性节点通过计算“学位中心”参数。

 2.3。去KEGG富集分析

十字路口的基因进行了分析 R 包京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路富集。另一方面,基因本体论(去)分析了大卫数据库( https://david.ncifcrf.gov/)[ 27]。浓缩涉及三类:生物过程(BP),分子功能(MF)和细胞组件(CC)。一个调整 P 值< 0.01表示意义和KEGG分析。前十的物品(包括英国石油(BP)、CC或MF)和前20名KEGG通路可视化在条形图和泡沫的情节,分别使用一个基于web的生物信息学工具( http://www.bioinformatics.com.cn/)。

 2.4。科汉解释说BSYS含药血清的制备

BSYS胶囊是由Asia-East生物制药有限公司,有限公司(中国,北京)。科汉解释说我们使用先前描述的步骤来获得BSYS含药血清(BSYS血清)和空白血清( 28]。成人Sprague-Dawley (SD)老鼠体重介于180到220 g维持在一个特定的无菌状态。BSYS intragastrically管理到SD大鼠(11.7克/公斤体重)每天两次一个星期。第七天,老鼠牺牲填喂法喂养2 h后,然后收集血液样本和离心获得血清样本。控制老鼠用相同数量的水管理提供空白血清。

 2.5。细胞培养和治疗

oligodendroglial细胞系,oln - 93,购买从希伯来文名字文化集合(BNCC,北京)。oln - 93细胞生长与10%胎牛血清的DMEM(美国纽约康宁)和1% penicillin-streptomycin(南京凯基生物,中国)37°C公司5%2湿润的气氛。oln - 93细胞被刺激with100 μmol / L H2O212 h ( 29日]。媒介置换后,细胞治疗BSYS血清24 h。LY294002(美国丹弗斯CST)溶解在二甲亚砜。oln - 93细胞preincubated LY294002 (25 μmol / L) 1 h [ 29日前政府的H2O2。

 2.6。细胞计数工具包(CCK -) 8化验

oln - 93细胞被播种在96 -孔板24 h, h刺激2O2,科汉解释说,然后处理BSYS含药血清(5%、10%。15%、20%和25%)24 h。细胞生存能力评估了CCK-8工具包(Dojindo、熊本、日本),遵循制造商的指示。吸光度测量的标在450海里。

 2.7。测量LDH、MDA和SOD oln - 93细胞

oln - 93细胞被播种在24-well板24 h。100年 μmol / L H2O2添加,然后细胞培养12 h。15% BSYS血清添加和孵化24小时。细胞溶解产物收集并用于确定丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),而获得介质是用来测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH的相对含量、MDA和SOD测定根据指令相应的商业工具(Beyotime、上海、中国)。

 2.8。评价细胞凋亡

赫斯特染色进行使用现成的赫斯特染料溶液(Solarbio,北京)。短暂,丢弃培养基后,oln - 93细胞孵化与赫斯特染色溶液在37°C 20分钟在黑暗中。PBS的细胞被洗,然后在荧光显微镜下分析。一步TUNEL细胞凋亡测定工具包(Beyotime、上海、中国)被用来执行TUNEL分析,按照制造商的说明。短暂,oln - 93细胞被固定,permeabilized,然后在黑暗中孵化与TUNEL反应混合物在37°C 1 h。细胞核与DAPI复染色(bios,北京)。

 2.9。测定细胞内活性氧(ROS)

总细胞内ROS水平被活性氧测定评估工具包(Beyotime、上海、中国)。简而言之,这些细胞被贴上10 μmol / L 2 ′ 7 ′ 二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA) 37°C为20分钟。然后,ROS和荧光显微镜成像。

 2.10。线粒体膜电位的检测(MMP)

改变oln - 93细胞MMP的评估使用增强线粒体膜电位测定与JC-1工具包(Beyotime、上海、中国)。细胞样本沾JC-1染料工作方案,遵循制造商的指示。之后,oln - 93细胞冲洗与JC-1染色缓冲区。MMP的变化被量化的相对荧光强度比polymer-to-monomer(红/绿)。

