1。介绍
Zika病毒(ZIKV)是黄病毒首次探测到在乌干达和Zika病毒命名的森林。它在1947年首次被发现在恒河猴和人类在1952年
1 ,
2 ]。病毒的传播主要是依赖蚊子和已经确认发生在全球49个国家或地区(
3 ]。人早期ZIKV感染后通常出现轻度发烧像在登革热感染,而一系列的条件和后期的不良症状(
4 ]。案例分析表明,ZIKV感染可能会导致格林-巴利综合征(GBS) (
5 ),先天性Zika病毒综合征(cz)和葡萄膜炎
6 ,
7 )、脊髓炎和脑膜脑炎(
8 ,
9 头小畸型,(
10 ),和其他大脑相关疾病。ZIKV已经检测到尿液中,血清,孕妇的羊水,胎儿的大脑头小畸型(
11 ,
12 ]。是证实ZIKV流行病的爆发后,多个发热病例皮疹孕妇与ZIKV报告有关,这表明,病毒可以穿过胎盘屏障,并感染新生儿脑组织(
13 ]。
在哺乳动物细胞自噬是一种古老的自食现象,有许多对先天免疫的影响。它影响炎症通过监管与免疫信号相互作用[
14 ]。自噬还介导免疫反应的多个方面,涉及直接消化和降解细胞内病原体的
15 ),因此在战斗中发挥着重要作用,病毒和调解他们的消除
16 ]。除了先天免疫,自噬坐标与适应性免疫宿主抗病毒反应(
17 ]。因此,免疫系统将自噬作为一个监控病原体入侵的证据和细胞转换和效应器机制清除细胞内病原体(
18 ]。然而,干扰病毒与溶酶体融合形成自噬体或病毒感染(期间是一把双刃剑
19 - - - - - -
22 ]。先前的研究表明,ZIKV感染能引起细胞自噬在人类脐静脉(HUVEC)和人类的滋养层细胞,和ZIKV-induced抑制自噬抑制病毒复制
23 ,
24 ]。ZIKV感染也导致有丝分裂异常和凋亡细胞死亡在人类神经祖细胞(
25 ]。先前的报告显示炎症自噬作为一种抗病毒先天防御机制对ZIKV感染中扮演重要角色在病毒感染的控制
26 ]。
探讨自噬是否可能抵消ZIKV感染的治疗目标(
27 ),我们使用ZIKV-infected小鼠和细胞模型来研究自噬在病毒吞噬作用,扮演的角色是否间隙、宿主免疫力的抗病毒免疫反应。我们发现自噬保护老鼠或细胞通过I型干扰素信号,严重感染和操纵的自噬在体外和体内都可以帮助对ZIKV感染宿主免疫力。总之,我们的研究结果显示新见解机制激活宿主免疫反应和自噬相关参与主机保护和防御ZIKV感染。
2。材料和方法
2.1。鼠标
SJL老鼠从查尔斯河购买在北京,中国。C57BL / 6 j小鼠从追逐雷买在广州,中国。老鼠一直和饲养在动物设施的广州医科大学。老鼠感染ZIKV (
1
×
10
6 空斑形成单位/鼠标)通过尾静脉注射怀孕的第七天,和新生儿出生后小鼠牺牲脑组织组织学研究和其他程序。后脑、中脑和前脑切除了均化或在10%福尔马林固定。这项研究是由广州医科大学实验动物伦理委员会批准。
2.2。细胞培养
RAW264.7细胞,BV2细胞,维洛细胞从写明ATCC购得。所有的细胞系的基因型是验证,和细胞支原体自由。RAW264.7细胞和BV2细胞维持RPMI 1640中10%的新生牛血清和100 U /毫升penicillin-streptomycin (P / S)抗生素有限公司5%<年代ub>2孵化器。维洛细胞培养在一个中等(DMEM)补充新生牛血清P / S和10%在37°C公司为5%<年代ub>2。雷帕霉素和3-MA从Selleck购买。ZIKV感染之前,细胞治疗与雷帕霉素为3小时,12小时3-MA分别。SiRNA击倒和CRISPR淘汰赛进行以下制造商的指令(ATG7 SiRNA, sc - 41448、ATG5 SiRNA sc - 41446, IFNAR1核,sc - 40090, IFNAR2 sc - 40092, sc - 40092, IFNGR1 CRISPR质粒,sc - 401191, IFNGR2核,sc - 35635, IL10R2核,sc - 75332, IFNLR1核,和sc - 62498)。
