1。介绍
脊髓损伤(SCI),这通常是由于严重的创伤,如瀑布和交通事故,是一种最严重的中枢神经系统(CNS)损伤和残疾和严重的并发症率高(
1,
2]。主要和次要伤害是SCI的连续和重叠的病理过程
3]。主要SCI是直接造成的机械冲击和激烈,压缩,扭结,伸展。在SCI,主要损伤是不可逆的。二级SCI的发病机制很复杂,不断调节细胞内和细胞外的分子水平;重大活动包括脂质过氧化反应,线粒体功能异常、氧化应激、炎症反应、神经细胞凋亡,谷氨酸受体overactivation [
3- - - - - -
5]。通过一系列的分子级联反应,组织损伤的程度进一步加剧,SCI的范围扩大。炎症的作用在SCI的发展是不容忽视的
6,
7]。SCI后,炎性细胞因子和趋化因子的表达受伤的网站是调节,这不仅导致死亡的神经细胞和免疫细胞浸润也促进炎症级联,加重炎症微环境(
8,
9]。因此,有效地减少了炎症反应期间二次损伤已成为一个新的条目集中在SCI治疗策略的研究。
小胶质细胞的先天免疫细胞在中枢神经系统,调节先天和适应性免疫反应的一系列病理生理过程(
10,
11]。活化的小胶质细胞可以调节响应病原体和执行免疫细胞功能清除细胞碎片通过吞噬作用[
12,
13]。此外,小胶质细胞参与有益的和有害的反应在SCI (
14]。这个矛盾的作用与激活和极化小胶质亚型有关。经典小胶质极化的概念认为,M1极化代表了炎性表型而M2极化代表了抗炎表型(
15,
16]。在科学的发展,M1-polarized小胶质细胞产生大量的促炎细胞因子,破坏和有害健康的神经元(
17,
18),导致二次伤害(
19]。相比之下,M2-polarized小胶质细胞可以上调抗炎介质生产和参与限制炎症和恢复体内平衡(
20.,
21]。因此,抑制小胶质细胞M1极化和促进M2极化是值得探索科学研究的方法。
据报道,有很多信号通路参与调节小胶质细胞的炎症反应。核因子-
κB (NF -
κB),明确炎症监管途径,据报道促进促炎细胞因子的表达和释放,其中许多是调节在SCI (
22]。尼古拉和他的同事报道,NF -
κB信号与促炎密切相关表型和M1小胶质极化
23]。增殖蛋白激酶(MAPKs)被认为是重要的信号通路参与细胞应激和炎症反应(
24- - - - - -
27]。增加磷酸化p38MAPK和细胞外signal-regulated激酶1和2 (ERK1/2)小胶质细胞在病理条件下负责增加促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子的表达式
α(肿瘤坏死因子-
α)、白细胞介素- 6 (il - 6)和interleukin-1
β(il - 1
β)[
25- - - - - -
28]。这些研究表明NF -
κB和MAPKs是典型的与炎症反应相关的信号通路。
甲酰肽受体(玻璃钢),包括同分异构体FPR1, FPR2 / ALX, FPR3 [
29日),属于G-protein-coupled受体家族(
30.,
31日]。玻璃钢是至关重要的监管目标由于其参与多种炎症性疾病(
32),扮演了一个重要的角色在宿主防御和调节炎症反应。至关重要的SA)和他的同事们证明玻璃钢表达在大脑和脊髓的许多结构(
33]。最近,许多研究表明FPR2玻璃钢家族的重要成员,有明显的抗炎效应(
29日,
34]。失去FPR2受体已被证明有助于疾病进展(
33]。因此,FPR2可能干预继发性炎症过程的一个重要目标,可用于治疗科学开发一种新的治疗策略。
WKYMVm合成肽,被从肽库,是一种选择性FPR2受体激动剂(
35,
36,会产生一个免疫调节效应(
37]。这种肽的抗炎作用正逐渐被发现,这被证明能显著抑制炎性细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子-
α和il - 1
β(
38]。此外,与其他FPR2受体激动剂相比,该肽的优势更好的亲和力和低免疫原性(
37]。因此,WKYMVm / FPR2可能有效地干扰炎症反应在SCI, WKYMVm / FPR2 SCI的应用改善了前景。然而,很少有报道WKYMVm和FPR2小胶质细胞的作用。尤其是,他们的角色在SCI和潜在机制不清楚。
基于这个逻辑,我们相信WKYMVm可能发挥抑制作用通过FPR2小胶质细胞的炎症反应,可能成为调节炎症和对待SCI的代理人。为了验证这个假设,我们调查的角色WKYMVm FPR2治疗SCI通过小胶质细胞培养体外和SCI大鼠实验。此外,我们试图阐明的机制WKYMVm / FPR2调节microglia-associated炎症。我们的数据表明,WKYMVm / FPR2在体内和体外均具有明显的抗炎作用,减少组织损伤与SCI大鼠。此外,这些影响的机制包括WKYMVm中介FPR2活化,抑制ERK1/2和NF -
κB信号通路。这些结果表明,WKYMVm负调节炎性反应在SCI大鼠和WKYMVm / SCI FPR2可能是一个新颖的治疗目标,值得进一步研究和发展。
2。材料和方法
2.1。试剂和抗体
WKYMVm收购从Gibco技术(美国蒙特克莱尔,CA)及其纯度≥98%。脂多糖(LPS)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。FPR2的主要抗体,进气阀打开,Iba-1罗福斯提供的生物制剂(美国公司Novusbio)。p38, p-p38 p-ERK、ERK p-NF -