 2.11。免疫印迹分析

总蛋白提取oln - 93细胞匀浆。变性的蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔,达姆施塔特,德国)。StartingBlock阻断缓冲区的膜被封锁(美国沃尔瑟姆ThermoFisher),然后在孵化一个通用抗体稀释剂(新细胞和分子生物技术、苏州、中国)一夜之间在4°C主要抗体伯灵顿(Proteintech,武汉,中国),bcl - 2 (Proteintech,武汉,中国),裂解caspase-3 (CST、丹弗斯、美国),p-Akt (CST、丹弗斯、美国),一种蛋白激酶(CST、丹弗斯、美国),或 β肌动蛋白(美国欧文Genetex)。此后,这些墨迹孵化了HRP-conjugated二级抗体(Proteintech、武汉、中国)在室温1小时。蛋白质的乐队与发射极耦合逻辑检测化学发光(微孔,达姆施塔特,德国)和可视化融合外汇成像系统。乐队的强度是由ImageJ量化软件。

 2.12。统计分析

统计分析是在GraphPad棱镜进行7.0(美国圣地亚哥GraphPad软件)。所有的数据都显示为一个 的意思是 ± 标准 偏差 (SD)从至少三个独立的实验。组之间的区别分析了单向方差分析。 P < 0.05 被认为是统计学意义( ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 , ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 )。

 3所示。结果 3.1。潜在的活性成分和BSYS胶囊的目标

我们的筛选和文献挖掘分析显示65潜在活性化合物BSYS胶囊:8从Dihuang成分被确定,从Heshouwu 8, 5从皇岗,从Zhebeimu 5, 7从天马Yimucao和4,从Shuizhi 5,从Quanxie 5,从Lianqiao和12,而4人在多种草药。65年的潜在活性成分在数据库搜索,数据表明,BSYS胶囊有547对应的目标。ingredient-target网络BSYS胶囊由619个节点和1473年的边缘,表明这些草药(图的潜在的协同作用 1和表 S1)。

BSYS胶囊的ingredient-target网络。钻石节点代表的草药,圆节点代表化合物,和广场节点代表了目标。

 3.2。建设“中国Medicine-Active Ingredient-Intersection目标”网络

共有2625个目标基因与中枢神经系统脱髓鞘取自GeneCards DisGeNET数据库(表 S2)。227个重叠基因获得通过的十字路口ingredient-target基因和CNSD-related基因(表 S3),这被认为是目标基因在CNSD BSYS胶囊(图 2(一个))。六个潜在的成分被排除在外,因为他们的目标不相交与疾病的目标。这一分析表明,227重叠基因受59生物活性成分。最后,我们构造了一个活跃ingredient-intersection目标网络包含286个节点和621边缘使用Cytoscape软件(图 2 (b))。

BSYS胶囊和中枢神经系统demyelination-related目标和重叠的目标。(a)的维恩图筛选交叉BSYS胶囊和CNSD-related目标的目标。(b)活性ingredient-intersection目标网络。圆形各种颜色和黄色方形代表着目标和成分,分别。不同的颜色代表不同草药成分,与图一致 1。

 3.3。建设和分析蛋白质交互(PPI)网络

定义PPI网络,我们提交了227交叉目标Metascape数据库如图 3(一个)。结果表明,有226个节点,4859 PPI网络的边缘(表 S4),所有节点的度值降序排列(表中排名 S5)。目标节点与高度值被认为是核心目标。如图 3 (b)十大核心目标包括AKT1 (148), MAPK1 (134), MAPK3(129),小君(123)、表皮生长因子受体(117),NFKB1 (115), MAPK14 (113), ESR1 (111), STAT3(106),和EP300 (103)。分子复杂的检测(MCODE)分析是用来确定网络中具有高度互联的集群区域。在这个分析,PPI网络的模块被分成8集群。另一方面,KEGG通路和GO-BP分析结果表明,这些集群主要是丰富PI3K-Akt信号通路的通路的神经退化,细胞凋亡,和中的刺激神经组织的互动,而去一般条款相关蛋白质磷酸化,对氧化应激反应,凋亡信号通路和细胞外基质拆卸(图 3 (c))。

