1。介绍
Lipotoxicity通常定义为有害的脂质浓度增加,导致细胞功能障碍和组织功能的破坏。不同的游离脂肪酸类已知引起毒性作用和炎症在许多细胞类型(
1 ]。Lipotoxicity可能出现在多个靶器官通过触发炎症通路直接影响和间接影响的改变肠道微生物群与内毒素(
2 ]。Lipotoxicity起着关键作用的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发病机制及肾脏疾病(
3 ,
4 ]。非酒精性脂肪肝炎、非酒精性脂肪肝的一种高级形式,可能发展为肝硬化,是由lipid-mediated毒性和炎症反应(
3 ]。细胞内脂质积聚在非酒精性脂肪肝的结果增加脂肪酸吸收,增加脂肪从头合成,降低脂肪酸氧化酯化紧随其后的三酰甘油(TG)合成。脂肪生成控制主要在转录水平。固醇调节元件结合蛋白1 c (SREBP-1c)和碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)被描述为增加脂肪从头合成的主要转录因子在非酒精性脂肪肝
5 ]。Glycerol-3-phosphate酰基转移酶(GPAT)催化酯化的脂肪酸生成lysophosphatidic酸Glycerol-3-phosphate是TG病原反应酶的合成,及其基因表达激活SREBP-1c [
5 ]。
高水平的血浆脂质可能导致肾脂质积累,一代的活性氧(ROS),系膜扩张,肾小球硬化症和发展[
4 ]。许多研究表明,转化生长因子
β (TGF -
β )在肾纤维化的发病机制中起着重要的作用,是一个重要的早期肾纤维化的标志。TGF -
β 施加profibrotic活动通过刺激纤维母细胞增殖和epithelial-mesenchymal过渡(EMT)。增加了TGF -
β 通过刺激系膜细胞产生刺激肾小球ECM积聚I型,III, IV胶原蛋白;层粘连蛋白;纤连蛋白和通过阻断矩阵退化(
6 ]。
的花朵
桂花 和
菊花 作为民间常用药品和添加剂对茶,饮料,在台湾和食物。
o .桂花 花(也称为Kwai-fah中文)被用来缓解疼痛、咳嗽、腹痛、腹泻、肝炎在中国传统医学(中医)。各种化合物已经被隔绝
o .桂花 花,包括类黄酮、酚酸酪氨酰乙酸,phillygenin, ligustroside, verbascoside [
7 - - - - - -
9 ]。
o .桂花 花提取及其生物活性成分抗炎,抗氧化剂,和神经保护活动,减轻糖尿病病理条件和衰减acetaminophen-induced肝毒性(
9 - - - - - -
11 ]。
菊花 花(也称为Ju-hua中文)已经使用中医药物治疗感冒,眼花,头晕,和皮肤瘙痒。这朵花也被广泛用作食品补充剂,或草药茶,和许多消费者被认为是健康的食物
12 ]。有几个品种
其总黄酮 花出现在台湾的草药市场;“台湾挂居”通常是用作草药茶或饮料。
其总黄酮 花含有许多酚类化合物如类黄酮、咖啡酸衍生物,hydroxycinnamoylquinic酸和三萜化合物(
12 ]。我们之前的研究表明,选择性酚醛塑料,包括绿原酸、槲皮素、杨梅酮,和咖啡酸甲醇提取物的识别
其总黄酮 和
o .桂花 花(
7 ]。
其总黄酮 花提取物及其组件还具有多种生物学特性,如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗艾滋病病毒、抗诱变剂的,抗癌,抗衰老的活动(
12 ,
13 ]。此外,polyphenol-rich
其总黄酮 提取物改善高脂/药物引起的脂肪肝小鼠口服喂乳状液含10%胆固醇、猪油20%,0.2%丙基硫氧嘧啶(
14 ]。丙基硫氧嘧啶是导致肝损伤和急性肝衰竭
15 ]。
尽管许多已知的花中提取的生物功能
o .桂花 和
其总黄酮 ,有限的信息可以在对肝和肾lipotoxicity FFA-induced的影响。在这项研究中,我们研究了提取物的效果
o .桂花 和
其总黄酮 花在lipotoxicity FFA-overloaded肝细胞(人类HepG2细胞)和肾肾小球系膜细胞(老鼠SV40-Mes13细胞)。
