1。介绍
变应性鼻炎(AR)是最常见的慢性疾病之一,影响了全球10% - -30%的人(
1,
2]。基于“增大化现实”技术管理在亚洲国家的估计社会经济负担范围从30到1000亿美元(
3,
4]。基于“增大化现实”技术是一种免疫球蛋白E - (IgE)和2型辅助T细胞——(Th2)介导的炎症反应引起的鼻粘膜各种吸入过敏原。它的特点是鼻液溢,鼻凝结,瘙痒,打喷嚏
5,
6]。除了它的直接影响,包括疲劳,工作效率低,认知障碍,甚至心理障碍,它往往与此同时与其他过敏性并发症发生,如哮喘和结膜炎
7]。
基于“增大化现实”技术的一线治疗,包括糖皮质激素、抗组胺、白三烯受体拮抗剂,是效果低于预期,可能因为个体差异和病人的依从性差
7,
8]。近年来,免疫疗法的基于“增大化现实”技术是一种很有前途的方法(
9]。有浓度过敏原特异性免疫疗法(AIT)已经批准的患者患有中度到重度的基于“增大化现实”技术的症状和那些没有得到适当的药物治疗。然而,河中的小岛的疗效和安全性需要进一步改进(
10]。更深入地理解底层机制的基于“增大化现实”技术的发展提供新的见解有前途的基于“增大化现实”技术的治疗策略。
CD226,也称为DNAM-1 (DNAX配件molecule-1)是一种糖蛋白属于免疫球蛋白超家族costimulatory分子和功能。CD226主要表达于T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T (NKT)细胞,单核细胞,内皮细胞,肥大细胞,嗜酸性粒细胞(
11- - - - - -
13]。CD226与其配体之间的相互作用CD155 CD112 CD226之间的竞争和coinhibitory分子T细胞免疫球蛋白和ITIM域(TIGIT)允许CD226参与几个免疫过程(
14,
15]。先前的研究已经证明CD226在抗肿瘤反应的作用,通过免疫细胞调节自身免疫性疾病和抗病毒反应(
16- - - - - -
20.]。在哮喘、CD226-mediated NKT细胞激活促进Th2细胞分化,加剧了疾病(
21]。未知如果CD226调节其他主要细胞,包括Th2细胞和2型先天淋巴细胞在气道变应性疾病。
最近的研究涉及2型先天淋巴细胞(ILC2s)小说lineage-negative淋巴细胞的数量,产生2型细胞因子在人类过敏疾病发病机理。ILC2s已发现在肺癌、支气管肺泡灌洗、鼻粘膜、鼻息肉、胃肠道、皮肤和血液在人类和老鼠
22]。然而,CD226表情ILC2s及其作用,基于“增大化现实”技术的发病机制仍然未知。在这项研究中,我们主要评估函数CD226的病理生理学ILC2s使用的基于“增大化现实”技术及其功能
Cd226敲除小鼠(KO),这可能为基于“增大化现实”技术的临床治疗提供新方法。
2。材料和方法
2.1。动物
实验过程都是科研伦理委员会批准第四军医大学(排名20211008)。本研究使用8-12-week-old雌性小鼠,分别安置在通风笼和美联储与标准实验室食物和水。野生型小鼠C57BL / 6 (WT)购买从第四军医大学动物中心。全球
Cd226KO小鼠请教授提供的马可报摊(华盛顿大学)
23]。
Cd226-floxed老鼠(
Cd226fl / fl)是由Cyagen(苏州、中国),正如我们之前报道(
24]。
Cd4cre+ /−吴教授提供的老鼠请宁(HUST同济医学院,中国)。
Cd226fl / fl老鼠了,
Cd4生成CD4 cre老鼠+T特异性
Cd226KO小鼠(
Cd226∆CD4)。所有的动物都在C57BL / 6 j背景。
2.2。卵清蛋白(OVA)诱导小鼠模型
AR小鼠模型构建如前所述,用细微的修改(
25]。天0、7、14、小鼠腹腔内注射50
μ美国克卵清蛋白(Sigma-Aldrich)乳化在200年
μL(无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)包含2毫克的氢氧化铝。21 - 25日在天,50