蛋白质相互作用(PPI)网络BSYS胶囊和CNSD之间的共同目标。(a) PPI网络和(b)前10 PPI网络的重要基因。(c)八从PPI网络集群与相应的描述。

 3.4。去KEGG通路富集分析总交集的目标

227十字路口基因分析功能浓缩和KEGG信号通路浓缩(adj。 P < 0.01 )。数据显示,有2306项(表 S6)。排名前十的英国石油(BP)、CC和MF筛选根据浓缩的分数。如图 4,主要的英国石油公司类别是活性氧代谢过程中,脂多糖,神经元死亡,氧化应激反应,外在的凋亡信号通路。曼氏金融主要包括细胞因子受体结合,核受体活性,ligand-activated转录因子的活动,dna结合转录因子绑定,绑定和蛋白质磷酸酶。另一方面,前五名CCs膜筏,膜microdomain膜区域,囊腔,胞质囊腔。然后执行通路浓缩使用KEGG数据库筛选相关信号通路(调整 P 值< 0.01),表明许多途径与中枢神经系统髓鞘脱失(表相关联 S7)(图 5(一个))。丰富的途径主要包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路,肿瘤坏死因子信号通路,HIF-1信号通路,cytokine-cytokine受体相互作用和细胞凋亡。PI3K-Akt信号通路有最多数量的基因,它包含37个目标。计算值高的20个信号通路被选为泡沫图表。建立一个基因的路径网络,大大丰富了途径和156相关的基因导入Cytoscape(图 5 (b))。节点度呈正相关,形状区域。的网络分析表明基因如MAPK3 MAPK1, PIK3CG, NFKB1, RELA,较大的度,AKT1最高学位(表 S8)。因此,这些基因可能在中枢神经系统脱髓鞘BSYS胶囊的关键目标。此外,数据表明,浓缩总量的分析结果交叉基因通常与3.3一致。综上所述,我们推测BSYS胶囊对antidemyelination提升一种蛋白激酶磷酸化水平影响的受伤少突胶质细胞在CNSD减轻氧化应激细胞凋亡。

基因本体论的227十字路口的目标。十大功能角度选择(adj。 P < 0.01 )。缩写:英国石油公司:生物过程;答:细胞组件;MF:分子功能。

KEGG BSYS胶囊对CNSD浓缩的潜在目标。(一)最高的十大通路数值的显示。 P < 0.01 )。大小和颜色的点代表了价值和计数 P 值,分别。(b)所涉及的网络目标的主要途径。v和方块代表通路和目标基因,分别。节点度和形状面积呈正相关。

 3.5。BSYS血清减轻H <子> < /订阅> O <子> 2 < /订阅>全身oln - 93细胞的细胞毒性

评估的安全BSYS血清oln - 93细胞,我们执行CCK-8试验来确定BSYS血清的浓度是否影响细胞的生存能力。CCK-8结果显示BSYS治疗血清(5% - -25%),24小时没有细胞毒性影响oln - 93细胞(图 6(一))。接下来,我们把oln与H - 93细胞2O225、50、75、100和125 μmol / L诱导氧化损伤。oln - 93细胞的生存能力大大抑制了H2O2浓度从25到125年 μmol / L ( P < 0.0001 )。在政府与100年 μmol / L H2O212 h,细胞生存能力压制到48.03%相比对照组(图 6 (b))。相比之下,对待oln - 93细胞与BSYS血清浓度的10% ( P = 0.0256 ),15% ( P < 0.0001 ),20% ( P < 0.0001 )和25% ( P < 0.0001 )有效地抑制细胞生存能力改善H2O2(图 6 (c))。

BSYS血清减轻H2O2全身的细胞毒性oln - 93细胞。(a)的毒性作用BSYS血清oln - 93细胞由CCK-8分析访问。(b)的可行性oln - 93细胞暴露于不同浓度的H2O2。(c)调查BSYS血清的神经保护作用,oln - 93细胞孵化与H2O2(100 μmol / L) 12 h,然后用不同浓度的血清BSYS为24小时(5% - -25%)。(d) LDH含量、MDA水平,(e)和(f) oln - 93细胞SOD酶的活性以相应的商业工具。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # # P < 0.0001 ;相比之下,H2O2组, ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 ;并与H2O2+空白血清组,▲▲ P < 0.01 ,▲▲▲ P < 0.001 ,▲▲▲▲ P < 0.0001 。