2.3。ZIKV菌株
ZIKV应变MR766(恒河/ 1947 /乌干达)和PRVABC59慷慨提供的避世傅哈佛大学博士。我们孤立ZIKV于中山/ 2016株从一个人的尿液从委内瑞拉到中国2016年3月,放大后C6/36细胞或乳儿老鼠的大脑intracerebroventricular注入。整个基因组的系统发育分析表明,这种ZIKV应变密切相关,巴西等南美隔离和属于亚洲血统,而不是非洲血统(
28 ]。ZIKV股传播州立细胞接种的莫伊0.02,在96 h postinfection和上层的收获。
2.4。空斑形成单位分析
在病毒效价测定和空斑实验,维洛细胞接种在6-well 10板的密度<年代up>6/好前一天的实验。在野生型ZIKV滴定和空斑实验,野生型的滴定ZIKV是由一个空斑实验遵循前面描述的过程与少量修改(48)。简单地说,维洛细胞被播种在12-well板和用于感染细胞融合增长到100%。吞噬作用试验、1 h后感染巨噬细胞与磷酸盐(PBS)洗一次,细胞溶解;至于吞噬试验,1 h感染被认为是短期治疗后巨噬细胞,吞噬作用的是作为一个主要的过程。1 h后感染,漂浮的病毒在细胞表面和外被移除,PBS的细胞被洗了,新的媒介改变了。另一个11 h后,细胞不会吞噬细胞,只有消化内化病毒。因此,在感染后12 h,幸存下来的病毒被认为是失败的间隙,和空斑形成单位分析适用于间隙在我们的模型的能力。然后,巨噬细胞收集和适度使用研磨棒身体细胞溶解。为组织病毒负担,新鲜的大脑组织收集和磨适度。 The lysates were diluted by PBS with 10<年代up>1,10<年代up>2,10<年代up>3,10<年代up>4,10<年代up>5,分别。维洛细胞感染上述溶菌产物包括活病毒1 h 37°C孵化器提供5%的股份有限公司<年代ub>2。这些细胞被覆盖agarose-DMEM含有0.6%牛血清白蛋白(BSA)和1%的低熔点琼脂糖。板块的内容是解决4°C 10分钟直到琼脂糖介质成为固体,然后培养颠倒在37°C孵化器为5 - 7天。病毒滴度测定通过计算可见斑块。数据显示为
意味着
±
SD
从三个独立的实验
28 ]。
2.5。细胞转染
核细胞转染与Atg5携带RNA;英杰公司)或使用Lipofectamine 2000 Atg7 siRNA试剂(英杰公司)在无血清RPMI 1640中遵循制造商的指示。
该串联GFP-LC3质粒和获得Tamotsu Yoshimori大阪大学的日本。细胞生长在玻璃底菜和串联GFP-LC3质粒转染24 h使用Lipofectamine 2000试剂(表达载体)血清RPMI 1640中(热费希尔科学)制造商的指示。后发出荧光观察,不同的感染,这些细胞被固定在4%多聚甲醛。随机选择100细胞在每组数可见LC3 GFP点比较自噬发生。数据显示为代表的抓取的图像(
15 ,
29日 ]。
2.6。西方墨点法
兔多克隆抗体对地图LC3b,兔子对beclin-1山羊多克隆抗体,单克隆抗体GAPDH是从Proteintech买的。样品从细胞或组织细胞溶解和量化。溶菌产物被煮5分钟然后分开10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)。蛋白质被转移到硝化纤维膜电泳,然后屏蔽膜2 h后5%脱脂奶阻断缓冲区。膜是孵化与第一抗体遵循制造商的指示。洗涤三次,洗的解决方案后,膜与二次抗体孵化。信号使用一种增强化学发光检测可视化工具包。