μ克的卵子溶解在40
μL无菌PBS的鼻内交付(20
μ每个鼻孔L)。老鼠牺牲后的24小时内,最终的挑战(26天)。对照组小鼠致敏和挑战生理盐水(NS)。
2.3。鼻症状评分
最后后30分钟内鼻内挑战25天,一个10分钟的视频记录。鼻摩擦的频率和打喷嚏的行为在这一时期是由两个独立观察员蒙蔽。连续的鼻子摩擦行为被记录为一个事件(
26]。
2.4。血常规试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)
血液样本(50
μL)收集在一个抗凝管和分析使用CLVC df - 3000兽医自动化血液学分析仪(中国,北京)。休息的血液被收集在离心管获得血清。血清中总IgE和组胺含量测定使用商业化酶联免疫试剂盒(Dakewe生物技术,中国;恒远生物技术,中国)。OVA-specific IgE, IgG1 IgG2a水平血清测定根据制造商的指示。总之,ELISA板涂有10
μ克/毫升的卵子孵化了稀释血清样本在37°C 1.5 h。然后,antimouse IgE-horseradish过氧化物酶(合)(美国表达载体),antimouse IgG1-HRP(英杰公司、美国),和antimouse IgG2a-biotin(美国表达载体)添加和孵化1 h。IgG2a-biotin,随后的孵化与HRP-streptavidin (Yeasen,中国)。每一步之间的盘子洗了三次。光密度是决定通过测量吸光度在450/595 nm。
2.5。组织学
老鼠牺牲后,整个鼻子都是孤立的和固定在4%多聚甲醛溶液。随后,鼻子脱钙在乙二胺四乙酸(EDTA)解决方案和嵌入式石蜡。组织部分(4
μ米厚)与苏木精和伊红染色(他)和周期性acid-Schiff (PAS)。柱状呼吸道上皮细胞的厚度(crec)鼻中隔测量使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)(
27]。杯状细胞的数量是每500人计算
μ的呼吸道上皮细胞。
肺是固定和嵌入在石蜡。每个部分(4
μ米厚)是沾染了他。炎症评分确定了基于支气管周围的炎症细胞的浸润:0,没有炎症;1、支气管周围一些细胞;2、支气管周围炎症细胞1-cell-layer深度;3、支气管周围炎症细胞2 - 4细胞的深度;4,支气管周围炎症细胞> 4细胞的深度。每个幻灯片被平均五个人评估
28]。
2.6。鼻粘膜ILC2s隔离
整个鼻子都是孤立的,剥皮,用剪刀碎成小块。然后,碎片和1毫克/毫升的胶原酶消化IV (DIYIBio,中国)和10 U /毫升DNase我(Beyotime,中国)和连续搅拌在37°C 40分钟。终止消化过程中,10%的边后卫是补充道。通过一个70后过滤
μm细胞筛选,40%的细胞被resuspended Percoll介质(Yeasen,中国)之上,轻轻的说80% Percoll媒介。细胞在400 g×15分钟然后离心机在室温较低的加速和减速。单核细胞(跨国公司)从40%和80% Percoll介质之间的界面。跨国公司是然后用冰冷的PBS洗两次。ILC2s被确定与流式细胞术使用先前建立的控制策略
29日,
30.]。
2.7。实时定量PCR (qPCR)
小鼠鼻粘膜与鼻骨分离,和总RNA提取试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。反应合成第一链cDNA PrimeScript RT试剂(豆类、日本)。定量实时PCR进行一个AriaMx实时PCR系统(安捷伦科技有限公司位于加州帕罗奥图的美国)使用SYBR (GenStar,中国)分析的表达
Il4,
Il5,
使用Il13,
Il33,
Cd226,
Gata3。基因表达水平正常化
β肌动蛋白。
2.8。流仪(FCM)分析
