精氨酸(Arg)是一种semiessential氨基酸和一些生理功能。N-Carbamylglutamate (NCG)可以促进内源性合成参数在哺乳动物。然而,Arg的角色或NCG肝脏炎症和细胞凋亡在乳儿羊羔遭受宫内生长受限(IUGR)仍不清楚。当前工作的目的是研究饮食的影响参数和NCG炎症和肝细胞凋亡在IUGR乳儿的小羊。48新生儿出生后7天,胡从432年一群羊羔被选双胞胎羊羔。Normal-birthweight和IUGR胡锦涛羊羔被随机分配(
孕产妇营养不良与宫内生长迟缓(IUGR),这是不利于生存、生长,代谢和后代的长期表现在各种动物
孕产妇营养精氨酸(L-Arg) semiessential氨基酸,其前体N-carbamylglutamate (NCG)怀孕期间可以减轻IUGR-metabolic中断在绵羊的胎儿
然而,L-Arg或NCG的早期营养对肝的影响炎症和细胞凋亡在IUGR羊羔仍不清楚。因此,本研究旨在调查L-Arg和NCG的膳食补充剂的影响肝细胞炎症和细胞凋亡在IUGR乳儿的小羊。
所有试验进行依法批准的动物保护指南的护理和使用实验动物由扬州大学的伦理委员会(SXXY 2015 - 0054)。
羊羔被认为与正常体重(NBW)或IUGR羊羔基于他们出生时的体重。羔羊的出生体重接近平均出生体重(±0.5 SD)被确定为NBW羔羊,而羊羔至少1.5 SD低出生体重被定义为IUGR [ 最后一天的实验中,羔羊是用戊巴比妥钠麻醉(15毫克/公斤体重)在屠宰之前。血液样本被收集到EDTA-containing管、离心3000× 血浆样品分析为天冬氨酸转氨酶(AST,猫。C010-3)、丙氨酸转氨酶(ALT,猫。C009-3)、碱性磷酸酶(高山,猫。A059-1)、白蛋白(铝青铜,A028-1)和总蛋白(T-Pro,猫。A045-3)使用商业ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国)和分光光度计(v - 5600年,中国上海)按照制造商的指示。
使用商业套装和BioTek协同HT标仪(美国BioTek乐器,Winooski VT)的波长450 nm,促炎细胞因子包括白介素1 的活动caspase-3 (KGA203) caspase-8 (KGA303)和caspase-9 (KGA403)使用比色法测定试剂盒(凯基生物生物技术。有限公司、南京、中国)。肝脏(约0.1克)受到了均化和裂解裂解缓冲使用50毫升冷。随后,细胞溶解产物被澄清的离心5分钟10000 g 5分钟在4°C。收集后,50毫升整除的上层清液进行分析,按照制造商的指示。
10%的肝匀浆的离心10分钟2000 g,紧随其后的是15分钟的上层清液离心转移在10000 g。之后,获得的颗粒是resuspended,紧随其后的是溶解使用冷裂解缓冲(1.5毫升)根据比色法来估计细胞色素C使用Nanodrop (WFJ 2100年,尤尼克公司仪器有限公司,上海,中国。另外,校准曲线也建立了使用牛细胞色素C如前所述[ 冰冻的肝脏(0.5 g)受到同质化到20毫升的缓冲(包括0.05 Na 冲洗的新鲜肝脏收集磷酸盐(PBS, pH值7.4),切成小块,用不锈钢300目过滤。此外,肝脏扩散指数确定使用PI染色溶液(Triton x - 100年补充0.25%,0.5%碘化propidium,和10毫克毫升 羊肝切片deparaffinized(4毫米厚),其次是40分钟的蛋白酶K治疗(50毫克/毫升,凯基生物生物技术。有限公司、南京、中国)在37°C。然后,部分与PBS清洗三次,和凋亡细胞的DNA片段测定使用TUNEL技术按照商业检测设备指令(KGA7032凯基生物生物技术。有限公司、南京、中国)。