此外,H2O2全身的细胞毒性是伴随着LDH、MDA和SOD失调。如数据所示 6 (d)- - - - - - 6 (f)与对照组(CON)相比,H2O2显著调节LDH和MDA的水平当SOD明显抑制浓度( P < 0.0001 )。与BSYS血清治疗后,LDH和MDA水平明显下降( P < 0.0001 )。此外,治疗BSYS血清SOD水平增加( P < 0.0001 )。然而,管理空白血清对H没有明显的治疗效果2O2受伤oln - 93细胞( P = 0.0649 , P = 0.1719 , P = 0.5214 分别)。

 3.6。BSYS血清抑制H <子> < /订阅> O <子> 2 < /订阅>全身的活性氧积累和MMP在oln - 93细胞抑制

活性氧积累决心与DCF荧光。的DCF荧光明显亮oln - 93细胞暴露于100年 μmol / L H2O212 h相比细胞CON组( P < 0.0001 ),指示一个upregulation ROS。然而,相比之下,H2O2( P < 0.0001 )和空白血清治疗组( P = 0.0001 ),细胞内ROS水平显著抑制与BSYS孵化24 h后血清(数字 7(一)和 7 (b))。因此,BSYS血清可以减少ROS的overgeneration氧化应激。

BSYS血清抑制H2O2-induced oln降低活性氧积累和MMP - 93细胞。(a, b)细胞内ROS水平评估DCFH-DA探针使用荧光显微镜(规模酒吧:25 μ米)和微型板块读者。(c, d) MMP的检测通过荧光显微镜使用JC-1染色。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # # P< 0.0001,而H2O2组, ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 ,并与H2O2+空白血清组,▲ P < 0.05 ,▲▲▲ P < 0.001 。

ROS生产过剩导致MMP的去极化和线粒体功能障碍。我们分析了BSYS血清能否拯救减少H2O2全身使用JC-1 MMP的荧光染料。JC-1骨料(红色荧光)被认为是一个标记的完整的线粒体,而JC-1单体(绿色荧光)显示MMP的崩溃。oln - 93细胞CON组显示亮红色荧光和沉闷的绿色荧光。然而,在刺激与H2O212 h, MMP明显抑制( P < 0.0001 ),就是减少红色比绿色荧光。BSYS血清治疗之后,妥协MMP明显改善( P = 0.0012 )(数据 7 (c)和 7 (d))。因此,BSYS血清有效衰减造成的抑制MMP的H2O2全身oln - 93细胞的氧化损伤。

 3.7。BSYS血清抑制H <子> < /订阅> O <子> 2 < /订阅>全身的细胞凋亡,促进了一种蛋白激酶磷酸化oln - 93细胞

它已经表明,ROS-mediated去极化的MMP是细胞凋亡的主要机制之一。评估BSYS血清在H的保护作用2O2全身的细胞死亡,oln - 93细胞凋亡是由赫斯特33342年检查。数据显示与CON组相比,H2O2刺激表现出典型的凋亡特征( P < 0.0001 ),包括细胞收缩,核固缩,染色质凝聚。H2O2全身的细胞凋亡oln - 93细胞降低了政府与BSYS血清( P < 0.0001 )(数据 8(一个)和 8 (b))。赫斯特染色结果一致,很少TUNEL-positive oln CON组- 93细胞。然而,H2O2治疗显著增加的速度TUNEL-positive细胞( P < 0.0001 ),这降低了孵化BSYS血清,相对于空白血清组( P < 0.0001 )(数据 8 (c)和 8 (d))。

BSYS血清抑制H2O2全身oln - 93细胞的细胞凋亡。(a, b) oln - 93细胞的凋亡细胞核被赫斯特33342年染色。 规模 酒吧 = 25 μ 米 。(c, d)(红色荧光)凋亡细胞被TUNEL检测,和细胞核(蓝色荧光)被DAPI染色。 规模 酒吧 = 25 μ 米 。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # # P < 0.0001 ;相比之下,H2O2组, ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 ,并与H2O2+空白血清组,▲▲▲▲ P < 0.0001 。