2。材料和方法
2.1。材料
HepG2细胞(BCRC RM60025;人类肝胚细胞瘤细胞系),THP-1细胞(BCRC 60430;人类单核细胞的细胞株),系膜SV40-Mes13细胞(BCRC 60366;小鼠肾小球系膜细胞线)从生物资源收集和研究中心,获得台湾新竹。HepG2细胞在DMEM培养/高葡萄糖(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫,Gibco),不必要的氨基酸(Gibco) 1%, 1% L-glutamin (Gibco),和1%的青霉素和链霉素(Gibco)。单核细胞的THP-1细胞被维护在RPMI 1640 (Gibco)补充10% heat-inactivated青霉素、链霉素的边后卫(Gibco)和1% (Gibco)。系膜细胞在DMEM /低葡萄糖/ F12培养基培养(Gibco)补充5%的边后卫(Gibco)和1%青霉素和链霉素(Gibco)。这些细胞系在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2 。
BSA (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)解决方案(10%)准备使用磷酸盐(PBS, pH值7.2)。所有游离脂肪酸(远期运费协议)从Sigma-Aldrich购买。FFA-bovine血清白蛋白(FFA / BSA)复杂的解决方案准备报道之前(
16 ]。FFA / BSA或油酸(OA) / BSA通过0.22 sterile-filtered复杂的解决方案
μ m(微孔S.A.S.无菌过滤器,Molsheim, France) and then stored at −20°C until use.
2.2。准备花提取物
的花朵
桂花 和
菊花 (台湾挂Ju)分别从大连实德,收集新台北,Tongluo,苗栗、台湾。凭证标本保存在人类发展和家庭研究,国立台湾师范大学。植物的凭证标本Po-Jung蔡博士的身份验证。风干的花朵被磨成粉,与十卷的甲醇提取两次。过滤了的蒸发和集中的方式在45°C真空获得methanolic花提取的
o .桂花 (的)和methanolic花提取的
其总黄酮 (厘米)。分别的收益率和厘米25和24%(基于干和地面植物材料)的重量。然后厘米再溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;春之谷RDH化工有限公司美国CA) 200毫克/毫升的股票连续实验的解决方案。
2.3。的影响和CM的脂质沉积,炎症反应在HepG2细胞
2.3.1。FFA-Treated HepG2细胞和细胞生存能力的确定
模仿脂质暴露在体内雌性条件、FFA混合物被用来诱导lipotoxicity HepG2细胞如前所报道林et al。
17 ]。股票的解决方案的50 mM FFA混合物由棕榈酸、油酸、亚油酸、亚油酸、花生四烯酸(在40的比例:25:15:15:5)准备在培养基含有1% BSA (
16 ,
17 ]。HepG2细胞(5×104 细胞/文化)在96孔培养板和24 h后接受各种浓度的或厘米表示。细胞生存能力是决定使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑试验(MTT)。麻省理工的解决方案(Sigma-Aldrich;100年
μ L, 0.5毫克/毫升)被添加到每个在37°C和孵化3 h。反应终止了与500年取代MTT-containing介质
μ L (DMSO,甲瓒盐溶解了温柔的摇晃在室温下约5分钟。每个油井的光学密度(OD)以550海里使用标(Tecan、Mannedorf、瑞士)。每个试验完成后一式三份水井,每个实验重复三次。
2.3.2。测定细胞内脂质含量HepG2细胞