简而言之,所有的部分都遭受到60分钟的孵化工作强度末端转移酶(TdT)溶液混合digoxigenin-deoxyuridine三磷酸(dUTP)和TdT 37°C;之后,部分与PBS清洗三次,紧随其后的是30分钟的孵化streptavidin-horseradish过氧化物酶(合)37°C。之后,部分与PBS洗了三遍,TUNEL-positive细胞被diaminobenzidine认可,其次是苏木精复染色。积极的和消极的控制每个案件。然后,一个标准的显微镜是用来查看标本,和10个大功率领域(高通滤波器,×400)随机选择2观察者测量总TUNEL-positive细胞计数。数据呈现的形式TUNEL-positive细胞计数/字段如前所述[ 总RNA提取试剂盒试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示。然后,rt - pcr进行如前所述[ 总蛋白提取,决心如前所述浓度( SPSS16.0软件(美国SPSS,芝加哥,IL)是用于统计分析。单向方差分析(方差分析)是利用测量统计治疗之间的差异。图基采用事后考验的多重比较。的差异
最后体重、肝重、肝DNA浓度,protein-to-DNA率和增殖指数较低(
羊羔IUGR组增加了高山,AST、ALT、铝青铜,T-Pro相比与反对羊羔(表
血浆肿瘤坏死因子-
肝脏的IUGR羊羔与增强有关(
相比之下,反对羊羔,MyD88;il - 6;TLR-9;il - 1
bcl - 2蛋白表达在肝脏IUGR羊羔是表达下调的价格相比CON羊羔(图
这个研究来解决增长的变化,促炎细胞因子,肝脏炎症反应、细胞凋亡与L-Arg或NCG IUGR吮吸羊羔补充。一般来说,IUGR羊羔显示增长,破坏反应肝脏炎性细胞因子,信使rna和蛋白质选定的炎症和凋亡基因的表达。膳食补充L-Arg和NCG缓解不利影响L-Arg和NCG之间没有显著差异。本研究的结果显示最后的BW,减少肝脏重量,肝DNA浓度,protein-to-DNA比率,增殖指数与肝脏凋亡细胞数量减少IUGR乳儿羊羔相比NBW羊羔和L-Arg或NCG IUGR羊羔补充。类似的观察(例如,受损的增长率和肝脏重量)在IUGR大鼠模型,观察猪,和羔羊
以往的研究强调了L-Arg对肝细胞凋亡的保护作用[
肝脏酶(AST、Alt和高山)、白蛋白、总蛋白和显著升高IUGR乳儿羊羔,但这个高度是减轻喂养L-Arg或NCG IUGR的小羊。血清AST活性、ALT和高山被公认为肝功能的重要指标。AST是分布在细胞质和线粒体而ALT仅分布在细胞质中,流通,因此,这两个酶的释放意味着肝细胞的损害。高山水平增加血清与肝损伤的功能造成肝脏胆汁淤积以及破坏肝细胞的膜。类似的观察已报告在低出生体重的小猪
综上所述,我们的研究结果强调了IUGR-induced高度循环的促炎细胞因子以及肝mRNA的表达各自的基因。同时,IUGR外在凋亡通路的激活增加了肝细胞凋亡。膳食补充剂L-Arg或NCG IUGR羊羔减少促炎细胞因子的水平,抑制凋亡通路,这样就避免了IUGR-induced肝细胞的凋亡。我们的发现可能对控制肝细胞凋亡在IUGR羊羔,从而维护肝脏健康和改善生长性能。
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所有的作者都接受责任的全部内容提交手稿提交和批准。
作者声明没有竞争的经济利益。
这项研究是支持由中国国家自然科学基金资助(批准号31902180),该研究项目的江苏省自然科学基金(BK20170488)、中国博士后科学基金会(2017 m610358),苏贝特殊科技基金会(SZ-HA 2017008),和扬州大学科技创新基金会(2017 CXJ 081)。