此外,相关蛋白质的表达细胞凋亡检测bcl - 2免疫印迹分析,伯灵顿,cleaved-caspase-3 (c-caspase-3)的蛋白质。结果表明,H2O2特别是增加proapoptotic蛋白质水平如伯灵顿( P < 0.0001 )和c-caspase-3 ( P < 0.0001 )与CON组相比显著抑制抗凋亡蛋白的表达(bcl - 2) ( P < 0.0001 )。然而,BSYS血清bcl - 2蛋白水平升高( P = 0.0001 )和抑制伯灵顿的表达( P = 0.0024 )和c-caspase-3 ( P < 0.0001 )(数据 9(一个)- - - - - - 9 (d))。这些结果表明,BSYS血清明显抑制了H2O2全身的细胞凋亡在oln - 93细胞。探索一种蛋白激酶的激活是否参与BSYS在氧化损伤的神经保护效应,分析了一种蛋白激酶的磷酸化蛋白质印迹分析。结果表明,H2O2抑制一种蛋白激酶磷酸化(p-AKT) ( P < 0.0001 )。然而,BSYS血清治疗24小时减毒p-AKT诱导的抑制h2O2( P = 0.0002 )(数据 9 (e)和 9 (f))。

BSYS血清调节apoptosis-related蛋白质和Akt通路的水平。(一)——(d)代表印迹和统计图表相对蛋白质表达的伯灵顿,bcl - 2, c-caspase3 oln - 93细胞。免疫印迹(e, f)代表图像和定量数据p-AKT和AKT oln - 93细胞。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # # P < 0.0001 ;相比之下,H2O2组, ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 ;并与H2O2+空白血清组,▲ P < 0.05 ,▲▲ P < 0.01 ,▲▲▲ P < 0.001 。

 3.8。抑制一种蛋白激酶磷酸化逆转的神经保护效应BSYS血清2 H <子> < /订阅> 2 O <子> < /订阅>受伤oln - 93细胞

确定抑制Akt激活BSYS的神经保护作用减弱,Akt抑制剂(LY294002)被用来减少p-AKT的表达。如数据所示 10 ()和 10 (b),预培养LY294002减毒p-Akt表达式的upregulation BSYS血清诱导的H2O2受伤oln - 93细胞( P = 0.0171 )。

LY294002块BSYS血清在H的促进作用2O2全身。差别p-Akt对这些免疫印迹(a, b)代表图像和定量数据p-AKT和AKT oln - 93细胞。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # P < 0.001 ,而H2O2组, ∗ P < 0.05 ,并与H2O2+ BSYS血清组,▲ P < 0.05 。

调查的影响BSYS H2O2全身的ROS overgeneration和MMP损失Akt介导的激活,oln - 93细胞使用LY294002然后H2O2,其次是BSYS血清治疗。结果表明,与BSYS血清治疗组相比,预处理LY294002明显增加活性氧的生产( P = 0.0004 )(数据 (11日)和 11 (b))和降低MMP的( P = 0.0032 )(数据 11 (c)和 11 (d))。

BSYS血清抑制H2O2全身的活性氧积累并通过调节MMP减少一种蛋白激酶磷酸化oln - 93细胞。(a, b)细胞内ROS水平评估DCFH-DA探针使用荧光显微镜(规模酒吧:25 μ米)和微型板块读者。(c, d) MMP的检测通过荧光显微镜使用JC-1染色。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # # P < 0.0001 ,而H2O2组, ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 ,并与H2O2+ BSYS血清组,▲▲ P < 0.01 ,▲▲▲ P < 0.001 。

此外,我们评估是否抑制Akt激活BSYS废除了凋亡的影响。如数据所示 12(一个)和 12 (b),预培养LY294002逆转BSYS血清的治疗效果,大大提高的比率TUNEL-positive细胞( P < 0.0001 ),进一步展示了一种蛋白激酶磷酸化参与BSYS-mediated antiapoptosis在H2O2受伤oln - 93细胞。此外,免疫印迹分析表明LY294002抑制bcl - 2表达( P = 0.0009 )和伯灵顿的表达增加( P = 0.0042 )和c-caspase-3 ( P = 0.0008 )受BSYS血清(数据 12 (c)和 12 (d))。

BSYS血清抑制H2O2全身的细胞凋亡oln - 93细胞通过调节一种蛋白激酶磷酸化。(a, b)(红色荧光)凋亡细胞被TUNEL检测,和细胞核(蓝色荧光)被DAPI染色。 规模 酒吧 = 25 μ 米 。(c) - (f)代表印迹和统计图表相对蛋白质表达的伯灵顿,bcl - 2, c-caspase3 oln - 93细胞。数据了 意味着 ± SD 与CON组相比,# # # # P < 0.0001 ;相比之下,H2O2组, ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 , ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 ;并与H2O2+ BSYS血清组,▲▲ P < 0.01 ,▲▲▲ P < 0.001 ,▲▲▲▲ P < 0.0001 。