2.7。共焦显微镜和间接免疫荧光染色
发出荧光观察感染后,组织固定在4%多聚甲醛,然后切片进行组织学分析。组织与0.2% permeabilized Triton x - 100在PBS。与阻断缓冲区阻塞后30分钟,组织与初级抗体在孵化1:500稀释阻断缓冲区和孵化过夜。Zika病毒信封(E)的主要抗体蛋白(D1-4G2-4-15)抗体从Kerafast购买波士顿,MA。在37°C孵化器孵化为1.5 h后,组织部分被洗了三次洗涤缓冲和孵化与适当fluorophore-conjugated二级抗体。最后,部分被清洗和准备免疫荧光观察如前所述[
30. ]。这些照片是被LSM 510元共焦显微镜。
2.8。组织学分析
组织在10%福尔马林固定24小时,然后处理苏木精和伊红染色())。使用普通光学显微镜观察细胞。组织学分析并执行一个特殊的病理学家根据单盲法原则。
2.9。生物信息学分析之间的关系正信号通路和ZIKV感染
GSEA(基因集富集分析)被用来分析GSE97919数据集(
https://http: / / www.ncbi.nlm 。
http://nih.gov/geo )找到途径ZIKV感染后或相关差异基因。基因网络的交互距离干扰素-
α 负调节自噬途径,积极调节自噬进行了计算,并与有效的强相互作用的基因通路筛选中根据相关通路之间的基因网络的拓扑特征(中间性中央分布、谐波亲密中央分布)。通路之间的互动率计算得到干扰素-
α 主导性互动途径。
2.10。统计分析
所有实验进行了一式三份,至少重复三次。数据分析软件6.0和作为GraphPad棱镜
意味着
±
SD
。组意味着由单向方差分析比较。时接受重大的差异
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
,
∗
∗
∗
p
<
0.001
。
3所示。结果
3.1。ZIKV感染诱发免疫细胞浸润在SJL老鼠
评估是否感染ZIKV能引起严重的免疫反应,SJL老鼠七天怀孕被用于尾静脉注射ZIKV菌株不同。当老鼠出生第一天,我们在大脑中检测到病毒负担乳儿鼠标和发现所有新生儿老鼠感染不同ZIKV污点(图
1(一) )。接下来,我们使用了ZIKV MR766应变是一种常用的病毒株在以下实验。我们石蜡包埋,切片前脑、中脑和后脑进行组织学分析。ZIKV感染似乎诱导组织损伤(萎缩、炎症像炎症细胞浸润)在老鼠大脑,但没有观察到三种不同的领域严重的形态变化是使用箭头(图表示
1 (b) )。我们选择后脑组织和分段为疣状分析嗜中性粒细胞,巨噬细胞、NK细胞和树突细胞。与正常组相比,所有这些先天免疫细胞被证明是累积感染组和巨噬细胞最明显(数据的积累
1 (c) 和
1 (d) )。我们的研究结果表明,产妇ZIKV感染可以引起免疫细胞在大脑中积累的杂交后代,尽管我们不确定是否这些是居民或浸润细胞。
图1
(一)ZIKV-infected怀孕与不同菌株在小鼠模型
1
×
10
6
每老鼠微升。病毒空斑形成单位负担在新生儿老鼠被发现使用分析出生后第一天。
N
=
12
、数据表示为
意味着
±
SD
,
∗
∗
∗
p
<
0.005
。(b)前脑、中脑和后脑组织的新生儿感染小鼠ZIKV-MR766分段)染色。箭头表明形态学变化。
规模
酒吧
=
One hundred.
μ
米
。(c)后脑组织切片作为与CD11b疣状,上面Ly6G和其他不同的抗体检测免疫细胞招聘或渗透在新生儿老鼠。
规模
酒吧
=
20.
