心肌梗死 炎症介质 1466 - 1861 0962 - 9351 Hindawi 10.1155 / 2022/6886752 6886752 研究文章 氯丙嗪和异丙嗪(C + P)减少脑损伤后通过PKC -缺血性中风 δ/氮/ MnSOD通路 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3361 - 6368 郭 Sichao 1 2 3 https://orcid.org/0000 - 0001 - 8394 - 9147 李 Fengwu 1 遗嘱 梅丽莎 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7267 - 2234 叫喊声 詹姆斯 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9297 - 9786 赫贝 亚历山德拉 2 4 彭 Changya 2 3 https://orcid.org/0000 - 0001 - 8918 - 8748 耿 Xiaokun 1 2 5 https://orcid.org/0000 - 0001 - 5358 - 1660 丁 Yuchuan 2 3 张 冯 1 Luhe神经科学研究所 北京Luhe医院 首都医科大学 北京101100年 中国 ccmu.edu.cn 2 神经外科学系 韦恩州立大学医学院 底特律 MI 48201 美国 wayne.edu 3 部门的研发中心 约翰·d·丁格尔VA医学中心 底特律 MI 48201 美国 va.gov 4 哈佛T.H.成龙公共卫生学院 波士顿 马02115 美国 harvard.edu 5 神经学部门 北京Luhe医院 首都医科大学 北京101100年 中国 ccmu.edu.cn 2022年 15 7 2022年 2022年 19 3 2022年 11 6 2022年 15 7 2022年 2022年 版权©2022 Sichao郭et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

脑缺血再灌注(I / R)煽动神经损伤通过无数的复杂的病理生理机制,最值得注意的是,炎症和氧化应激。在I / R损伤,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)产生活性氧(ROS),促进炎症和凋亡通路,增加活性氧的生产和促进细胞死亡。抑制ischemia-induced氧化应激会有利于减少神经炎症,促进神经细胞的生存。研究表明,氯丙嗪和异丙嗪(C + P)诱导神经保护。这项研究调查了C + P减少氧化应激引发的缺血性损伤。成年男性Sprague-Dawley老鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)和随后的再灌注。8毫克/公斤的C + P注入大鼠再灌注时启动。神经损伤评估使用梗塞卷,神经功能缺损评分和TUNEL检测。氮氧化物酶活性、活性氧产量、蛋白质表达的氮氧化物子单元,锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和PKC -磷酸化 δ被评估。神经SHSY5Y细胞接受oxygen-glucose剥夺(OGD)和随后的再氧化和C + P治疗。我们也评估ROS水平和氮氧化物蛋白质亚基表达,MnSOD, p-PKC - δ/ PKC - δ。此外,我们测量PKC - δ膜易位和氮氧化物亚基之间的相互作用(p47水平phox)和PKC - δ通过coimmunoprecipitation。据猜测,用C + P治疗神经损伤的治疗水平下降。ROS生产、氮氧化物亚基表达,氮氧化物活动,p-PKC - δ/ PKC - δ均显著地降低受试者接受C + P。PKC - C + P降低膜易位 δ和降低p47之间的相互作用phox和PKC - δ。这个研究表明,C + P诱发神经保护效应通过抑制氧化应激在缺血性中风。我们的研究结果还表明,PKC - δ、氮氧化物和MnSOD监管者的氧化过程是至关重要的,表明C + P可能作为一种抗氧化剂。

 北京通州区的远古时期人才项目(2022) Luhe医院 2022年 北京通州区科技计划 KJ2022CX033 中国国家自然科学基金 82101436 82072549 82001277 1。介绍

急性缺血性中风导致永久性的神经损伤,导致高发病率和死亡率每年国际和高医疗费用( 1]。再灌注策略,如组织纤溶酶原激活物(tPA)和血栓切除术,是治疗急性缺血性中风的标准和技术进步的主要目标在中风治疗( 2]。然而,即使在成功的血管再通,患病率居高不下和临床结果往往是由于复杂的再灌注损伤( 3, 4]。当务之急是探索其它治疗方法,如神经保护和neuro-rehabilitative策略,最大化功能结果和病人的生活质量。

氯丙嗪和异丙嗪(C + P),两种吩噻嗪药物,通常用于镇静和抗精神病作用[ 5]。C + P诱发“人工冬眠”状态的影响发现,授予在脑缺血神经保护 5- - - - - - 7]。先前的研究表明,低温诱导的冬眠状态是其有效的神经保护性能的关键。降低体温和代谢率赋予更高的耐缺血,低血糖,和其他条件的低灌注状态,从而提供更有利的参数对急性缺血性中风患者。药理体温过低,引起的药物,如C + P,躲避很多潜在的并发症低温治疗诱导通过外部或血管内冷却方法,如凝血障碍、低钾血,和感染 8]。然而,一些研究表明,C + P的神经保护机制是独立的或只是部分依赖于温度,从而表明C + P的神经保护作用可能是由于一个独立的,不依赖于温度的机制( 5, 9]。吩噻嗪类已经发现保护 在体外人类神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y从氧化应激引发的外生的和线粒体自由基。吩噻嗪类充当neuroprotectants清除自由基和诱导抗氧化蛋白质合成( 10]。此外,异丙嗪在中风模型显示保护针对线粒体通透性传播(mPT),当激活时,与细胞毒性感染后,缺血,excitotoxic病理侮辱( 11]。