 4所示。讨论

女士与动谷蛋白是慢性炎症性疾病,主要影响大脑的中枢神经系统,脊髓和视神经。这些疾病的特点是髓鞘损伤,轴突退化,神经元损失( 30., 31日]。根据中医理论,CNSD被描述为“软弱综合症”或“骨软弱。“在中医,中枢神经系统脱髓鞘的主要原因是肝脏和肾脏缺乏,以及血瘀,痰饮。因此,治疗CNSD遵循的基本规则,补肝脏和肾脏,活血,解决痰( 32]。BSYS设计依照这些治疗原则。因此,它可用于女士与动的临床治疗。它的疗效和安全性已在临床试验中,但是行动的分子机制尚未完全阐明。在目前的研究中,网络药理学和 在体外实验进行了系统地分析BSYS胶囊的药理机制治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病。

在目前的研究中,59 BSYS中生物活性成分,和547年ingredient-related目标,CNSD-related目标,2625和227之间交叉目标共享BSYS胶囊和CNSD从公共数据库中获得。在确认成分,白藜芦醇,乌索酸、槲皮素表现出最重要的生物活性超过35目标基因(表 S9),因此被确定为关键因素。在先前的研究中,白藜芦醇有效改善的临床严重性女士在老鼠通过维持血脑屏障的完整性( 33)和减少encephalitogenic激活T细胞的数量 34]。它也被发现,白藜芦醇可以改善视神经炎和髓鞘脱失,减弱视网膜神经节细胞和轴突损害损失( 35,防止视神经炎小鼠神经功能障碍( 36]。乌索酸/免疫调节和remyelination效果在实验性自身免疫性脑脊髓炎cuprizone-induced髓鞘脱失( 37]。此外,乌索酸被发现减少认知赤字和mitochondria-dependent凋亡bromide-induced化乙锭实验老鼠的髓鞘脱失( 38]。此外,槲皮素不仅保护退化老鼠也表达下调的胆碱能神经传递MMP-9 / TIMP-1比率减少MMP-9生产从医学患者外周血单核细胞分离 39]。它还改善在视神经髓鞘修复lyolecithin-induced脱髓鞘模型,大大缩短视觉信号的延迟 40]。

PPI网络的分析显示,AKT1 MAPK1, MAPK3,小君,和表皮生长因子受体是五大目标基于程度值,这表明BSYS胶囊可能通过调节这些目标减轻中枢神经系统脱髓鞘。接下来,去浓缩PPI网络的分析进行了在不同的集群和十字路口总目标。结果表明,CNSD BSYS胶囊的影响是与蛋白质磷酸化,活性氧代谢过程,调节神经元死亡,氧化应激反应,和外在凋亡等。此外,KEGG路径分析表明,十字路口的目标主要是与PI3K-Akt相关信号通路,MAPK信号通路,肿瘤坏死因子信号通路,cytokine-cytokine受体相互作用,以及细胞凋亡等途径。每个信号通路包含众多目标基因,和十字路口的数量目标反映了通路的重要性。除了癌症通路,PI3K-Akt信号通路基因的数量最多,包含37个目标。综上所述,这些结果表明,BSYS阻止细胞凋亡的升降AKT在氧化磷酸化水平stress-injured少突胶质细胞。

氧化应激中起着至关重要的作用在inflammation-induced脱髓鞘和神经退行性变的女士在中枢神经系统中,氧化损伤是由活性小胶质细胞和星形胶质细胞 41]。形成的脂质过氧化作用的产品和活性氧(ROS)在脑组织,血浆和脑脊液( 42]女士过程中被很好的记录 43]。过度的ROS水平导致的损伤脂质,蛋白质,和线粒体DNA。随后的线粒体功能障碍影响能源生产,加剧了髓鞘脱失( 44]。

氧化应激可以摧毁各种神经细胞,包括神经元和神经胶质细胞。所有类型的神经胶质细胞,少突胶质细胞是最容易ROS由于弱抗氧化防御系统( 45]。ROS-induced氧化损伤导致少突胶质细胞凋亡,尤其是在脱髓鞘疾病( 46]。先前的研究发现,H2O2线粒体膜电位下降,细胞内活性氧的积累增加,oxidative-related凋亡的oligodendroglial (oln - 93)细胞( 29日]。因此,H2O2可用于诱导氧化stress-mediated少突细胞丧失中枢神经系统脱髓鞘吗 在体外。