μ
米
。数据显示为代表从12老鼠。(d)统计结果积累的免疫细胞在每一个愿景。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.2。新生儿ZIKV感染小鼠的进展
探索最严重的病理变化的时间点在ZIKV感染,我们直接静脉注射病毒的新生儿老鼠,这些老鼠通常易受病毒感染由于他们的不成熟的免疫系统。在三天postinfection (DPI),空斑形成单位化验显示,感染水平见顶,最大的病理变化是观察,显示增加colocalization Iba1和ZIKV subventricular区(SVZ)和吻侧迁移流(RMS)(图
2(一个) )。先天免疫系统的第一道防御病毒或细菌感染。先天免疫的细胞和分子会迅速被激活,遇到危险信号,导致炎症。因此,我们主要集中在先天免疫细胞,特别是巨噬细胞和嗜中性粒细胞。我们发现巨噬细胞和中性粒细胞与入侵ZIKV,这是由大脑组织中免疫染色(数字
2 (b) 和
2 (c) )。我们的研究结果表明,吞噬细胞可能在ZIKV感染起到至关重要的作用
在活的有机体内 。
图2
吞噬细胞与ZIKV与大脑。(a)的发展ZIKV新生儿感染小鼠与时间有关的方式。Iba1和ZIKV被免疫荧光检测。空斑形成单位化验是由病毒效价实验。
规模
酒吧
=
20.
μ
米
。(b)后脑组织被切割为疣状3 DPI与CD11b Ly6G,和ZIKV包膜蛋白抗体,分别。(c) Colocalization的细胞(黄色)在整个全景场计算和比较,分别。
规模
酒吧
=
2
毫米
。数据是代表三个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.3。ZIKV感染诱发体内自噬<斜体> < /斜体>
我们之前发现自噬清除入侵的细菌在宿主免疫力致病性感染中起着基础性作用[
15 ,
29日 ]。在这里,我们把疣的后脑ZIKV e蛋白质,LC3, p62, LAMP1抗体。ZIKV红色荧光的染料,绿色荧光染料LC3的特定染料,p62, LAMP1。Microtubule-associated蛋白质1 a / b光链3 (LC3)在自噬是一种标记蛋白膜,p62选择性自噬的基质(
28 ],lysosomal-associated膜蛋白1 (LAMP-1)属于一个家庭lysosome-associated膜糖蛋白,可用于分析自噬的过程中,自噬体与溶酶体的融合(
29日 ]。自噬蛋白的colocalization (LC3, p62,和LAMP1 puncta)与ZIKV E-proteins表明ZIKV-infected细胞自噬的发生(图
3(一个) )。与正常组相比,ZIKV他分布在整个后脑组织,和高的病毒呈阳性的细胞表明ZIKV身上有很强的传染性(数据的能力
3(一个) 和
3 (b) )。自噬的诱导特性主要体现在两个方面。autophagy-related的快速合成蛋白质,快速和大规模发现自噬小体的形成。后发现ZIKV感染可以引起LC3dots
在活的有机体内 进一步,我们试图确定变化的自噬体的形成在ZIKV感染。
图3
(a, b)后脑组织应用了ZIKV e蛋白质,LC3, p62, LAMP1抗体。三个实验的数据代表,表示为
意味着
+
SD
。
规模
酒吧
=
20.