双重疗法与C + P被发现对神经组织有显著的保护作用在瞬时和永久的缺血性中风。C + P被发现减少梗死体积,提高长期的运动性能,减少代谢损害( 5]。之前的研究表明,C + P可能诱发神经保护通过PKC蛋白水平的变化 δ和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX) [ 5, 12),蛋白复合物参与缺血性中风后氧化应激和细胞破坏。然而,C + P的具体机制抑制氧化应激通过PKC - δ/ NOX通路尚不清楚。要完全理解C + P的神经保护作用,本研究调查机制C + P卒中后抑制氧化应激。

多余的氧气和活性氧(ROS)广为人知产生氧化应激,导致细胞损伤后缺血性中风( 13]。氮氧化物,multi-subunit酶,采用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶ii +)产生活性氧和超氧化物阴离子( 14]。增加氮氧化物活动、氮氧化物亚基表达和细胞死亡后被发现缺血/再灌注(I / R)和与大梗死体积和糟糕的功能性结果( 14- - - - - - 16]。NADPH氧化酶是由主要的第22位phox(phox吞噬细胞氧化酶),p47phox,p67phox管理单元,和催化亚基gp91phox( 17]。大脑是为了表达的主要氮单元(第22位phox,p47phox,p67phox,gp91phox)[ 15)和激活氮氧化物,加剧I / R损伤的高产ROS ( 15]。此外,蛋白激酶C (PKC)作为关键催化剂的NADPH氧化酶( 18]。作为PKC家族的一员,PKC - δ激活氮氧化物在I / R,增加氧化损伤和细胞凋亡 12]。相反,manganese-containing超氧化物歧化酶(MnSOD),一个重要的抗氧化酶在中枢神经系统,是一个主要途径,脑缺血后细胞抵抗活性氧损伤( 19]。

我们的研究试图描绘的抗氧化作用机制C + P诱发神经保护效应评估PKC - δ/ NOX MnSOD途径以及这些药物的能力在缺血性中风后修复氧化损伤。一个健壮的理解缺血性中风后神经保护的氧化途径将指导今后的努力在寻找治疗靶点,利用这些流程改善病人的发病率和死亡率。

 2。材料和方法 2.1。主题

142只成年雄性老鼠Sprague-Dawley (280 - 300 g,北京重要河流实验动物科技公司,有限公司)作为我们研究的对象。我们跟着首都医科大学的制度动物调查委员会标准操作程序(89 e58f61-7d97-4fa1-b7d0-02da47f7a735)。动物被关在笼子里,接受12小时的光/暗周期的持续时间的实验。所有可能是采取措施减少伤害所使用的老鼠和老鼠的数量。大鼠随机分为6组:(1)一个虚假的组织,没有经过大脑中动脉闭塞(MCAO) (<在line-formula> n = 12 );(2)两个小时之前MCAO再灌注6或24小时(<在line-formula> n = 26 );(3)两个小时MCAO和C + P与温度控制在37°C之前再灌注6或24小时(<在line-formula> n = 26 );(4)两个小时MCAO和C + P没有温度控制在6 - 24小时再灌注(<在line-formula> n = 26 );(5)两小时MCAO和氮氧化物抑制剂之前再灌注6或24小时(<在line-formula> n = 21 );(6)两小时MCAO和PKC - δ抑制剂之前再灌注6或24小时(<在line-formula> n = 21 )。十大鼠(< 10%)并不包括在进一步分析由于脑出血、死亡,或缺乏缺血性损伤的神经功能缺损评分和TTC染色。实验和统计分析进行了随机和盲评 20.]。温度控制的团体,老鼠给37°C下温暖的环境光绝缘毯来维持体温。non-temperature-controlled组,动物被存储在一个25°C。由于大脑和身体之间的亲密联系的温度( 21),直肠温度监控降低颅内出血的风险。

 2.2。局灶性脑缺血

我们以前区域脑缺血模型用于解释本研究[ 22]。总之,实验对象被放置在一个室和1 - 3%异氟烷麻醉和一氧化二氮30%氧气和70%的解决方案。使用口罩,与1%异氟烷麻醉是管理通过校准精度汽化器。最小化啮齿动物和收益之间的差异大小的梗塞,MCA闭塞使用4.0 poly-L-lysine-coated管腔内的尼龙缝线为每一个过程。

 2.3。氯丙嗪+异丙嗪管理和氮氧化物抑制剂/ PKC - <斜体>δ< /斜体>抑制剂

在相等的部分,老鼠收到8毫克/公斤的C + P腹腔内(IP)再灌注开始时,参数的验证在之前的研究中( 5]。一到两个小时后,老鼠给另一个注入,这是前三分之一的原始剂量的C + P,增加C + P的治疗效果。氧化氮抑制剂、apocynin(2.5毫克/公斤),或PKC - δ抑制剂,rottlerin(0.3毫克/公斤),从发起MCAO注入IP 2小时。

 2.4。细胞培养和氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD / R)与C + P管理

人类细胞系的SHSY5Y写明ATCC的收购。我们培养细胞在一个25厘米2培养瓶5毫升的DMEM / F12和10%的边后卫和培养九到十一个段落。我们培养细胞为5%股份有限公司2在湿润孵化器和37°C,解释在我们先前的研究 23]。