κB p65, NF -
κB p65,我
κB
α,
β微管蛋白抗体主要是购买的亲和力(亲和力生物科学、江苏、中国)。4
′
6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)从Phygene购买(福州,中国)。alexa -萤石- 488和alexa -萤石- 594标记的第二抗体来源于Abcam(美国波士顿)。细胞培养的试剂购自Gibco技术(美国纽约大岛)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒的老鼠肿瘤坏死因子-
α、il - 6和il - 1
β得到从NEOBIOSCIENCE(中国深圳)。Evo M-MLV RT qPCR预混料是获得准确的生物技术有限公司有限公司(长沙,中国)。NovoStart®SYBR qPCR SuperMix +提供了Novoprotein(上海,中国)。
2.2。制药抑制剂
特定抑制剂用于细胞实验如下:p38-specific抑制剂(美国Gibco SB203580) ERK-specific抑制剂(美国Gibco U0126)和NF -
κB p65-specific抑制剂(美国Gibco bay11 - 7082)。细胞被使用这些药物抑制剂1小时,其次是其他治疗。
2.3。主小胶质细胞隔离和文化
主小胶质细胞准备如下(
39]。Sprague-Dawley新生儿老鼠在出生的第一天从中山大学动物实验室购买。老鼠被斩首,他们的头骨与眼科剪剪刀去除他们的大脑。大脑皮层是孤立和切碎的手术刀,然后接受0.25% Trypsin-EDTA(美国Gibco) 37°C 10分钟。消化完全被停职DMEM / F12培养基组成的90%,10%胎牛血清的边后卫,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100毫克/毫升)。混合使用100 mm细胞过滤器过滤。细胞被播种在烧瓶和5%的二氧化碳培养箱中培养37°C。主要培养14天之后,小胶质细胞被收集的震动和金属堆焊。
高度积极的增殖无限增殖(哈皮神)小神经胶质细胞,是鼠小胶质细胞系,得到从BLUEFCELL (BFB、上海、中国)。哈皮神小胶质细胞培养在一个完整的DMEM培养基组成的90%,10%的边后卫,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100毫克/毫升)在孵化器的恒温37°C和5%的二氧化碳。哈皮神主要小胶质细胞和小胶质细胞治疗有或没有不同浓度的WKYMVm 2小时,然后加入一定量有限合伙人文化媒体在不同时期的具体浓度。
2.4。细胞毒性试验
WKYMVm细胞毒性,哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞主要是检查使用CCK-8工具包。哈皮神主要小胶质细胞和小胶质细胞被播种在96 -孔板的密度
5
×
103年
每口井和治疗一系列WKYMVm浓度为12小时,24小时,或48小时。接下来,CCK-8装备解决方案(10
μ信用证)添加到96孔板,然后在黑暗中孵化1小时。吸光度检测在450 nm标并记录。
2.5。SCI动物模型和治疗
成年女性Sprague-Dawley老鼠(200 - 220 g)从北京获得查尔斯河实验室动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。动物们休息7天手术前适应环境。在大鼠脊髓损伤协议前面描述的(
40]。短暂、老鼠和1%戊巴比妥钠麻醉(降价毫克/公斤)造成最小的痛苦。操作员进行椎板切除术位于T9椎节和移除周围的皮肤和肌肉暴露脊柱尖尖的过程。脊髓是明确暴露,用血管夹夹(60克力、置、中国)60秒建立适度粉碎损伤模型。虚假的集团执行T9椎板切除术,脊髓是暴露了60秒不压缩损伤。手术后,老鼠从SCI + WKYMVm组腹腔注射WKYMVm(溶解在0.9%氯化钠)的剂量4毫克/公斤体重。相比之下,虚假的组和SCI组的大鼠腹腔注射0.9%氯化钠在相同的体积。注射进行腹腔完全与应用程序之间的间隔24小时3倍。老鼠被安置12 h(光/暗周期标准温度条件下,进食和饮水。手术后,膀胱被清空,一天两次,直到膀胱功能恢复。
2.6。免疫印迹分析
脊髓组织收集在一个特定时间后根据实验要求操作。短暂,脊髓组织和小胶质细胞细胞溶解在里帕缓冲区,然后是蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸二钠(BCA)测定。总蛋白质受到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),然后通过electroblotting转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。与5%的脱脂奶粉阻塞后1小时和洗涤TBST (Tris-HCl-based缓冲与渐变20)缓冲30分钟,具体主要抗体与膜蛋白是孵化指定的稀释在一夜之间在4°C。然后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体1小时在室温下与TBST洗了三次。Immunolabeling发现了ECL试剂(热费希尔科学)。合成信号检测使用ImageQuant Las4000mini(通用电气、日本)和量化的蛋白质密度是由ImageJ软件。