HepG2细胞(5×104 细胞/文化)在96孔培养板24 h。细胞培养另一个24小时的表示的浓度和CM或0.1% DMSO(车辆细胞)在1毫米远期运费协议/ BSA的存在。控制细胞孵化1% BSA孤单。总细胞内脂质含量是评价油红O染色。简而言之,这些细胞被固定在4%多聚甲醛在PBS 1 h,沾油红O (Sigma-Aldrich) 1 h在室温下,然后用ddH冲洗2 O几次删除多余的污渍。在100年彻底清洗和干燥
μ L异丙醇的添加到每个10分钟的混合物被孵化,紧随其后的是温柔的振动释放油红o .提取解决方案然后转移到另一个96孔板测量OD在510 nm的标仪(美国内华达州BioTek)。
2.3.3。测定细胞胆固醇和三酰甘油的内容
HepG2细胞(1×106 细胞/)培养6-well文化板块和24 h后仅1毫米远期运费协议/ BSA治疗(如车辆细胞)或结合各种浓度的CM 24 h。从每个被除了收获的细胞裂解缓冲,洛瑞的蛋白质和细胞蛋白质进行评估的测定(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。总胆固醇(TC)和总三酰甘油(TG)的内容完整的细胞溶解产物测定的比色测定试剂盒(草毒死,Crumlin,安特里姆,英国)。它们的质量在HepG2细胞计算和归一化细胞总蛋白质含量。
2.3.4。的影响和mRNA水平厘米SREBP-1c和GPAT FFA / BSA-Treated HepG2细胞
HepG2细胞(1×106 细胞/)培养6-well文化板块和24 h后独自处理远期运费协议/ BSA(车辆细胞)或结合不同的浓度和厘米。24小时孵化后,HepG2细胞收集和使用试剂盒从细胞总RNA提取试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和互补DNA(互补)是来自2
μ 克总RNA,益生元(dT)引物和1
μ L逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。实时pcr进行在一个iCycler智商实时检测系统(美国Bio-Rad大力神,CA)使用智商™SYBR绿色Supermix (Bio-Rad)。PCR产物的相对量分析iQ5光学系统软件,更小。2.1。如表所示
1 引物序列SREBP-1c和GPAT被用于这项研究。每个样本的信使核糖核酸(mRNA)水平对每个基因是规范化的glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) mRNA。褶皱表达式定义为褶皱增加相对于控制细胞。
表1
用于定量PCR引物对的列表。
底漆
序列(5
′
到3
′
)
产品长度(bp)
结合位点
SREBP-1 向前
CGG AGA AGC TGC CTA柠檬酸交流
379年
外显子5
SREBP-1 反向
GTC GGT CAG TGT CTC CAC CT
外显子7
GPAT 向前
AGT GAG棉酚TGG GGT GAG TG
300年
外显子3和4
GPAT 反向
CAG柠檬酸猫TGG TGG CAA交流
外显子6
IL-1β 向前
CAC ATG GGA TAA注册会计师GGC TT
147年
外显子5
IL-1β 反向
TTG TTG CTC猫ATC CTG移行细胞癌
外显子5
il - 6 向前
CTC AGC有条件现金援助GAG AAA GGA GA
310年
外显子2和3
il - 6 反向
CAG GGG TGG TTA TTG猫TCT
外显子5
引发 向前
GTG CAG TTT TGC CAA GGA GT
195年
外显子2
引发 反向
CTC TGC ACC CAG TTT苑TT
外显子3
TNF-α 向前
CAC TAA棉酚TTC AAA CTG GGG C
165年
外显子4
TNF-α 反向
GAG棉酚GGC CTA gg苑交流
外显子4
TGF-β 向前
GGG ATC CAC CTG CAA GA
420年
外显子1
TGF-β 反向
CAC GTG CTG CTC CAC TTT助教
外显子2
GAPDH 向前
AAA GGA苑GGC GTC TTC ACC ACC行动
206年
外显子5
GAPDH 反向