执行OGD模型,描述在我们先前的研究,厌氧室刷新N为95%2和5%的公司2(<在line-formula> v / v )保持在37°C(使用 23]。我们更换培养基与缺氧和glucose-free DMEM开始两个小时的OGD。SHSY5Y细胞被厌氧室,和交换的DMEM培养基是维护中,随后的C + P治疗。C + P最终浓度为2.5 μ米,在之前的项目由我们决定。最后,在湿润孵化器,细胞培养6或收获前24小时。

 2.5。梗死体积测量

从颅腔中删除后,大脑矩阵是切成2毫米厚片和染色使用2、3,去除氯再灌注后48小时。梗死体积计算间接地减少误差引起的水肿。每个片横断面的区域梗塞的地区与ImageJ计算。梗死体积为每片是计算之间的区别的左半球体积和总量noninfarcted右半球,然后除以总数量的左半球( 24]。

 2.6。TUNEL分析

采用TUNEL分析评价DNA碎片中使用商业套装之前由我们工作( 24, 25]。图片是随机获得领土MCA提供的。遵守制造商的迹象,permeabilized和固定幻灯片在50孵化 μl (TUNEL反应混合物为一小时37°C。积极TUNEL染色和荧光显微镜可视化。的TUNEL+细胞数使用ImageJ人工细胞计数的工具。细胞计数每一部分从每组的统计分析是盲目的。总细胞数通过计算DAPI收购+细胞,包括每个死去的细胞。从每个老鼠,幻灯片被选中(<在line-formula> n = 5 感兴趣的),四个区域从每个幻灯片进行评估。凋亡细胞的百分比和平均计算<在line-formula> 总 调优 l + 细胞 在 所有 20. 地区 / 总 细胞 在 所有 20. 地区 × One hundred. % 。因为图片是随机从四个不同地区MCA-supplied领土,发现意味着缺血区域的细胞死亡。

 2.7。检测细胞死亡

凋亡细胞死亡是由一个光度酶免疫分析法评估解释在美国进行的一项研究[ 26]。细胞质histone-associated DNA片段的数量通过凋亡细胞死亡是评估。随后,光在405 nm波长吸光度计算。

 2.8。NADPH氧化酶活性

右大脑半球样本组织处理使用方法解释我们以前研究[ 27]。总之,大脑组织样本均质裂解缓冲。在每一个发光的板,80 μl lucigenin混合和20 μl(匀浆,随后加入了孵化在37°C 10分钟。NADPH的最终浓度,0.1毫米,然后补充说,我们决定使用dtx发光- 880多模探测器每标本30秒钟,总计十分钟。

 2.9。ROS化验

神经组织样本由MCA-supplied领土、frontoparietal皮层和纹状体进行了分析。Amplex红过氧化氢/过氧化物酶测定工具被用来识别ROS,我们描述了在之前的研究中( 28]。在大脑中匀浆,H2O2测量与dtx - 880多模探测器。

测量细胞内活性氧的生产,我们利用DCFH-DA(二乙酸2 7-dichlorodihydrofluorescein),我们解释了在之前的研究中( 23]。文化是用PBS洗一次,然后沾25 μ100年M DCFDA μ在37°C l PBS半个小时。文化与PBS信号之前洗了三次阅读练习/ Em 485/535 nm。

 2.10。Coimmunoprecipitation (Co-IP)

Coimmunoprecipitation PKC - δ与p47phox是执行。24小时后收集细胞上清液6和OGD / R。细胞裂解缓冲(9803年,春秋国旅)是用于收集溶解产物。15分钟,在4°C,溶解产物在13000 rpm离心机之前收集上层的。主要anti-PKC - δ(sc - 213,圣克鲁斯生物技术)和anti-IgG抗体(2729年,细胞信号技术)被添加到200 μl细胞溶解产物和孵化一夜之间在4°C。抗体immunocomplex解决方案和溶菌产物转移到蛋白质G磁bead-containing管和孵化旋转在室温20分钟。磁选架(7017细胞信号技术)被用来分离磁珠按照制造方向,然后煮沸变性protein-bead复杂。immunoprecipitants从细胞进行了免疫印迹分析。主要anti-PKC - δ(9616年,细胞信号技术)和anti-p47phox(4312年,细胞信号技术)被用于免疫印迹检测。

 2.11。细胞小分支分析

培养细胞的亚细胞蛋白质分离设备是用于执行依照制造方向(亚细胞分离 29日]。完整的细胞溶解产物是培养融合准备使用裂解缓冲,包括蛋白酶抑制剂。蛋白质被隔开SDS页面。anti-PKC——使用的主要抗体 δ和钠+/ K+腺苷三磷酸酶作为膜小分支的指标,而 α微管蛋白作为细胞质小分支的指示器。

 2.12。蛋白表达

大脑组织和细胞蛋白表达的检测采用免疫印迹分析,我们已经描述了在之前的研究中( 28]。frontoparietal皮层和纹状体(右大脑半球组件)作为后续评估的组织样本进行管理。哺乳动物蛋白提取试剂用于溶解组织和细胞。孤立的啮齿动物脑蛋白和细胞隔离被加载到电泳凝胶上。然后,蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯膜。膜被孵化与主要抗体(1:1000年,兔子anti-PKC - δ抗体;1:1000,anti-p-PKC - δ抗体;1:1000年,兔子anti-p47phox;1:1000年,兔子anti-p22phox;1:1000年,兔子anti-gp91phox;1:1000年,兔子anti-p67phox;1:1000年,anti-MnSOD抗体;1:2000年, β肌动蛋白)16个小时在4°C。随后,使用二次抗体膜被孵化(山羊anti-rabbit免疫球蛋白)在室温下2小时。免疫反应性的乐队已识别的增强化学发光体系。对于每个抗体,免疫印迹图像进行了研究与量化ImageJ蛋白表达的相对密度图像。