μ m。单向方差分析(图基的事后),
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
,
∗
∗
∗
p
<
0.005
。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.4。ZIKV感染导致高架自噬体形成体外<斜体> < /斜体>
自噬小体有两个特征:一是双层膜,另一个是细胞质组件,如线粒体、内质网碎片。吞噬体是一个single-membrane泡(SMV),自噬小体是一个双层膜囊泡(DMV)。透射电子显微镜(TEM)显示了明显的自噬小体的积累与双膜(图
4(一) )。与未经处理的RAW264.7细胞相比,自噬小体被发现在ZIKV-infected细胞增加;同样,雷帕霉素也积极的控制显著增加自噬小体的形成。此外,ZIKV诱导自噬体的形成是被3-MA负控制(数字
4(一) 和
4 (b) )。因此,从形态学证据,我们可以进一步证明ZIKV感染诱导自噬的过程和结果与上述结果一致显示LC3标点符号(数字的招聘
4(一) 和
4 (b) )。我们的发现与之前的研究一致,证实的colocalization病毒和病毒复制复合体(凹入囊泡)
31日 ,
32 ),虽然我们不知道ZIKV能否在自噬体复制。
图4
ZIKV感染导致增加自噬小体的形成
在体外 。(一)RAW264.7细胞感染ZIKV 1小时(
莫伊
=
10
:
1
)。在感染之前,细胞也接受雷帕霉素和3-MA;雷帕霉素在3
μ M(12小时),3-MA曾在3毫米(3 h)。感染后,细胞被TEM加工和检查。1 - 4的区域扩大,SMV代表吞噬体,DMV表明自噬小体,我们推测,副总裁(形成形态和大小)可能代表病毒粒子。
规模
酒吧
=
2
μ
米
。(b)自噬小体的数量和每个细胞的吞噬体数,分别在每个样本100个细胞。数据是代表三个实验也得到了类似的结果。(c, d)进行免疫印迹检测LC3的过渡ZIKV感染RAW264.7细胞。单向方差分析;图基posthoc测试,
∗
p
<
0.05
。(e) RAW264.7和BV2感染ZIKV 1小时(MOI = 10: 1)。感染之前,细胞也用雷帕霉素治疗或3-MA如上所述。(f)可见LC3-GFP puncta在每个单元格。值从100个细胞/样品。
米
e
一个
n
年代
±
年代
D
。单向方差分析;图基的事后考验,
∗
p
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
此外,我们决定LC3传输使用西方墨点法和发现LC3-II显著增加在自噬细胞或ZIKV感染与上述结果一致(数字
4 (c) 和
4 (d) )。虽然LC3转换发生,没有明显的差异p62 ZIKV感染,这意味着退化过程和泛素化仍将持续之后(图
4 (c) )。此外,LC3-I的变换LC3-II在3-MA-treated抑制细胞在ZIKV感染(数字
4 (c) 和
4 (d) )。之前的一份报告表明,ZIKV与严重的神经发育障碍(
33 ]。进一步确定ZIKV感染可以诱导自噬
在体外 ,我们使用另一种类型的神经胶质细胞,BV2,执行LC3标点符号使用疣状。使用雷帕霉素作为自噬激活或积极的控制和3-MA自噬抑制剂或消极的控制,分别时,我们发现,与对照组相比,ZIKV感染LC3标点符号如图所示增加了共焦显微镜图像(数字
4 (e) 和
4 (f) )。形态学和分子数据表明ZIKV诱发自噬
在体外 。
3.5。在巨噬细胞自噬调节ZIKV间隙
一些研究表明,自噬是一种重要的防御机制清除胞内病原菌(
34 ]。众所周知,Atg5和Atg7是自噬的关键
30. ]。所以,发生在Atg5——或者Atg7-deficient细胞自噬是困难的。我们发现自噬被削弱Atg5 siRNA -和Atg7 siRNA-treated细胞ZIKV感染(数据
5(一个) - - - - - -