棉酚TTC GTC ATG手枪广汽GGC CAG总部
外显子7
2.3.5。测量活性氧的生产
探针2,7-dichlorofluorescein二乙酸(H2 DCF-DA;Sigma-Aldrich)是用于监测细胞内ROS生成。HepG2细胞(5×104 细胞/)被播种在96孔板在DMEM培养基24 h。细胞培养另一个24小时的表示的浓度或厘米或0.1% DMSO(车辆细胞)在1毫米远期运费协议/ BSA的存在。控制细胞孵化与1% BSA在1毫米远期运费协议/ BSA的缺失。孵化后,细胞用PBS和孵化10
μ M H2 DCF-DA在37°C 2 h。的形成氧化荧光衍生二氯荧光素(DCF)在475 nm兴奋和525海里排放监测使用协同™HT多模标仪(美国内华达州BioTek)。所有程序都在黑暗中进行。
2.3.6。促炎细胞因子mRNA水平测定条件Medium-Treated HepG2细胞
条件培养基的制备,THP-1细胞治疗与0.5
μ g / mL脂多糖(LPS) (Sigma-Aldrich) 24小时;媒介是收集和离心去除细胞碎片。文化上层清液源自THP-1单核细胞被称为THP-1 /有限合伙人/媒体(张力腿平台/厘米)和存储条件−20°C到使用。HepG2细胞在DMEM最初保持10%的边后卫。RPMI 1640中然后逐渐增加取代DMEM和细胞融合时经常通过实现。后来,HepG2细胞生长在RPMI 1640后续实验中补充10%的边后卫。HepG2细胞(1×106 细胞/)被播种在6厘米盘无血清RPMI 1640中。HepG2细胞培养在RPMI 1640介质(如控制细胞)和50%张力腿平台/厘米细胞(如车辆)和coincubated 400
μ 克/毫升的50%张力腿平台的存在或厘米/厘米。收集48 h后孵化,HepG2细胞总RNA提取细胞使用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和互补DNA(互补)是来自2
μ 克总RNA,益生元(dT)引物和1
μ L逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。引物序列被用于这项研究(表
1 )。实时PCR分析进行如上所述。
2.4。油酸的影响和厘米段Lipotoxicity在肾肾小球系膜细胞
2.4.1。OA-Treated系膜SV40-Mes13细胞和细胞生存能力的确定
Mishra和西蒙森(
18 发现治疗的200年
μ M油酸/ BSA诱导myofibroblast-like表型在系膜细胞中,这是一个肾纤维化的影响。所以,我们用同样的方法检查可能nephroprotective性质和厘米。股票的解决方案的50 mM OA / BSA也准备如前所述[
16 ]。
系膜细胞SV40-Mes13 (1×104 细胞/)被播种在96孔板24小时然后growth-arrested FBS-free介质的另一个24小时。系膜细胞在DMEM / F12培养基培养包含200
μ M OA / BSA和coincubated与不同浓度的或厘米(50,100年和200年
μ g / mL) 48 h。车辆细胞孵化与0.1% DMSO OA / BSA的存在。控制细胞孵化1% BSA孤单。细胞生存能力是由Alamar蓝试验(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。
2.4.2。在系膜细胞细胞内脂质含量测定
系膜细胞SV40-Mes13 (3×105 细胞/)被播种在板材6-well 24 h,然后growth-arrested FBS-free介质的另一个24小时。细胞治疗OA / BSA (200
μ 米)单独或结合不同浓度或厘米12 h。系膜细胞的细胞内脂质含量也评估了油红O染色如上所述。
2.4.3。测定细胞胆固醇和三酰甘油含量系膜细胞
系膜细胞SV40-Mes13 (3×105 细胞/)被播种在6-well板24小时然后growth-arrested FBS-free介质的另一个24小时。细胞治疗OA / BSA (200