ILC2分析,孤立的跨国公司是彩色的鸡尾酒以下抗体:CD3e (145 - 2 - c11 BioLegend) CD11b (M1/70 eBioscience) CD11c (N418 BioLegend) CD45R (RA3-6B2 eBioscience)、CD45 (30-F11 BioLegend) ST2 (RMST2-2 eBioscience) KLRG1 (2 f1, eBioscience)和CD226 (10 e5, BioLegend)。ILC2s林的分组人口特征(CD3e, CD11b、CD11c CD45R)−CD45+细胞表达KLRG1 ST2。细胞内细胞因子染色,跨国公司和PMA刺激/ Ionomycin /论坛5 h。细胞外染色后,细胞被固定,permeabilized和孵化anti-IL-5 (TRFK5 eBioscience)和anti-IL-13 (eBioBA eBioscience)抗体。Th2细胞分析,CD4 (RM4-5 eBioscience) CCR6 / CD196 (29-2 L17, BioLegend),和CCR4 / CD194 (2 g12 BioLegend)抗体。定义为CD4 Th2细胞+CCR4+CCR6−细胞。绝对计数珠子(美国英杰公司)是用来计算绝对细胞数量。FMO(荧光- 1)和同形像匹配控制作为控制。FCM数据得到使用光谱细胞分析仪(索尼SA3800)与Novoexpress和分析软件(安捷伦科技)。
2.9。免疫荧光染色
免疫荧光双重染色,包裹鼻粘膜中性缓冲福尔马林固定在4% EDTA溶液脱钙。片4
μ米厚度得到二甲苯脱蜡,紧随其后的是乙醇梯度脱水和PBS。Thy-1 (CD90)和ST2抗体(Abcam,剑桥,英国)是用来确定ILC2s的数量。照片捕捉了使用一个直立的荧光显微镜(德国蔡司)。
2.10。统计分析
给出的数据
的意思是
±
标准
错误
的
的
的意思是
扫描电镜
。使用学生两两进行比较
t
以及。单向方差分析与图基用于事后分析比较在多个组。
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。使用Prism 9.0统计分析软件(美国Graphpad拉霍亚,CA)。
3所示。结果
3.1。缺乏CD226的老鼠改善过敏症状
探索CD226在基于“增大化现实”技术的作用,我们首先评估了全球OVA-induced AR模型
Cd226KO小鼠和WT老鼠。实验设计是呈现在图
1(一)。鼻过敏症状发生在小鼠致敏与卵子和明矾(AR组)但不是在NS组。CD226的影响缺乏过敏症状的老鼠OVA-induced AR给出数据
1 (b)和
1 (c)。鼻摩擦的频率和打喷嚏
Cd226KO小鼠显著下降的价格相比WT老鼠。此外,血清OVA-specific IgE水平和组胺显著降低
Cd226KO小鼠与WT老鼠(数字
1 (d)和
1 (e))。此外,常规血液测试显示嗜酸性粒细胞比例的减少
Cd226KO小鼠暴露于卵子,而没有差别在白细胞和淋巴细胞计数两组之间(图
1 (f))。
CD226缺乏明显变弱OVA-induced AR过敏症状。(a)实验设计的基于“增大化现实”技术的小鼠模型。(b, c)鼻摩擦和打喷嚏的频率(
n
=
5
在10分钟内)后卵子的挑战。(d, e)血清OVA-specific IgE水平(
n
=
6
)和组胺(
n
=
9
使用ELISA)检测。(f)血常规检查白细胞,淋巴和Eos (
n
=
7
)。基于“增大化现实”技术:过敏性鼻炎;卵:卵白蛋白;NS:生理盐水;IgE:免疫球蛋白E;明矾:氢氧化铝;i.p。:腹腔内;i.n。:鼻内; WT: wild type; KO: knockout; WBC: white blood cells; Lymph: lymphocytes; Eos: eosinophils.