5 (c) )。接下来,我们试图发现自噬是否扮演了一个角色在巨噬细胞吞噬作用或间隙感染ZIKV。RAW264.7细胞使用雷帕霉素或3-MA,那么感染ZIKV 1小时。我们发现吞噬作用通过计算入侵病毒数量用PFU化验。ZIKV被数的增加在雷帕霉素治疗组,在细胞内的病毒数量减少3-MA-treated组(图
5 (d) 左面板)。12小时后我们发现病毒的数量,发现细胞内病毒数量增加3-MA-treated组,因为自噬被这意味着间隙能力被抑制(图
5 (d) 右面板)。然后我们操纵自噬(Atg5 siRNA或Atg7 siRNA),发现吞噬病毒减少autophagy-deficient细胞(图
5 (e) )。此外,巨噬细胞的清除能力对ZIKV感染也抑制(图
5 (e) )。这些数据表明,诱导自噬增强宿主免疫力抵抗病原体。综上所述,我们的数据确定,ZIKV-induced吞噬细胞的自噬起到了至关重要的作用加速病毒吞噬和清除。
图5
在RAW264.7细胞自噬促进ZIKV间隙。(一)Raw264.7细胞转染和ctrl核或Atg7 Atg5 siRNAs。执行中存在可拆卸的效率测试。
意味着
+
SD
一式三份。
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
。(b)细胞被感染ZIKV 1小时,(
莫伊
=
10
:
1
)。也感染之前,细胞转染LC3-GFP和接受Atg5 siRNA Atg7核。疣状进行检测LC3 puncta。(c) Puncta数量在每个细胞数。值是
意味着
±
SD
来自20个细胞/样品。单向方差分析;图基的事后考验,
∗
p
<
0.05
。(d) RAW264.7细胞感染ZIKV 1小时(
莫伊
=
10
:
1
)。在感染之前,细胞也接受雷帕霉素和3-MA;使用雷帕霉素(3
μ 米,12个小时);使用3-MA(3毫米,3小时)。内化的数量1 h感染后病毒/细胞被微升的分析计算。游离病毒感染后12 h,冲走,新鲜培养基补充道。的间隙进行分析计算内在病毒/细胞通过空斑形成单位的数量分析。(e)感染之前,RAW264.7细胞处理消极控制核,Atg5 siRNA, Atg7核。内化病毒/细胞的数量计算。数据代表三个实验结果。
意味着
±
SD
。单向方差分析;图基的事后考验,
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.6。I型干扰素参与自噬在ZIKV感染免疫
I型干扰素(IFN)信号对病毒感染中起着特别重要的作用。它主要是通过细胞表面模式识别受体,使细胞产生抗病毒蛋白。通过GSEA ZIKV芯片的分析,我们发现ZIKV感染后,干扰素-
α 信号通路显著富集(名义
p
值= 0,
罗斯福
=
0.0159
)(补充表
1 ),以及70年IFN -
α 通路基因显著调节(数字
6(一) 和
6 (b) )。此外,ZIKV感染和干扰素-
α 途径激活有显著正相关的趋势
浓缩
分数
=
0.9344
(图
6(一) )。然而,ZIKV感染后,胞内受体调节自噬的平衡中扮演更重要的角色免疫力。通过分析疾病的途径相互作用,我们发现ZIKV感染后,有1825对有效干扰素-基因之间的相互作用
α 自噬通路和积极的监管,有效的
交互
率
=
43
%(图
6 (c) )。与此同时,干扰素-之间的有效互动率
α 途径和消极的调节自噬为30%(补充表
2 )。因此,有一个占主导地位的干扰素-之间的交互
α 途径和积极的调节自噬。干扰素-后
α 通路被激活时,它能有效地激活和促进自噬(
35 ]。我们相信ZIKV感染后,干扰素-
α 信号通路强烈激活与自噬有正相关趋势。接下来,我们进一步探索和发现ZIKV-induced RAW264.7细胞的自噬被接受IFNAR1 siRNA和IFNAR2 siRNA如图所示增加LC3标点的配给,但不是在细胞治疗IFNGR1 CRISPR-Cas9, IFNGR2核,显示IFNLR1 siRNA和IL10R2 siRNA组无显著差异(数字
6 (d) - - - - - -
6 (f) )。综上所述,我们的研究结果发现,ZIKV侵染诱导I型干扰素信号与自噬相关。