 2.13。统计分析

GraphPad棱镜v8.0(美国加州圣地亚哥)被用来进行统计分析。用单向方差分析,差异组计算的预先确定的显著性水平<在line-formula> p < 0.05 。事后比较组间是通过使用最少的显著差异(LSD)方法。给出的数据<在line-formula> 的意思是 ± SE 。

 3所示。结果 3.1。C + P最小化Postischemia-Reperfusion神经损伤

体温明显降低早5分钟post-C non-temperature-controlled C + P + P治疗组和I / R在37°C或C + P组。大约2小时后治疗,体温降至34°C。体温持续显著降低了长达6个小时,之前自发返回性常温水平(图 1(一))。

C + P减轻缺血后神经损伤。(一)改变体温后C + P管理各个时间点两个小时MCAO后再灌注(0-24小时)。基线气温MCAO之前决定。再灌注后,C + P管理。方差分析分析指定C + P明显降低体温早5分钟和持久的I / R后6小时开始(<在line-formula> n = 7 )。(b) TTC染色展示在MCAO大鼠梗死体积无论C + P在48小时的再灌注治疗。C + P管理或管理PKC - δ/氮抑制剂明显减少梗塞卷(<在line-formula> n = 7 )。神经功能缺损(c)测定使用5 -或在48小时再灌注12点评分系统。C + P政府或政府的PKC - δ/氮抑制剂显著降低神经赤字在所有组除温控C + P组,没有影响潜油电泵的评分系统(<在line-formula> n = 7 )。(d)细胞死亡明显高于6和再灌注24小时,证明了ELISA。与C + P在再灌注6 - 24小时,细胞死亡是显著降低。管理PKC - δ/氮抑制剂也抑制细胞死亡除氮抑制剂组在6小时再灌注(<在line-formula> n = 7 )。(e)凋亡细胞死亡显著降低了C + P政府不管温度控制在再灌注24小时,显示使用TUNEL分析(<在line-formula> n = 5 )。<在line-formula> 规模 酒吧 = 50 μ 米 。<在line-formula> ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与虚假的集团;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与I / R组。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 。

相比最大的缺血组脑梗死体积在再灌注(图48小时 1 (b)),梗死体积明显减少了温度控制和non-temperature-controlled C + P组。神经赤字是由先前验证5 -或12点评分系统在再灌注(图48小时 1 (c))。与I / R组相比,C + P政府non-temperature-controlled组抑制5点计分系统分数,表明神经损伤(处于较低水平<在line-formula> p < 0.05 )。同样,non-temperature-controlled C + P和C + P温控组(<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.001 )12点评分系统的分数较低,也表明减少神经损伤。检查C + P的神经保护效应背后的基本生理的PKC - δ/ NOX通路中风后,我们给PKC - δ和氮抑制剂。氮氧化物和PKC - δ抑制显著降低梗死体积和神经赤字在48小时再灌注(数字 1 (b)和 1 (c))。

凋亡细胞死亡评估使用ELISA放大post-MCAO虚假的集团,但减少在6和C + P政府后再灌注后24小时(<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.01 )(图 1 (d))。此外,氮氧化物和PKC - δ抑制剂显著减毒细胞凋亡水平越高,除了氮氧化物抑制组再灌注(图6小时后 1 (d))。此外,凋亡细胞死亡由TUNEL分析在组织收到显著降低C + P不管温度控制状态(<在line-formula> p < 0.001 )(图 1 (e))。

 3.2。C + P治疗减毒Postreperfusion ROS水平和氮氧化物的活动

在大鼠MCAO的2小时,大脑氮氧化物活动明显高于24小时再灌注。添加C + P降低氮氧化物活动(<在line-formula> p < 0.001 )。此外,氮氧化物和PKC - δ抑制剂显著降低氮氧化物活动24小时再灌注(图 2(一个))。我们还发现大幅激增ROS生成6和24小时再灌注神经组织;然而,C + P政府显著降低这些ROS水平(图 2 (b))。氮氧化物和PKC - δ抑制剂也减少ROS和再灌注24小时(6点<在line-formula> p < 0.001 )(图 2 (b))。此外,我们研究了C + P SHSY5Y细胞OGD / R的影响。而ROS水平提出了6点和24小时的再氧化,C + P管理提供(<在line-formula> p < 0.05 )重要的保护细胞通过抑制活性氧的生产(图 2 (c))。

C + P减毒氮氧化物postreperfusion活动和ROS水平。定量分析(一)氮氧化物活动和(b) ROS水平确定缺血性脑组织。氮氧化合物活性更高的再灌注24小时时,ROS水平也更高的6点和再灌注24小时。减少氮氧化物活动水平在24小时再灌注和ROS 6和再灌注24小时观察C + P组无论温度控制以及在PKC - δ或氧化氮抑制剂组(<在line-formula> n = 7 )。<在line-formula> ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与虚假的集团;# p < 0.05 ,# # # p < 0.001 与I / R组。数据显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 。定量分析(c) SHSY5Y细胞ROS水平的测量。C + P政府降低ROS的OGD-induced海拔6和24小时的再氧化。<在line-formula> ∗ p < 0.05 ,<在line-formula> ∗ ∗ p < 0.01 对抗OGD组;# p < 0.05 对抗OGD / C + P组。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 三个独立的实验。