β微管蛋白担任内部控制。
2.7。RNA隔离和实时PCR
治疗后,总rna提取的哈皮神小胶质细胞,主要小胶质细胞,脊髓组织匀浆使用试剂盒®试剂(美国CA英杰公司)根据制造商的指示。RNA浓度测定的分光光度计。PCR扩增,10
μl反应体积,包括5
μl 2×NovoStart®SYBR qPCR SuperMix +(上海,中国),每个引物0.2更易/ l, 2
μl 2倍稀释cDNA,无菌蒸馏水。反应和检测进行了光周期计(瑞士罗氏公司)。引物序列表中列出
1。收集周期阈值(Ct)值和规范化水平的管家GAPDH基因。
PCR引物。
| 基因 |
序列 |
加入 |
| FPR2 |
F 5
′
-GAGCCTGGCTAGGAAGGTG-3
′
|
NM_008039.2 |
| R 5
′
-TGCTGAAACCAATAAGGAACCTG-3
′
|
| 伊诺 |
F 5
′
-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3
′
|
NM_010927.4 |
| R 5
′
-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3
′
|
| 肿瘤坏死因子-
α |
F 5
′
-ATGGGCTCCCTCTCATCAGT-3
′
|
NM_013693.3 |
| R GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3
′
|
| il - 6 |
F 5
′
-AACCACGGCCTTCCCTACTTCA-3
′
|
NM_001314054.1 |
| R 5
′
-TCATTTCCACGATTTCCCAGAG-3
′
|
| il - 1
β |
F 5
′
-AGGAGAGACAAGCAACGACA-3
′
|
NM_008361.4 |
| R 5
′
-CTTTTCCATCTTCTTCTTTGGGTAT-3
′
|
| GAPDH |
F 5
′
-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3
′
|
NM_036165840.1 |
| R 5
′
-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3
′
|
2.8。免疫组织化学(包含IHC)
大鼠脊髓组织的部分(T9横向)deparaffinized,水化,heat-mediated抗原进行检索与柠檬酸钠在95°C,持续15分钟。部分是孵化H为3%2O215分钟,洗了三次磷酸盐(PBS)。然后用0.25%的部分被孵化Triton x - 100 10分钟。在PBS洗涤三次后,10%的部分被封锁山羊血清和孵化隔夜anti-iNOS主要抗体(1:50)在4°C。第二天,片清洗去除的主要抗体,然后孵化HRP-conjugated二级抗体室温为60分钟,和3,3
′
-diaminobenzidine用于生成信号。所有图片使用显微镜观察(徕卡DMI4000B,位于德国)。
2.9。免疫荧光和组织学分析
免疫荧光法进行细胞或组织。主小胶质细胞被固定为4% PFA 20分钟。大鼠脊髓组织deparaffinized和水化。组织或细胞片permeabilized 0.25% Triton x - 100 20分钟和屏蔽10%正常驴血清30分钟。然后,他们孵化与以下主要抗体在一夜之间在4°C: anti-FPR2 (1: 50), anti-iNOS(1: 50),和anti-Ib
α1 (1:300)。第二天,与PBS洗涤三次后,主要探讨了抗体与下列二次抗体室温1小时:Alexa-Fluor 488驴anti-rabbit和Alexa-Fluor 594驴抗体。最后,切片后用DAPI标记与PBS清洗三次。所有图片观察使用一个奥林巴斯BX63显微镜(日本奥林巴斯)。
评估的程度的损伤和神经元损失,进行组织病理学检查与苏木精和伊红())和尼氏小染色按照制造商的指示。亮场显微镜(奥林巴斯、东京、日本)被用来观察和获取图像。
2.10。酶联免疫吸附试验(ELISA)
上层清液收集细胞培养和组织细胞溶解和细胞因子生产随后化验。细胞因子肿瘤坏死因子-
α、il - 6和il - 1
β评估使用NeoBiosence ELISA试剂盒(中国深圳)后,制造商的协议。数据是通过使用一个Multiskan日出标(TECAN、奥地利)。
2.11。运动功能评估
运动功能评估利用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)分数和足迹分析SCI后。BBB评分的范围包括评估步态、关节运动,肢体协调,躯干稳定从0(没有肢体运动或重量支持)至21日(正常的运动)。老鼠被允许自由移动在一个开放的实验场。足迹分析、鼠后和前四肢下降了红色和蓝色染料,分别。老鼠的运动功能评价是由两名有经验的观察者蒙蔽的实验条件。