图6
(a) GSE97919 Zika病毒数据集。GSEA(基因集富集分析)显示之间存在着正相关ZIKV感染和干扰素-
α 途径激活。
浓缩
分数
=
0.9344
。(b)不同的基因丰富干扰素-
α 激活ZIKV感染,以及70年IFN -
α 通路基因调节。(c)之间的交互分析干扰素-
α 通路,负调节自噬,积极调节自噬。(d)与IFNAR1 siRNA RAW264.7细胞转染,IFNAR2核,IFNGR1 CRISPR-Cas9, IFNGR2核,IFNLR1核,或IL10R2 siRNA,分别。测试执行中存在击倒或敲除效率。上面(e)细胞培养和转染LC3-GFP,然后ZIKV感染,
莫伊
=
10
:
1
。使用共焦显微镜观察LC3发出荧光。(f) LC3 puncta数字在每个样本被数的100个细胞。
意味着
±
SD
。数据代表三个实验结果。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.7。吞噬细胞有助于体内自噬对ZIKV间隙感染<斜体> < /斜体>
已经证实,巨噬细胞对ZIKV发挥了重要作用,我们进一步确定自噬影响巨噬细胞的功能的操作
在活的有机体内 。我们发现rapamycin-treated老鼠ZIKV分布较低,与对照组相比,虽然3-MA负面作用调解ZIKV感染(数字
7(一) 和
7 (b) )。与雷帕霉素或3-MA小鼠与正常小鼠相比没有明显的行为差异。同样,ZIKV的积累,F4/80-positive细胞在rapamycin-treated显著增加小鼠ZIKV感染(数据
7(一) 和
7 (b) )。接下来,我们试图发现巨噬细胞是否可以帮助ZIKV的易位。使用ZIKV和ZIKV-infected RAW264.7细胞感染小鼠时间的方式,我们发现最严重病变postinfection 3天,观察感染最严重的时间点之前(数字
7 (c) - - - - - -
7 (e) )。这些数据再次证明了ZIKV感染巨噬细胞产生了重要的影响;采用巨噬细胞
在活的有机体内 加速ZIKV的传播,有利于宿主防御。我们相信,巨噬细胞的可动性可以帮助ZIKV的传播。自噬,巨噬细胞在免疫反应中起着平衡的作用对ZIKV感染。
图7
吞噬细胞促进自噬对ZIKV间隙感染
在活的有机体内 。(一)新生儿老鼠服用雷帕霉素(3毫克/公斤)和3-MA(3毫克/公斤),然后与ZIKV皮下注射。然后,老鼠被牺牲和脑组织切片免疫染色与ZIKV e蛋白质和F4/80抗体。(b) ZIKV和F4/80阳性细胞数在每个视野。(c)新生儿老鼠感染ZIKV或ZIKV-infected RAW264.7细胞,分别。感染后三天,老鼠被牺牲和脑组织切片免疫染色与ZIKV e蛋白质和F4/80抗体。
规模
酒吧
=
20.
μ
米
。(d) ZIKV F4/80-positive细胞数。(e)的病毒数量大脑使用空斑形成单位统计分析。
意味着
±
SD
。单向方差分析;图基的事后考验,
∗
p
<
0.05
。数据从三个代表每个实验的老鼠。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
4所示。讨论
自噬是一个复杂和严格监管细胞的溶酶体降解途径负责长寿蛋白质,细胞细胞器,部分细胞溶质和参与对抗病毒感染的重要防御机制。据报道,自噬在黄病毒感染(扮演着重要的角色
36 - - - - - -
39 ]。然而,生物学和ZIKV的发病机理还需要进一步探索。
科学家已经证明,ZIKV能够感染人类皮肤成纤维细胞和多能干细胞——(hPSC)派生的神经祖细胞(npc)
在体外 ,诱导凋亡细胞死亡(
39 ,
40 ]。ZIKV可以穿过胎盘膜造成小头通过针对皮质祖细胞凋亡和自噬
41 ]。ZIKV感染人类后滋养层(施),LC3转换从可溶性形式LC3-I lipidated形式LC3-II显著增加6小时和12小时postinfection [