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。
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3.2。CD226缺乏降低小鼠上呼吸道炎症
鼻粘膜的厚度是组织学检查确定。的厚度鼻crec明显减少
Cd226KO小鼠与WT小鼠卵子治疗(图
2(一个))。此外,PAS染色显示的鼻黏膜杯状细胞减少
Cd226KO小鼠AR(图
2 (b))。这些结果表明,CD226缺乏变弱OVA-induced增加粘膜厚度在小鼠模型的基于“增大化现实”技术。最少、肺部浸润和炎症分数明显下降
Cd226KO小鼠AR与WT老鼠(图
2 (c))。这些结果表明,CD226可能是一个积极监管机构的基于“增大化现实”技术的病理,因为CD226不足导致的基于“增大化现实”技术的进步。
CD226的缺陷变弱OVA-induced鼻粘膜的炎症和肺的小鼠模型AR。(a)代表他染色和组织病理学的图像。
规模
酒吧
=
50
μ厚度的m。量化crec鼻中隔(
n
=
3
)。(b) PAS染色和量化的鼻黏膜杯状细胞(
n
=
3
)。
规模
酒吧
=
50
μm。(c)代表的图像HE-stained肺部炎症的部分和评估分数(
n
=
5
)。
规模
酒吧
=
200年
μm。基于“增大化现实”技术:过敏性鼻炎;卵:卵白蛋白;NS:生理盐水;crec:柱状呼吸道上皮细胞;他:苏木精和伊红;WT:野生型;柯:淘汰赛。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。
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3.3。CD226表情CD4 <一口> + < /一口> T细胞在基于“增大化现实”技术的发展起到有限的作用
鉴于CD4+T细胞是基于“增大化现实”技术的主要介质,CD226主要表达于T细胞、CD4细胞生成+T特异性
Cd226KO (
Cd226∆CD4)小鼠在CD4 CD226的作用进行调查+T细胞的病理过程,基于“增大化现实”技术,我们发现
Cd226∆CD4老鼠表现出无显著差异OVA-specific IgE水平相比,血清
Cd226fl / fl老鼠。然而,总IgE水平明显下降时暴露于卵子挑战(图
3(一个))。此外,小鼠CD4 CD226的条件删除+T细胞有着相似的表型
Cd226fl / fl老鼠CREC厚度和肺部炎症的AR过程(数据
3 (b)和
3 (c))。随后,我们评估的绝对数量和频率鼻Th2细胞,确定为CD4+CCR4+CCR6−细胞(
31日]。我们发现CD4+T特异性CD226缺没有影响鼻Th2细胞的增加引起的卵巢(图
3 (d))。
CD226在CD4+基于“增大化现实”技术开发中T细胞起有限的作用。(一)血清的IgE水平和OVA-specific IgE使用ELISA检测(
n
=
8
)。(b, c)代表他的图片和量化彩色鼻子和肺部分(
n
=
9
)。(b)
规模
酒吧
=
50
μm和(c)
规模
酒吧
=
One hundred.
μm。(d)代表图像,绝对数量,鼻Th2细胞(CD4的频率+CCR4+CCR6−)使用FCM检测(
n
=
3
)。基于“增大化现实”技术:过敏性鼻炎;卵:卵白蛋白;IgE:免疫球蛋白E;ELISA:酶联免疫吸附试验,
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
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0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。
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3.4。CD226在AR是鼻粘膜ILC2s调节
由于基于“增大化现实”技术的特点是2型炎症反应,CD226函数OVA-exposed鼻粘膜ILC2s调查。lineage-negative人口,ILC2s可以使用流式细胞仪检测通过lineage-specific标记排除其他淋巴细胞,包括T、B、NK, NKT和髓细胞。此外,ILC2s表达微分的细胞表面分子,包括抑制tumorigenesis-2 (ST2,也称为IL-33受体),IL-2R (CD25) IL-7R (CD127) Thy-1, CD127,诱导T细胞costimulatory(这个理事会)和杀手lectin-like受体G1 (KLRG1)。