 3.3。C + P治疗降低氮氧化物亚基表达

缺血组的人表现出显著增强氮亚基表达(gp91phox,p67phox,p47phox,第22位phox再灌注(24小时)<在line-formula> p < 0.01 ,<在line-formula> p < 0.001 )。C + P治疗团体证明降低氮氧化物单元水平再灌注24小时除了第22位phox温度控制的C + P组(数字 3(一)- 3(d))。有一个更大的减少在第22位phox表达式non-temperature-controlled组相比,温控组管理和C + P在再灌注24小时(<在line-formula> p < 0.001 )(图 3(d))。此外,氮氧化物和PKC - δ抑制剂显著逆转了氮氧化物单元水平再灌注24小时(<在line-formula> p < 0.01 ,<在line-formula> p < 0.001 )(数据 3(一)- 3(d))。

C + P降低氮氧化物亚基蛋白水平在缺血性中风后大脑组织。(一)gp91phox,(b) p67phox,(c) p47phox,(d)第22位phox通过免疫印迹技术评估在6和再灌注24小时。gp91水平phox,p67phox,p47phox,第22位phox玫瑰在I / R后C + P PKC的治疗和管理 δ或氧化氮抑制剂在再灌注24小时,除了第22位phox在37°C + P C组再灌注24小时。有一个更大的减少在第22位phox表达式的non-temperature-controlled C + P与温控C + P组再灌注24小时(<在line-formula> n = 7 )。<在line-formula> ∗ ∗ p < 0.01 和<在line-formula> ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与虚假的集团;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与I / R组;&&& p < 0.001 与C + P组。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 。代表免疫印迹是可视化。

此外,SHSY5Y细胞OGD / R治疗,gp91水平phox和p67phox增强在24小时再氧化的评估与对照组(<在line-formula> p < 0.05 );然而,C + P明显无效gp91phox和p67phox蛋白质含量(图 4(一)和 4(b))。OGD p47水平增强phox6点和再氧化24小时(<在line-formula> p < 0.05 )。此外,C + P政府还降低了p47的水平phox蛋白质含量(<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.01 24小时)6和复氧(图 4(c))。在6小时的再氧化,OGD-induced upregulation第22位phox(<在line-formula> p < 0.05 )是由C + P治疗(否定<在line-formula> p < 0.01 )(图 4(d))。

C + P蛋白水平降低氮氧化物的子单元后OGD / R SHSY5Y细胞。(一)gp91phox,(b) p67phox,(c) p47phox,(d)第22位phox,通过免疫印迹识别6和24小时的再氧化。gp91水平phox和p67phox蛋白质增加后OGD但减少C + P治疗后24小时的再氧化。此外,p47phox后OGD水平增加,但C + P降低这个表达式在6和24小时的再氧化。OGD诱导的第22位phox第22位,有一个更大的下降phox表达OGD / C + P治疗组与OGD集团在6小时的再氧化。<在line-formula> ∗ p < 0.05 对抗OGD组;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 对抗OGD / C + P组。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 三个独立的实验。并给出了具有代表性的免疫印迹。

 3.4。C + P治疗抑制磷酸化PKC - <斜体>δ< /斜体>激活

自PKC - δ磷酸化的影响其催化活性( 30.),我们调查的总数和磷酸化PKC -水平 δ。在脑组织,p-PKC - δ浓度在6小时再灌注(长大<在line-formula> p < 0.01 )。C + P治疗导致显著降低p-PKC - δ相比之下,I / R组。总PKC - δ水平增加梗塞的面积在再灌注24小时(<在line-formula> p < 0.05 )。C + P降低总PKC - δ蛋白质含量(<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.001 )。此外,p-PKC - δ/ PKC - δ比例显著增加post-MCAO (<在line-formula> p < 0.01 );然而,比率降低了在C + P在6小时再灌注(<在line-formula> p < 0.001 )(图 5(一个))。在SHSY5Y细胞24小时再氧化,p-PKC - δ和PKC - δ水平升高后OGD (<在line-formula> p < 0.05 ),而C + P管理这些水平降低(<在line-formula> p < 0.05 )。此外,p-PKC - δ/ PKC - δ比玫瑰post-OGD / R (<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.001 ),但抑制了C + P治疗6和复氧(24小时<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.001 )(图 5 (b))。