42 ]。ZIKV-infected胎盘在5天postinfection显示高表达LC3 p62下降,自噬途径的基质降解自噬(负相关
42 ]表明ZIKV感染诱发规范自噬的回应。
黄病毒,包括ZIKV诱导内陷vesicle-designated ER导致集群的囊泡包或双层膜囊泡(汽车登记处),这与病毒基因组复制(
43 - - - - - -
46 ]。一种蛋白激酶磷酸化在Thr308 Ser473其完整的激酶活性,需要和Akt-mediated mTOR磷酸化Ser2448对自噬(至关重要
47 ]。ZIKV非结构化(NS) 4 a和NS4B抑制mTOR / Akt信号通路通过减少一种蛋白激酶磷酸化Thr308和Ser473并激活自噬(
48 ]。进一步研究表明,维持正常的体内平衡,与ZIKV感染细胞调节reticulophagy呃,一种选择性自噬导致分裂的ER和随后的溶酶体降解但精确的信号通路,占选择性自噬的诱导是目前还不清楚
49 ]。此外,蚊子的唾液可以调节宿主炎症免疫反应(
50 ),和蚊子唾液蛋白促进Zika病毒传播自噬的激活宿主免疫细胞的单核细胞谱系
51 ]。此外,BPI折叠包含家庭B成员3 (BPIFB3)作为管理者积极的自噬调节ZIKV感染和促进病毒复制的形成(
52 ]。因为病毒细胞内病原体,自噬是一个定义的抗病毒反应部分是由营养和STING-mediated信号(
53 ]。和果蝇表明昆虫能够利用自噬在神经组织应对ZIKV [
26 ]。
ZIKV诱发一个天生的抗病毒反应。I型、II型和III型干扰素对抗ZIKV感染
。 toll样受体3 (TLR3)发挥抗病毒作用对ZIKV-induced天生的抗病毒反应主要人类皮肤成纤维细胞(
40 ];TLR3表达的抑制导致一个强大的病毒RNA拷贝数增加48 h,让人联想到TLR3相关通路的激活自噬。同时,我们发现与i型干扰素抗病毒感染的影响;然而,由于条件有限,未使用转基因小鼠繁殖干扰素-
α R2结合体淘汰赛的两倍。经典的自噬相关涉及基因的胞内信号通路,Atg5 / Atg7,在我们的实验中得到了证实。I型干扰素信号被激活,使宿主抗ZIKV入侵。但是自噬是否病毒的一个重要组成部分间隙很少报道。我们的研究提供了新的见解ZIKV-induced自噬的机制可以加速病毒传播和间隙
在活的有机体内 和
在体外 。有趣的是,病毒负担的胎盘Atg16L1-deficient小鼠感染ZIKV相比WT控制降低了10倍。ZIKV感染诱发自噬
在活的有机体内 ,而失去Atg16l1表达式会损害ZIKV的宫内传播[
42 ]。在先前的研究中,三个化合物包括奎纳克林(QC),甲氟喹(MQ)和GSK369796高anti-DENV活动DENV2复制子的分析抗病毒活动中存在和显示抗病毒活性迅速崛起ZIKV [
54 ]。
综上所述,在巨噬细胞自噬是ZIKV早期感染的一个重要组成部分。一方面,巨噬细胞能吞噬病毒;另一方面,巨噬细胞的活动也有助于病毒的传播。自噬,巨噬细胞在免疫反应中起着平衡的作用对ZIKV感染。,自噬是像一个广泛的吞噬作用。病毒和吞噬细胞经常玩游戏。一旦平衡被打破,最终的结果将是极端的现象。完全清除病毒或病毒入侵,导致更严重的疾病。这些现象在先天免疫的过程中并不罕见。然而,引发了一系列的先天免疫防御之间的交互自噬和ZIKV感染还没有彻底研究。 As ZIKV has seriously damaged global public health and because of the lack of effective treatment, further study is required for the mechanism about how ZIKV is involved in autophagy which reveals the role of autophagy in immunity to help develop and design effective therapeutic drugs to control viral infections and treat diseases.