在这项研究中,我们成功建立了H2O2全身在oln - 93细胞氧化损伤。CCK-8试验的结果表明,BSYS血清有效缓解治疗H2O2全身的减少oln - 93细胞的可行性。研究表明,LDH、MDA和SOD的细胞内氧化应激敏感指标。LDH酶是一种稳定的出现在所有类型的细胞,迅速ROS(质膜损伤后发布的 47]。因此,它是应用最广泛的标记对氧化损伤进行调查。氧自由基攻击细胞膜,导致脂质过氧化,导致MDA的形成。MDA反过来损害线粒体呼吸链复合物( 48]。作为一种重要的抗氧化酶SOD主要由催化生成氧气和过氧化氢自由基。通过这种方式,它维护的氧化与抗氧化系统之间的动态平衡 49]。在目前的研究中,我们发现BSYS血清有效降低MDA和LDH水平oln - 93细胞暴露于H2O2,但它增加SOD活性。

进一步探索BSYS的抗氧化应激作用,我们评估的ROS水平和细胞凋亡在氧化oln受伤- 93细胞。过多的活性氧积累减少细胞生存通过破坏DNA和脂质,以及其他细胞成分( 50]。破坏这些细胞组件导致的损失少突胶质细胞坏死或凋亡。DCF荧光分析显示BSYS血清治疗缓解ROS水平的增加引起的H2O2。TUNEL结果分析和免疫印迹试验针对apoptosis-related蛋白质是由活性氧的结果。此外,ROS已经发现降低线粒体膜电位(MMP)和触发apoptosis-related因素的激活,导致细胞死亡( 51]。目前的结果表明,减少暴露后MMP的H2O2被政府逆转BSYS血清。这表明BSYS抑制线粒体凋亡通路在拯救MMP的少突胶质细胞。

PI3K / Akt信号通路调节细胞过程,包括细胞生存、增殖和分化。它还修改细胞凋亡的发生氧化应激条件下( 52]。研究表明,激活PI3K / Akt途径可以防止少突细胞前体细胞氧化损伤,同时抑制Akt活动增加活性氧的敏感性和脆弱性的神经细胞氧化应激( 53]。丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶B (PKB)命名,也被称为一种蛋白激酶,是一个重要的中介PI3K-related信号。激活PI3K导致Akt磷酸化(p-Akt),视为PI3K激活的指标( 54]。p-Akt可以下调proapoptotic伯灵顿蛋白质表达上调bcl - 2的表达,一种凋亡蛋白质,从而抑制caspase-mediated凋亡级联( 55, 56]。在这项研究中,H2O2治疗减少一种蛋白激酶磷酸化和加剧了少突胶质细胞的凋亡,而BSYS-containing血清保护oln - 93细胞,增加了一种蛋白激酶磷酸化。同时,治疗血清BSYS改善ROS的产生和在OLN93细胞MMP的损失。值得注意的是,治疗效果的血清BSYS LY294002明显削弱了政府。我们的发现表明,BSYS抑制H2O2通过调节全身oln - 93细胞死亡Akt通路。

 5。结论

在这项研究中,网络药理学和 在体外实验调查antidemyelination CNSD BSYS胶囊的机制。结果表明,BSYS治疗缓解氧化stress-mediated少突细胞凋亡促进中枢神经系统脱髓鞘疾病的一种蛋白激酶磷酸化。因此,BSYS对MS的治疗前景,动校正和其他中枢神经系统脱髓鞘疾病。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项研究是由中国国家自然科学基金资助(81873252)。

 补充材料

表S1:所有BSYS胶囊的潜在目标。表S2:已知CNSD-related目标。表S3: BSYS胶囊与已知CNSD-related分享227交叉目标的目标。表S4: PPI Metascape 227交叉目标的信息。表S5: PPI网络中的所有节点的度值。表S6:结果去通路富集分析。表S7:结果KEGG通路富集分析。表S8:基因的路径网络的信息。表S9:“积极ingredients-intersection目标”的信息网络。

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