2.12。统计分析
所有数据都表示为一个
意味着
±
扫描电镜
格式至少有三个独立的实验。分析了统计学意义与单向方差分析(方差分析)使用GraphPad棱镜8 (La Jolla、钙、美国)窗口。的值
p
<
0.05
显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。WKYMVm没有对小胶质细胞增殖的影响和可行性
WKYMVm如图的分子结构
1(一)。检查WKYMVm小胶质细胞增殖和生存能力的影响,使用CCK-8工具包。小胶质细胞(主要包括哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞)与一系列孵化WKYMVm浓度为12,24和48小时。如数据所示
1 (b)- - - - - -
1 (d),WKYMVm
浓度
≤
10
μ
摩尔
/
l
并不影响的扩散或可行性哈皮神小胶质细胞与对照组相比。同样,WKYMVm在
浓度
≤
2
μ
摩尔
/
l
并不影响主小胶质细胞的增殖或生存能力(数据吗
1 (e)- - - - - -
1 (g))。这些结果表明,0 ~ 10
μmol / l WKYMVm刺激哈皮神小胶质细胞和0 ~ 2
μmol / l WKYMVm主要刺激小胶质细胞不诱导细胞毒性。
WKYMVm没有对小胶质细胞增殖的影响和可行性。(一)WKYMVm的分子结构。细胞毒性的影响主要WKYMVm哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞被CCK-8化验检查。(罪犯)哈皮神小胶质细胞孵化了增加浓度(0、0.1、1、5、10
μ摩尔WKYMVm 12 h / l), 24小时和48小时37°C。(eg)主要小胶质细胞孵化与增加浓度(0、0.1、0.5、1和2
μ摩尔WKYMVm 12 h / l), 24小时和48小时37°C。M。Wt:分子量。
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3.2。WKYMVm提升FPR2在小胶质细胞的表达
调查的影响WKYMVm FPR2表达式在小胶质细胞,我们评估的表达主要FPR2哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞在不同浓度的WKYMVm。免疫印迹分析表明,FPR2的表达在两个小胶质细胞WKYMVm浓度的增加而增加(数据
2(一个)和
2 (b))。进一步的实时PCR证实这一趋势(数据
2 (c)和
2 (d))。此外,我们进行免疫荧光costaining FPR2和Iba-1(古典小胶质细胞的标志)在主要小胶质细胞。免疫印迹分析和实时PCR结果一致,FPR2荧光强度(图WKYMVm浓度的增加而增加
2 (e))。这些结果表明,WKYMVm促进FPR2的表达在小胶质细胞浓度的方式。在这项研究中,我们选择5
μmol / l和1
μmol / l作为主要哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞的治疗浓度,分别。
WKYMVm提升FPR2在小胶质细胞的表达。(a, b)西方印迹和定量数据FPR2表达主要哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞刺激WKYMVm的不同浓度。(c, d) FPR2 mRNA水平主要哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞是由不同浓度的WKYMVm所激发的。(e)免疫荧光染色的FPR2主要小胶质细胞刺激通过WKYMVm浓度从0到2
μmol / l。酒吧规模:50
μm。
∗
p
<
0.05
与对照组;
#
p
<
0.05
与5
μmol / l WKYMVm组;
#
#
p
<
0.05
与1
μmol / l WKYMVm组。
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3.3。在小胶质细胞WKYMVm抑制炎性细胞因子的生产
促炎细胞因子的分泌表明炎症反应的存在。验证WKYMVm的抗炎效果,我们检查的影响WKYMVm促炎细胞因子(TNF -生产的
α、il - 6和il - 1
β)LPS-stimulated小胶质细胞。与LPS刺激,哈皮神小胶质细胞和初级小胶质细胞显示出较高的mRNA水平的TNF -
α、il - 6和il - 1
β比对照组。值得注意的是,WKYMVm显著减少这些细胞因子的基因水平小胶质细胞(数字
3(一个)- - - - - -
3 (f))。ELISA还显示,肿瘤坏死因子-
α、il - 6和il - 1
β上层清液的产量显著增加LPS-stimulated小胶质细胞,而WKYMVm上层清液中表达下调这些细胞因子的水平哈皮神小胶质细胞(数字
3 (g)- - - - - -
3(我))和初级小胶质细胞(数据
3 (j)- - - - - -