如图
4(一)ILC2s(林−CD45+ST2+KLRG1+)从小鼠鼻粘膜孤立使用之前报道的控制策略
29日]。盖茨都是基于FMO或同形像控制设置。我们进一步测量了CD226表达水平的孤立ILC2s控制老鼠,敏化和挑战生理盐水和卵子。CD226在静息状态ILC2s高度表达。卵子挑战进一步诱导CD226表达式,证明了显著升高的比例CD226-expressing ILC2s AR组(图
4 (b))和更高的基因表达CD226的鼻粘膜(图
4 (c))。
CD226在鼻粘膜ILC2s诱导。(一)控制策略确定ILC2s(林−CD45+ST2+KLRG1+)。(b) CD226表情孤立ILC2s鼻粘膜的控制和使用FCM分析基于“增大化现实”技术的老鼠。(c) CD226表达式控制和鼻粘膜的基于“增大化现实”技术的使用qPCR老鼠试验(
n
=
4
)。老鼠敏化对卵子和挑战卵子定期;对照组小鼠致敏和挑战只有盐水。基于“增大化现实”技术:过敏性鼻炎;卵:卵白蛋白;NS:生理盐水;ILC2s: 2型先天淋巴细胞;FCM:流式细胞术;qPCR:定量实时聚合酶链反应;WT:野生型; KO: knockout;
∗
P
<
0.05
。
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3.5。CD226缺陷降低了ILC2比例的鼻粘膜
ILC2s招募鼻粘膜,ILC2s的比例与基于“增大化现实”技术的严重程度显著增加。FCM分析表明ILC2s AR组的比例明显高于NS组。相比之下,CD226缺乏显著下降的比例相比,鼻粘膜ILC2s WT老鼠(图
5(一个))。此外,双重免疫荧光染色Thy-1 ST2是用来检测的ILC2s鼻粘膜组织。结果同样表明,大量的ILC2s OVA-administered组明显高于NS组
Cd226KO显著减毒的免疫反应性Thy-1和ST2 WT老鼠与AR(图
5 (b))。的比例IL-5+和IL-13+ILC2s显示在这些卵子治疗后两组无显著差异(数字
5 (c)和
5 (d))。
CD226缺乏减少的比例ILC2在AR鼻腔粘膜。(a)单核细胞是从WT的鼻粘膜和孤立的
Cd226KO小鼠。ILC2s的比例(林−CD45+ST2+KLRG1+林)−CD45+细胞(
n
=
3
)。(b)代表图像的免疫荧光染色和ST2 Thy-1抗体。ILC2s积极ST2和Thy-1染色。白色的箭头代表ILC2s。每个实验重复三次独立。
规模
酒吧
=
25
μm。(c, d) (c) IL-5的比例+和(d) IL-13+细胞ILC2s (
n
=
3
)。基于“增大化现实”技术:过敏性鼻炎;卵:卵白蛋白;NS:生理盐水;ILC2s: 2型先天淋巴细胞;WT:野生型;柯:淘汰赛。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
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0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。
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3.6。类型两个相关基因的表达减少CD226 KO小鼠鼻粘膜的基于“增大化现实”技术
ILC2函数主要是与2型细胞因子的生产和相关基因,如
Il4,
Il5,
使用Il13,
Il33,
Gata3。中两个相关基因的mRNA水平类型从WT和鼻粘膜组织
Cd226KO小鼠,有或没有卵子挑战,使用qPCR检测。如图
6,
Il5和
使用Il13含量显著增加小鼠OVA-induced AR与NS组;在基于“增大化现实”技术的老鼠,CD226缺陷明显减少
Il5和
Il33水平相比WT老鼠(图
6)。虽然没有显著改变观察其他基因,他们都显示各组之间类似的倾向。这些结果表明,敲门
Cd226改善AR部分的过敏反应,因为减少了两个相关基因表达类型。
信使rna的表达水平使用qPCR小鼠鼻粘膜。(a)的表达水平
Il4,(b)
Il5,(c)
使用Il13,(d)
Il33,(e)
Gata3鼻粘膜(
n
=
3
在NS组;
n
=
5
在卵巢组)。所有数据代表
的意思是
±
扫描电镜
。基于“增大化现实”技术:过敏性鼻炎;卵:卵白蛋白;NS:生理盐水。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