C + P降低激活PKC - δ引起的脑缺血或OGD / R。(a)代表乐队总蛋白质的磷酸化和PKC的表达 δ通过免疫印迹在脑组织中发现6和再灌注24小时。 β肌动蛋白担任内部控制。酒吧图表展示PKC -半定量的水平 δ,确定使用带密度分析。MCAO增强PKC - δ磷酸化。PKC - C + P治疗减少 δ磷酸化与中风组再灌注的6个小时。总PKC - δ蛋白表达增加,但C + P水平减少再灌注24小时。此外,p-PKC——的比例 δ/ PKC - δ显著增加post-MCAO但减少6小时再灌注(C + P治疗<在line-formula> n = 7 )。<在line-formula> ∗ p < 0.05 ,<在line-formula> ∗ ∗ p < 0.01 与虚假的集团;# p < 0.05 ,# # # p < 0.001 与I / R组。结果给出了<在line-formula> 的意思是 ± SE 。(b)代表乐队的磷酸化和总PKC - δ水平SHSY5Y细胞识别通过免疫印迹在6和24小时的再氧化。 β肌动蛋白担任内部控制。条形图显示PKC -半定量的水平 δ由乐队密度分析。p-PKC - δ/ PKC - δ比例明显高于后OGD / R;然而,它减少了C + P政府在6小时后再氧化。此外,PKC - δ磷酸化和PKC的总水平 δ后被明显高于OGD / R;然而,C + P废止这一趋势在24小时的再氧化。同样,OGD / R的提高促进p-PKC - δ/ PKC - δ比率,但C + P降低这一趋势在24小时的再氧化。<在line-formula> ∗ p < 0.05 ,<在line-formula> ∗ ∗ ∗ p < 0.001 对抗OGD组;# p < 0.05 ,# # # p < 0.001 对抗OGD / C + P组。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 三个独立的实验。

 3.5。C + P治疗减少PKC - <斜体>δ< /斜体>易位

免疫印迹分析探讨PKC - δSHSY5Y细胞胞质和膜表达,呈现在图 6(一)。与对照组相比,胞质PKC的表达 δ表达式下降(<在line-formula> p < 0.05 )和膜表达增加(<在line-formula> p < 0.05 OGD / R组)在6小时后再氧化,而C + P治疗预防PKC——的变化 δ表达式由OGD / R (<在line-formula> p < 0.05 ,<在line-formula> p < 0.01 )。对抗OGD / R组24小时再氧化的控制,在PKC -没有差异 δ在细胞溶质被认为表达;然而,PKC -有显著提高 δ表达膜(<在line-formula> p < 0.05 )。C + P减少增加细胞膜PKC - δ表达式(<在line-formula> p < 0.05 )。

C + P抑制PKC的易位 δ和交互的PKC - δ与p47phox在SHSY5Y细胞诱导OGD / R。(一)代表的胞质和膜PKC - δ确定使用免疫印迹在6和再灌注24小时。酒吧图表显示半定量的PKC - δ水平细胞溶质和膜使用带密度分析决定。胞质PKC - δ膜中表达减少,但增加OGD / R组在6小时后再氧化相比对照组。政府的C + P否定的变化OGD / R-induced PKC - δ表达式。未发现差异在胞质PKC - δ表达OGD / R组24小时的再氧化,但OGD / R增加膜PKC - δ表达与对照组相比。C + P减了细胞膜PKC - δ浓度。<在line-formula> ∗ p < 0.05 相比,OGD组;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 相比,OGD / C + P组。所有的量化规范化 α微管蛋白(细胞溶质)或Na+/ K+腺苷三磷酸酶(膜),分别。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 三个独立的实验。(b)代表乐队的coimmunoprecipitation PKC - δ和p47phoxSHSY5Y细胞,通过免疫印迹技术在6和24小时的再氧化。酒吧图表显示p47的比率phox/ PKC - δ确认使用带密度分析。免疫球蛋白抗体作为控制。免疫球蛋白控制相比,显著增强p47phox中检测出的免疫沉淀反应复杂PKC - δ抗体的细胞溶解产物,这表明高度交互的PKC - δ和p47phox。此外,PKC -之间的交互 δ和p47phox增加6小时后再氧化,而C + P治疗减少了交互。尽管之间的交互控制和OGD组不显著在24小时的再氧化,交互增加了,和C + P治疗降低PKC -之间的互动 δ和p47phox。<在line-formula> ∗ p < 0.05 对抗OGD组;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 对抗OGD / C + P组。数据表示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 三个独立的实验。

 3.6。C + P治疗抑制PKC - <斜体>δ< /斜体>和p47 <一口> phox < /一口>交互

为了确定的功能交互PKC - δ和p47phox,整个细胞溶解产物与PKC -神经元SHSYSY细胞免疫沉淀反应 δ或免疫球蛋白抗体抗体治疗PKC -紧随其后 δ和p47phox免疫印迹。免疫球蛋白抗体作为控制。免疫球蛋白控制相比,在p47显著增加phox免疫沉淀反应中检测到复杂的PKC - δ抗体的细胞溶解产物,表明PKC -之间的交互 δ和p47phox。此外,经过6个小时的再氧化,OGD PKC -导致增加互动 δ和p47phox(<在line-formula> p < 0.05 ),而C + P治疗减少了交互(<在line-formula> p < 0.05 )。还有一个可观测的,但统计上微不足道的增加之间的交互控制和OGD组在24小时的再氧化,而C + P治疗减毒PKC -之间的交互 δ和p47phox(<在line-formula> p < 0.01 )(图 6 (b))。

 3.7。C + P推广增加MnSOD的表达式

MnSOD水平显著降低为2小时MCAO / 24小时再灌注组(<在line-formula> p < 0.05 )。然而,用C + P治疗显著逆转这些MnSOD水平下降,不管温度控制(<在line-formula> p < 0.001 )(图 7(一))。同样,在细胞实验中,OGD诱导显著减少MnSOD水平的再氧化的24小时。假设,C + P政府显著增加MnSOD表达6和复氧(24小时<在line-formula> p < 0.05 )(图 7 (b))。