3(左))。因此,我们的研究结果表明,WKYMVm有抑制小胶质细胞对炎症反应的影响。
在小胶质细胞WKYMVm抑制炎性细胞因子的生产。TNF - (a - c)的表达水平
α、il - 6和il - 1
β从每组在哈皮神小胶质细胞被rt - pcr检测分析。(d-f) mRNA水平的TNF -
α、il - 6和il - 1
β从每组在初级小胶质细胞。胃肠道肿瘤坏死因子的蛋白质含量
α、il - 6和il - 1
β上层清液的哈皮神小胶质细胞培养基被ELISA检测。(j-l)蛋白水平的肿瘤坏死因子-
α、il - 6和il - 1
β上层清液的主要小胶质细胞培养基。
∗
p
<
0.05
与对照组;
#
p
<
0.05
与LPS组。
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3.4。M1 WKYMVm抑制小胶质极化
M1-polarized小胶质细胞,它代表了促炎的亚型,可能导致增加促炎细胞因子(
41]。伊诺的标志被认为是M1小胶质极化(
42]。探索WKYMVm在小胶质细胞极化的影响,我们研究了伊诺蛋白质和mRNA水平LPS-stimulated小胶质细胞有或没有与WKYMVm预处理。免疫印迹分析表明,伊诺蛋白水平升高了LPS刺激与对照组相比,和WKYMVm显著抑制生产伊诺LPS-stimulated哈皮神小胶质细胞(图
4(一))和初级小胶质细胞(图
4 (b))。与蛋白质含量变化一致,伊诺基因水平显著增加LPS-stimulated哈皮神小胶质细胞和初级小胶质细胞,和预处理WKYMVm显著降低伊诺mRNA水平(数字
4 (c)和
4 (d))。此外,WKYMVm逆转荧光强度的增加在初选LPS-induced伊诺小胶质细胞(图
4 (e))。此外,初级小胶质细胞变成变形虫,形状与LPS刺激后,这表明M1亚型的形态表现,这效果部分逆转治疗WKYMVm(图
4 (f))。综上所述,这些研究结果表明LPS诱导小胶质细胞M1极化,和WKYMVm推翻了这种效应。
M1 WKYMVm抑制小胶质极化。伊诺是M1小胶质细胞的标记之一。(a, b)西方伊诺蛋白印迹和定量数据从不同的群体主要哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞。(c, d)伊诺mRNA的表达在初选哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞从每组由rt - pcr检测分析。伊诺(e)免疫荧光染色的主要小胶质细胞从不同的群体。酒吧规模:50
μm。(f)形态主要小胶质细胞与有限合伙人或WKYMVm治疗的结果。酒吧规模:100
μm。
∗
p
<
0.05
与对照组;
#
p
<
0.05
与LPS组。
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3.5。<斜体> WKYMVm抑制ERK1/2和NF -κB < /斜体> p65信号通路,影响人们在小胶质细胞信号通路
MAPKs,包括p38和ERK1/2,炎症调节发挥重要作用;因此,我们研究是否激活WKYMVm / FPR2影响MAPK信号通路在LPS-induced小胶质细胞。免疫印迹分析是用来确定WKYMVm能否抑制LPS-induced磷酸化P38和ERK1/2哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞。蛋白质的表达p-p38, p38 p-ERK1/2 ERK1/2,
β微管蛋白在对照组,有限合伙人,有限合伙人+ SB203580集团有限合伙人+ U0126集团和有限合伙人+ WKYMVm集团进行了分析。研究结果表明,有限合伙人肯定增强p38的磷酸化,这被SB203580抑制效果。然而,p-p38增强WKYMVm主要哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞(数字
5(一个)和
5 (d))。同样,有限合伙人p-ERK1/2水平显著增加,但这一趋势被U0126和WKYMVm(数据有效地抑制
5 (b)和
5 (e))。
WKYMVm抑制ERK1/2和NF -
κB p65信号通路和影响人们在小胶质细胞信号通路。(a - c)免疫印迹分析和定量数据。FPR2激活的影响WKYMVm p38磷酸化,ERK1/2, NF -
κB p65,和我
κB
α蛋白质水平LPS-treated哈皮神小胶质细胞有或没有WKYMVm预处理。(d-f) p-p38免疫印迹分析和定量数据,p-ERK1/2 p-NF -
κB p65,和我
κB
α从每组主要的小胶质细胞。SB203580: p38-specific抑制剂;U0126: ERK-specific抑制剂;bay11 - 7082: NF -
κB p65-specific抑制剂。
∗
p
<
0.05
与对照组;
#
p
<
0.05
与LPS组。
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NF -
κB p65信号通路是小胶质极化最重要的监管机构之一,和它的磷酸化激活伴随着p65和NF -退化