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0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。
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4所示。讨论
过敏性呼吸道疾病,如哮喘和基于“增大化现实”技术,特点是Th2炎症(
1,
2,
5]。ILC2s是一个新发现,先天免疫系统的重要Th2细胞类型。ILC2s主要分布在粘膜组织,如肺、肠、皮肤、脂肪组织(
32,
33]。ILC2s不表达抗原受体;然而,类似于Th2细胞,它们产生2型细胞因子,包括il - 4、IL-5, IL-9, IL-13,当暴露于epithelium-derived细胞因子,如IL-33 IL-25,胸腺基质淋巴细胞生成素(
33- - - - - -
35]。2型细胞因子从而启动B细胞的分化为浆细胞产生抗原IgE,随后增加血管通透性,脱颗粒的肥大细胞,嗜碱粒细胞浸润,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞。
无论是人类还是鼠标ILC2s表达谱系标记;尽管如此,ILC2s在正常生理状态表达表面分子,如CD45 Thy-1, c - kit, mhc ii。激活ILC2s可以在高水平表达KLRG1和ST2根据他们的组织位置和活动状态(
36,
37]。AR ILC2s仍不确定的角色,以及它们在变应性疾病中的作用应该阐明理解过敏反应和免疫系统之间的关系
33]。
在这项研究中,我们首次显示,costimulatory CD226分子影响的病理生理学和发展基于“增大化现实”技术在一个小鼠模型。AR鼻症状,杯状细胞的数量,鼻粘膜炎症评分和肺,和OVA-specific IgE的血清
Cd226KO组显著低于WT组。虽然全球
Cd226缺乏改善过敏症状和气道炎症,CD4的症状没有显著改善+T特异性
Cd226KO小鼠。因此,我们推测CD226可能起到至关重要的作用在调节当地居民ILC2s(肺部和鼻腔组织),哪个驱动器先天2型炎症,从而影响基于“增大化现实”技术的进展。
越来越多的证据表明,免疫分子检查站ILC2s是过敏性疾病的潜在治疗靶点
38]。在这项研究中,我们发现costimulatory CD226分子可以作为一个积极的监管机构的ILC2s过敏性炎症。卵子管理明显增加CD226表情ILC2s鼻粘膜的老鼠。CD226损失显著降低的比例ILC2s和缓解ILC2-driven局部组织炎症的发生。th2型细胞因子的表达水平
Il4,
Il5,
使用Il13和ILC2-related基因,
Il33和
Gata3鼻粘膜的AR组明显高于NS组;CD226亏损逆转这种趋势。这些发现表明,CD226的损失的Th2细胞介导炎症反应减轻ILC2s主导的基于“增大化现实”技术,这可能帮助发展的基于“增大化现实”技术的新治疗药物。
然而,由于
Cd226全身敲除小鼠CD4细胞+T特异性
Cd226KO小鼠主要应用在这项研究中,直接证据表明的影响ILC2-derived CD226 AR的发病机理仍缺乏。为了进一步澄清ILC2s的功能,适当的动物模型,如ILC2过继转移和ILC2-specific基因敲除小鼠,是必要的。例如,Helou等人收养体外培养的人类ILC2s转让
Rag2−−/
Il2rg−−/老鼠,其次是PD-1兴奋剂管理,研究人类ILC2s PD-1的作用[
39];霍华德
et al。排序从IL-33-treated ILC2s PD-1基因敲除小鼠和把它们转入
Rag2−−/
Il2rg−−/老鼠评估ILC2s PD-1函数(
40]。此外,努斯鲍姆
et al。生成的记者老鼠Red5 (IL-5 recombinase-expressing探测器,R5) [
41),和R5 / +老鼠已经被广泛用于构造ILC2-specific基因缺失模型(
42,
43]。因此,进一步的研究是必要的,以确定在ILC2s CD226的内在作用。
此外,CD226及其配体nectin-2 (CD112)表达在肥大细胞,嗜酸性粒细胞和其他过敏的主要效应细胞的过程。研究表明,CD226加强与Fc
εRI在肥大细胞,其接触增加脱粒通过途径涉及菲英岛、LAT和PLC
γ(
44,
45]。我们的研究结果中观察到全球
Cd226KO小鼠和CD4+T特异性
Cd226KO小鼠;然而,我们不排除可能性,CD226在其他免疫细胞可能发挥关键作用的过敏反应。