C + P促进脑缺血后MnSOD的表达或OGD / R。(a)代表乐队MnSOD脑组织中发现使用免疫印迹在6和再灌注24小时。 β肌动蛋白担任内部控制。半定量的水平MnSOD显示在酒吧图表,确定使用带密度分析。MnSOD I / R后蛋白质含量下降。C + P政府大大加速MnSOD表达式在6小时再灌注(<在line-formula> n = 7 )。<在line-formula> ∗ p < 0.05 与虚假的集团;# # # p < 0.001 与I / R组。给出了数据<在line-formula> 的意思是 ± SE 。(b)代表乐队MnSOD表达SHSY5Y细胞识别利用免疫印迹在6和24小时的再氧化。 β肌动蛋白蛋白质担任内部控制。酒吧图表显示半定量的水平的MnSOD确认使用带密度分析。MnSOD蛋白质含量下降在24小时的再氧化。然而,C + P治疗MnSOD表达升高6和24小时的再氧化。<在line-formula> ∗ p < 0.05 对抗OGD组;# p < 0.05 对抗OGD / C + P组。结果显示为<在line-formula> 的意思是 ± SE 三个独立的实验。

 4所示。讨论

本研究试图探讨C + P-induced缺血性中风后神经保护。我们的研究结果加强了之前的研究发现,声称治疗C + P降低神经梗死体积,神经赤字,MCAO大鼠和凋亡细胞死亡,演示了并发使用氮氧化物和PKC - δ抑制剂。此外,我们还发现C + P ROS生成,减少氮氧化物的活动,氮氧化物蛋白质亚基表达和p-PKC——的比例 δ/ PKC - δ,同时增加MnSOD水平。氮氧化物活动,氮氧化物亚基蛋白表达,ROS也减少了氮氧化物和PKC - δ抑制剂。同时,C + P治疗ROS水平降低,氮亚基蛋白表达,p-PKC - δ/ PKC - δ,增加MnSOD以及抑制PKC - δ膜易位和p47phox和PKC - δOGD / R模型中交互。符合我们之前的研究,PKC - δ和氮氧化物似乎主要监管机构的C + P发挥其神经保护作用[ 5, 12]。本研究进一步探讨了C + P的具体机制抑制氧化应激并通过PKC -产生神经保护作用 δ/ NOX MnSOD缺血性中风后途径。这可能是由于改变了氮氧化物亚基蛋白表达和PKC - δ通过磷酸化调节、膜易位和PKC——的变化 δ和p47phox相互作用(图 8)。

示意图说明神经保护的通过PKC - C + P δ/氮/ MnSOD通路。I / R后,PKC - δ转移到细胞膜被磷酸化,激活。PKC - δ与p47phox这促进了氮氧化物的激活。此外,MCAO也诱发了NOX子单元gp91表达升高phox,p47phox,p67phox,第22位phox,导致氮氧化物激活。氮氧化物激活进一步增加活性氧的生产和氧化应激。此外,MnSOD表达式是卒中后压抑。C + P抑制PKC - δ和氮氧化物激活和促进MnSOD表达,导致降低ROS生产和氧化应激。

使用缺血性中风模型在之前的研究中,我们发现政府C + P增强神经保护的衰减有害代谢瀑布。这些发现证明了C + P cerebro-protective影响缺血模型,证明了通过减少梗死体积和降低卒中后神经赤字( 5]。此外,C + P在缺血性中风神经保护的影响力似乎在一定程度上由于其能力减弱hyperglycolysis [ 9),血脑屏障的破坏 22),炎症级联( 31日),激活inflammasomes [ 32),而凋亡细胞死亡( 12]。C + P可以诱发低温治疗;然而,它的神经保护能力中风后似乎至少部分独立于它的体温过低的影响( 5, 9, 31日, 32]。最近,我们报道,C + P抑制神经炎症反应和NLRP3 inflammasome激活即使没有诱导体温过低。我们发现的抑制NLRP inflammasome可以通过减少表达的几个重要蛋白质的监管机构,作为可能的主要神经保护治疗post-ischemic中风( 25]。并行,我们当前的研究表明,C + P缺血性事件后的神经保护效应部分归因于低温的影响。然而,C + P cerebro-protective效应也可能导致氧化应激通路的影响组件,如PKC - δ、活性氧和氮氧化合物的酶。不管温度控制,治疗C + P也发现显著逆转post-MCAO MnSOD下降,一个至关重要的中枢神经系统抗氧化酶,增强脑缺血后细胞ROS阻力。通过这些机制,发现C + P治疗显著降低梗死卷,神经赤字,和凋亡细胞死亡。C + P的神经保护效应的出现温控环境显示,增强神经保护的能力通过药理机制是独立的低体温,这证实了细胞系实验。