κ我抑制剂
κB
α(
43,
44]。确定的抗炎机制激活WKYMVm / FPR2,我们检查了NF -水平的关键
κB信号通路介质p65和我
κB
α在LPS-stimulated哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞。p-NF——的蛋白表达
κB p65, NF -
κB p65,我
κB
α,
β分析了微管蛋白免疫印迹在对照组,有限合伙人,有限合伙人+ bay11 - 7082组,有限合伙人+ WKYMVm组。与对照组相比,NF -的磷酸化
κB p65 LPS组显著增加,而bay11 - 7082和WKYMVm有效地抑制这种效应(数字
5 (c)和
5 (f))。正如所料,LPS-induced总我
κB
α显著抑制了蛋白质降解bay11 - 7082和WKYMVm(数字
5 (c)和
5 (f))。因此,ERK1/2和NF -
κB p65信号通路可能是至关重要的在小胶质细胞参与炎症过程,并通过WKYMVm FPR2激活的抗炎效果可能与这些途径。
3.6。<斜体> WKYMVm抑制ERK1/2和NF -κB < /斜体> p65信号通路和SCI后p38信号通路的影响
基于WKYMVm对人们的影响,ERK1/2, NF -
κB p65信号通路在体外,体内我们进一步验证了结果。免疫印迹分析被用来评估WKYMVm能否抑制p-p38 p-ERK1/2, p-p65 SCI的蛋白表达。结果表明,p38的磷酸化是SCI组增加,而WKYMVm增强(图
6(一))。然而,ERK1/2 p65磷酸化在SCI显著增加,这影响是显著抑制WKYMVm(数字
6 (b)和
6 (c))。我们的数据表明,SCI显著增强p38 ERK1/2, NF -
κB p65磷酸化,WKYMVm减少ERK1/2和NF -的磷酸化
κB p65但不是人们。
WKYMVm抑制ERK1/2和NF -
κB p65信号通路和SCI后p38信号通路的影响。(a - c)西方p-p38印迹和定量数据,p-ERK1/2, p-p65蛋白质在组织72年SCI后h。
∗
p
<
0.05
与虚假的集团;
#
p
<
0.05
对SCI组。
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3.7。SCI后WKYMVm减毒M1极化
抑制作用的基础上WKYMVm / FPR2 M1小胶质细胞体外,我们进一步探讨了WKYMVm对脊髓损伤后大鼠小胶质细胞。如图
7(一)伊诺SCI组显著增加,通过免疫组织化学方法如图所示,WKYMVm治疗逆转了这一效应。此外,伊诺蛋白表达在受损的部分样本,检查和结果表明,SCI显著增加伊诺表达式,这效果是由WKYMVm抑制(图
7 (b))。此外,免疫荧光costaining伊诺和执行Iba-1和伊诺的数量,Iba-1-positive细胞被SCI组升高,WKYMVm逆转伊诺的水平在SCI组(图
7 (c))。这些数据表明,WKYMVm / FPR2阻塞小胶质极化的M1亚型脊髓受伤。
WKYMVm减毒M1极化和改善SCI后炎性微环境。(一)免疫组织化学显示伊诺信号部分的组织在SCI 72 h。酒吧规模:50
μ米(伊诺/包含IHC);20
μm(放大)。(b)西方印迹和定量数据伊诺蛋白表达的部分组织在SCI后72 h。(c)双重免疫荧光染色法和定量数据伊诺-(绿色)和Iba-1(红色)积极的部分小胶质细胞组织在SCI后72 h。白色箭头标记阳性细胞。酒吧规模:50
μm。(d-f)肿瘤坏死因子的水平
α、il - 6和il - 1
β信使rna从SCI大鼠组织处理或不WKYMVm测量通过rt - pcr在72 h。(胃肠道)量化分析TNF -的生产
α、il - 6和il - 1
β通过ELISA SCI后的脊髓。
∗
p
<
0.05
与虚假的集团;
#
p
<
0.05
对SCI组。
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3.8。WKYMVm SCI后改善了炎性微环境
调查是否FPR2激活WKYMVm可以抑制体内促炎细胞因子的水平,TNF -的生产
α、il - 6和il - 1
β测量样品的损坏部分在3天后SCI rt - pcr和ELISA。如数据所示
7 (d)- - - - - -
7 (f),TNF的mRNA水平
α、il - 6和il - 1
βSCI后增加,而这三种细胞因子的mRNA水平被WKYMVm抑制。的分泌TNF -
α、il - 6和il - 1
βSCI + WKYMVm组肯定是低于SCI集团由ELISA(数字
7 (g)- - - - - -
7(我))。我们的研究结果表明,WKYMVm抑制促炎细胞因子的生产,如肿瘤坏死因子-
α、il - 6和il - 1
β在脊髓受损。
3.9。SCI后WKYMVm减少组织损伤和功能下降
调查的神经保护效应WKYMVm / FPR2,石蜡切片染色)和尼氏小。结果表明,损害中央灰质和白质外围SCI组是更重要的比虚假的集团和结构性障碍的外围白质在SCI组更为严重。然而,组织破坏SCI + WKYMVm组低于在SCI集团(数字