ROS是至关重要的组件在一个越来越多的疾病,因为他们恶化氧化压力的同时提高组织功能障碍( 33]。氧化应激是一个主要因素造成缺血性中风神经损害。线粒体活性氧的生产过剩理论是氧化应激的驱动力。氮氧化物酶转移电子穿过生物膜,已经被证明是重要的ROS发电机在脑组织缺血后事件 34]。氧化氮酶用NADPH催化分子氧还原,产生超氧化物阴离子。NADPH提供一磷酸己糖分流的氮氧化物酶活性( 35]。氮代谢活动加剧I / R损伤( 15,抑制氮氧化物被证明能减少I / R损伤后神经损伤( 36]。氮氧化物复杂包括膜结合和胞质元素。在其静息状态,氮氧化物gp91组成的催化区域phox和第22位phox,这是membrane-integrated flavocytochromes。胞质元素包括p47phox和p67phox( 14, 37]。为了激活NADPH氧化酶,必须有胞质p47的膜组装phox,p67phox,第22位phox,gp91phox,导致gp91激活phox的催化亚基( 14]。据报道,I / R p47下降phox/ p67phox胞质和p47增加phox/ p67phox/ gp91phox在膜 38]。Upregulation所有主要的氮单元(p47phox,p67phox,第22位phox,gp91phox)也被发现是氮氧化物与活动中风后( 39- - - - - - 42]。我们当前的研究展示了显著降低ROS水平,NOX酶活性和p47水平phox,p67phox,第22位phox,gp91phox蛋白质C + P治疗后,一致的结果氮氧化物抑制剂组或PKC - δ抑制剂组。这进一步表明C + P的作用抑制氧化应激通过镇压的PKC - δ/ NOX通路。

PKC的上游信号是一个已知的组件NADPH氧化酶激活( 38]。此外,发现了氯丙嗪降低cadmium-induced氧化肾损害,源于它能够减轻氧化应激和稳定通过PKC抑制钙稳态 43]。之前的研究已经表明,C + P管理局通过NOX-Akt / PKC途径[减少细胞凋亡 12]。PKC serine-threonine激酶家族,控制各种细胞功能和参与了各种疾病,包括I / R损伤( 44- - - - - - 46]。这个家庭是由九个基因的表达结构相关phospholipid-dependent激酶与单独的监管机制和不同组织中分布。各种研究PKC -连接 δ在各种各样的培养细胞(细胞死亡 47),包括神经细胞( 48]。PKC - δ零老鼠已被证明有大量减少中风的大小(70%)当评估与野生型老鼠瞬态MCAO后和随后的再灌注治疗( 46]。此外,NMDA-dependent upregulation PKC - δ在病变显著增加I / R后,连同其他蛋白质参与神经元死亡,如热休克蛋白和血红素oxygenase-1 [ 49- - - - - - 51]。PKC - δ似乎是氧化应激的实质性部分的规定,可能通过氮氧化物刺激在再灌注损伤 46]。反过来,PKC - δ活动由磷酸化控制模式和亚细胞易位上下文相关的方式( 30.]。例如,中风后,PKC的磷酸化水平 δ增加( 52, 53]。这种磷酸化状态激活PKC - δ,促进氮氧化物和活性氧的生产( 54]。此外,中风后,PKC的易位 δ促进从胞质膜,影响其功能( 38, 55]。PKC交互与其他蛋白质也是至关重要的PKC本身的功能和蛋白质相互作用[ 56]。之前的研究已经表明,活性氧产量刺激激活PKC - δ-p47phox轴通过PKC - δ其易位激活,通过促进膜与p47交互phox在血管平滑肌细胞( 57]。在我们目前的研究中,我们观察到C + P抑制ROS产生的生产通常PKC - δ-p47phox途径。通过减少PKC -它完成 δ磷酸化,PKC - δ膜易位,PKC - δ和p47phox交互。

在哺乳动物细胞,MnSOD是一个至关重要的抗氧化酶位于线粒体。MnSOD解毒作用超氧化物,线粒体呼吸的主要副产品( 58]。因此,MnSOD起着至关重要的作用在细胞防御从氧化应激 59]。MnSOD高度表达的神经元细胞,必须维持免受氧化应激( 60]。因此MnSOD是一种重要的内源性保护机制对脑缺血性损伤。蛋白质的表达MnSOD再灌注后抑制STAT3基因的失活,负责监管MnSOD表达在神经元细胞在正常条件下 61年, 62年]。OGD / R的感应也被发现表达下调MnSOD [ 63年]。此外,MnSOD-deficient老鼠被发现有更大的梗死体积和细胞死亡水平post-ischemic事件。先前的研究看出MnSOD导致的损失减少抗氧化活性和更高水平的非耦合超氧化物阴离子,也会加重缺血性损伤和结果的扩张梗塞的半影区( 64年, 65年]。相反,过度的MnSOD脑I / R后提供神经保护。例如,overexpressors MnSOD没有增加脑出血和血管内皮细胞死亡率在underexpressor被发现和基因敲除模型( 66年]。在我们的研究中,管理C + P MnSOD的表达增加,这可能进一步减少活性氧引起的氧化应激损伤,赋予额外的神经保护。这些研究结果不仅有助于日益增长的部分文学探索神经C + P治疗的好处,但也MnSOD的抗氧化性能。

 5。结论

C + P双重疗法有明显的神经保护的好处在缺血性中风的上下文中。一些研究显示,其好处是通过药物诱导体温过低。然而,其他人已经证实其好处在温度控制设置,从而恳求的发现额外的神经保护机制。我们的研究试图进一步探索这些机制,发现C + P-mediated抗氧化防御是通过PKC - δ/ NOX MnSOD通路后急性缺血性中风。这项研究的结果提供有价值的洞察未来罹患中风的患者作为治疗目标这些通路可能显著提高神经保护。未来的研究应该集中在更大的深度探索这些神经保护机制。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这部分工作是支持由中国国家自然科学基金(格兰特数字82001277、82072549和82101436),远古时期人才计划北京通州区(2022),北京通州区的科技计划(KJ2022CX033) Luhe医院和实验室发展基金(2022)。

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