8(一个)和
8 (b))。此外,石蜡切片染色和尼氏小,Nissl-positive疫源地的数量统计。结果显示严重神经科学组的损失,而尼氏小染色的数量在脊髓中央灰质SCI + WKYMVm组高于SCI组(数字
8(一个)和
8 (c))。这些数据表明,WKYMVm保护作用在SCI后受损神经元和脊髓组织。
SCI后WKYMVm减少组织损伤和功能下降。(一)代表图像)和尼氏小染色手术后21 d。定量数据(b))和(c)尼氏小染色。(d)图像显示负重步行和后肢运动的骗局,SCI, SCI + WKYMVm组。红色箭头指示weight-supported步进。(e)的足迹分析大鼠不同组织。(f)老鼠的量化步长和步宽的足迹分析。(g)低音部,比蒂和Bresnahan (BBB)手术后得分。酒吧规模:500
μ());200年
μ米(放大);100年
μ(尼氏小)。
∗
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<
0.05
与虚假的集团;
#
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0.05
对SCI组。
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负重行走和足迹分析是评估在手术后21天,这直接反映出运动机能。如图
8 (d)虚假的组、老鼠很容易两后肢支撑自己的体重。然而,科学组大鼠后肢几乎不能支持自己的体重。值得注意的是,在SCI大鼠+ WKYMVm集团能够支持他们的体重与后肢或偶尔两后肢。碳足迹分析显示后肢差异的协调。如数据所示
8 (e)和
8 (f)虚假的组,老鼠的脚印很清楚没有拖。形成鲜明对比的虚假的集团,未经处理的SCI大鼠后肢的显示明显的拖(红色足迹)。正如所料,WKYMVm-treated SCI大鼠表现出相当一致的后肢轨迹在受伤后21天,拖。此外,我们通过确定BBB评分量化运动机能。BBB评分都以1、3、7、14、21天挫伤后评估WKYMVm是否能够防止运动机能下降。在1和3天后挫伤,BBB评分在SCI组和SCI + WKYMVm组没有显著差异(图
8 (g))。然而,BBB SCI + WKYMVm组分数高于那些在SCI后7天(图组
8 (g))。这些结果表明,WKYMVm SCI后能减少组织损伤和功能障碍。
4所示。讨论
在这项研究中,我们证明了FPR2激活WKYMVm产生明显抑制作用通过阻断促炎细胞因子的释放LPS-stimulated小胶质细胞(包括主要哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞)和SCI大鼠。这项研究提供了如下证据:(1)WKYMVm促进FPR2在小胶质细胞的表达;(2)由WKYMVm FPR2激活减弱ERK1/2和NF -
κB信号LPS-stimulated小胶质细胞;(3)由WKYMVm FPR2激活减少促炎介质的分泌和小胶质细胞M1极化;(4)治疗WKYMVm抑制M1小胶质极化和生产受损脊髓的促炎介质;和(5)FPR2激活WKYMVm减轻SCI后继发损伤,减少组织损伤的老鼠。我们所知,这是第一个研究证实FPR2的作用后的炎症反应和WKYMVm监管SCI和抑制炎症反应的描述WKYMVm-activated FPR2通过负ERK1/2调制和NF -
κB p65信号通路在小胶质细胞(图
9)。
工作模型显示WKYMVm体外和体内的效果。(一)WKYMVm抑制ERK1/2和NF -
κB信号通路,减弱M1小胶质极化,减少炎性细胞因子表达在体外。(b) WKYMVm减少组织损伤和功能下降SCI后通过抑制炎性细胞因子在体内。有限合伙人:脂多糖;FPR2:甲酰肽受体2;ERK1/2:细胞外响应激酶1和2;NF -
κB:核因子-
κB;科学:脊髓损伤。
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科学是一个临床问题与高死亡率和伤残率(
45]。SCI的病理过程分为两个阶段:初等和中等伤害。主要伤害是由直接的机械力引起的。二次损伤是次要的机械力和涉及一系列复杂的分子反应,包括离子稳态的破坏,局部水肿、缺血,局灶性出血,氧化应激和炎症反应
46]。急性炎症过程是一个天生的宿主防御机制对入侵病原体和组织损伤。过度分泌的促炎介质和神经毒性分子抑制的一个重要原因是功能恢复和加重脊髓受损的神经性感觉异常(
47,
48]。调节炎症决议已被建议作为一项新策略来治疗多种中枢神经系统疾病。因此,减少炎症反应期间二次损伤可能是一个潜在的战略科学治疗。在这项研究中,我们探索之间的关系的分泌炎症因子和炎性环境科学的体内和体外。我们发现,生产各种炎症因子,如肿瘤坏死因子-
α、il - 6和il - 1
β在LPS-stimulated显著升高小胶质模型和SCI的大鼠模型。我们的研究结果与以前的研究一致
27,
28]。
玻璃钢形成高阶结构(例如,FPR1 / FPR2形成,FPR2同源二聚体,和FPR1同源二聚体)导致下游细胞内信号通路的变化,允许colocalization效应领域,提高细胞内激活,或创建新的配体特异性
49,
50]。一些研究证据表明,玻璃钢的功能是与许多疾病有关,如炎症性疾病,癌症和感染(
51,
52]。最近,许多研究表明,抗炎作用的玻璃钢FPR2引发的主要受体。FPR2最初发现白细胞,后来发现是广泛表达于吞噬细胞类型,如中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和干细胞(
53,
54]。FPR2也在小胶质细胞中表达的丰富
55- - - - - -
57]。符合这一结论,我们的结果表明,FPR2表达在初选哈皮神小胶质细胞和小胶质细胞和受体激动剂WKYMVm的浓度的增加而增加。FPR2可以起到抗炎和促炎作用,这个矛盾的函数是由配体的性质和形成的高阶结构。Annexin-1和Lipoxin A4配体诱导的抗炎效应FPR2 [
56,
57]。最近,据报道,合成FPR2兴奋剂WKYMVm有很强的抗炎作用,可以抑制促炎细胞因子的分泌和促进抗炎细胞因子的表达
34]。
WKYMVm,这是一种免疫调节肽对FPR2强大的亲和力,据报道,最近有多个对细胞分化的影响(
31日),还可以刺激多种细胞的趋化性,如单核细胞,中性粒细胞,B淋巴细胞(
58,
59]。以前的研究已经表明WKYMVm抑制水平的关键炎症和免疫相关基因在多个损伤或疾病模型和对组织如骨骼施加显著抗炎作用和肺
31日,
60]。此外,胡锦涛和他的同事证明了WKYMVm肽抑制osteoclastogenesis下调促炎因子的水平如TNF -
α和il - 1
β(
36]。其他FPR2受体激动剂,如Annexin-1 Lipoxin A4,曾被报道促进康复SCI (
56,
57]。然而,WKYMVm对小胶质细胞的影响和SCI很少被报道。因此,我们假设WKYMVm抑制炎症条件下科学。我们的研究结果表明,WKYMVm减少LPS-induced小胶质炎症,这与先前的报道是一致的,WKYMVm抑制炎性反应在桥梁养护管理系统,原始细胞(264.7
36],和HUVECs [
61年]。在这项研究中,我们发现WKYMVm负调控炎症体外。此外,WKYMVm还减少促炎因子在SCI后受损组织。符合这一观察,M1的LPS-stimulated极化小胶质细胞被WKYMVm部分逆转,变形虫,变化的程度降低,和水平的古典M1小胶质标记,如进气阀打开,是降低了。我们的细胞形态学结果与先前的报道是一致的(
62年]。因此,我们认为,抑制炎症因子表达WKYMVm FPR2激活后可能通过抑制M1小胶质极化。
Tylek和他的同事调查了有益的抗氧化剂和解决FPR2受体激动剂对LPS-stimulated小胶质细胞的影响,发现p38, ERK1/2, NF -
κB可能是至关重要的信号通路(
63年]。此外,据报道在文献[
63年,
64年NF -]
κB和MAPK通路是重要的控制中枢神经系统炎症的治疗靶点。因此,阻止这些信号通路可能对SCI保护作用。基于这些研究成果,我们探讨了潜在机制WKYMVm / FPR2抑制促炎的激活小胶质亚型体外。首先,我们调查的影响WKYMVm / FPR2 p38和ERK1/2信号通路。结果表明,FPR2激活通过WKYMVm可以减少ERK1/2但不是p38的磷酸化。我们的观察并不完全符合其他报道称FPR2刺激诱导多个信号蛋白的磷酸化,包括p38MAPK和ERK1/2 [
65年,
66年]。的差异可能与FPR2作用于受体激动剂的性质,和不同的受体激动剂有不同影响MAPK信号通路(
63年]。此外,我们研究了由WKYMVm FPR2激活和NF -之间的关系
κB p65信号通路。我们的研究结果表明,WKYMVm / FPR2调节我的水平
κB
α和表达下调p-p65水平,从而阻断激活的NF -
κB信号通路,与先前的研究一致的其他受体激动剂(
36,
63年]。这些发现表明,WKYMVm / FPR2抑制NF -
κB在炎症条件下小胶质细胞信号通路。然而,特定WKYMVm / FPR2 MAPK信号通路的影响还不清楚,和研究结论不一致,需要进一步的研究。
本研究的另一个重要的发现是,WKYMVm / FPR2有效抑制大鼠的炎症反应。我们的结果表明,腹腔内注射WKYMVm减少伊诺SCI的生产现场。除此之外,WKYMVm大幅减毒TNF -的生产
α、il - 6和il - 1
β受损组织的老鼠,这与我们的体外结果是相一致的。这些结果表明,激活的FPR2 WKYMVm缓解受损的脊髓炎症反应,这可能是通过抑制M1小胶质极化。此外,我们发现WKYMVm / FPR2结构性破坏,减少神经元损失,SCI大鼠和功能下降,这表明对减轻创伤SCI WKYMVm是一种有效的分子。
我们的研究也有一些局限性。首先,由于时间限制,我们没有击倒FPR2受体观察WKYMVM是否影响FPR2时小胶质细胞低表达。第二,我们只进行简单的信号通路相关验证没有进一步的探索。最后,WKYMVm / FPR2能否减少组织损伤通过抑制炎症以外的机制还有待研究。
总之,我们的研究结果提供的证据的作用WKYMVm / FPR2炎症调节小胶质细胞。FPR2 WKYMVm抑制活化的小胶质M1极化和炎症因子分泌,减少组织破坏和功能下降SCI通过调制ERK1/2和NF -
κB信号通路。此外,我们的研究结果表明,FPR2 WKYMVm激活可能在SCI的治疗有潜在的发展价值。