μ 米)单独或结合不同浓度和CM的12 h。收集完整的细胞溶解产物。TC和TG在系膜细胞的内容也测量了如上所述。
2.4.4。测量蛋白质含量TGF -β<斜体> < /斜体>和纤连蛋白
系膜细胞被播种在3×104 细胞/在24-well盘子的DMEM / F12培养基的5%的边后卫。Subconfluent系膜细胞是由静止治疗前血清剥夺为24小时。细胞治疗OA / BSA (200
μ 米)单独或结合不同浓度或厘米6 h孵化(TGF -的决心
β )和24 h孵化(纤连蛋白的测定)。浮在表面的游离收集,TGF -的浓度
β 、纤粘连蛋白在上层清液使用商业TGF -量化
β 酶联免疫试剂盒(Bender MedSystems GmbH,维也纳,奥地利)和纤连蛋白的酶联免疫试剂盒(Assaypro,温菲尔德,密苏里州,美国),之后,分别从制造商的协议。
2.4.5。免疫荧光染色
系膜细胞SV40-Mes13 (2×104 细胞/)被播种到8-well Lab-Tek二室的幻灯片(NUNC,罗彻斯特,纽约)。血清饥饿后,细胞治疗OA / BSA (200
μ 200米)单独或结合
μ 克/毫升或厘米。24小时孵化后,系膜细胞被洗冷PBS,固定与丙酮/甲醇(1/1;
v /
v ),然后染色。1 h与3% BSA在PBS阻塞后0.1% Triton x - 100 (PBST),细胞被孵化的主要抗体(兔子anti-mouse纤连蛋白抗体,Epitomics, CA,伯林盖姆,美国)一夜之间,用PBS洗净、孵化与DyLight 488 -共轭二次抗体(美国杰克逊ImmunoResearch西树林,PA) 2 h。幻灯片是安装87%甘油和成像使用DeltaVision®核心live-cell显微镜(美国WA应用精密Inc .)。
2.4.6。纤连蛋白mRNA水平的定量rt - pcr分析
系膜细胞SV40-Mes13 (1×106 细胞/在6厘米)被播种盘24 h孵化。血清饥饿后,细胞治疗OA / BSA (200
μ 米)单独或结合各种浓度的或厘米。24小时孵化后,细胞细胞溶解试剂盒中的试剂(表达载体)和总RNA是孤立的。然后,分析了RNA rt - pcr如前所述。纤连蛋白的上游和下游PCR引物设计为5
′
gct柠檬酸TGC公司治理文化标签ATG条t - 3
′
和5
′
-GTG TGG攻击力广汽GGT AGA三大总部
′
,分别。在这个实验中,基因的
β 肌动蛋白被选为参考。上游和下游的序列PCR引物
β 肌动蛋白5
′
gga CTC CTA TGT GGG TGA CG-3
′
和5
′
结论CTC猫GTC GTC CCA GT-3
′
,分别。这些引物对扩增99 bp纤连蛋白cDNA片段和片段的102个基点
β 肌动蛋白cDNA,分别。纤连蛋白mRNA水平是标准化的
β 肌动蛋白mRNA。褶皱表达式定义为褶皱增加相对于控制细胞。
2.5。统计分析
提出了所有数据的平均值±标准偏差(SD)。统计分析采用SPSS 23.0统计软件包(美国芝加哥,IL)。学生的
t 以及单向方差分析和邓肯的多重比较测试被用来比较差异。一个
p
< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。在脂质积累的抑制作用和CM FFA / BSA-Treated HepG2细胞
肝细胞模型来研究肝脂肪变性
在体外 建立了与远期运费协议把人类HepG2细胞。在此,我们使用不同比例的混合物饱和和不饱和远期运费协议被林等。
17 )检查antilipotoxic和厘米的效果。确定或厘米HepG2细胞的治疗有明显的毒性作用,细胞HepG2细胞治疗的可行性与不同浓度的远期运费协议的存在或厘米/ BSA(1毫米)确定。结果表明,24小时后,治疗或在浓度高达200厘米
μ g / mL没有明显导致细胞死亡对控制细胞(图
1(一) )。因此,25 - 100的浓度
μ g / mL和CM被用于后续的实验。
图1
的影响和CM的脂质积累在自由脂肪酸acid-overloaded HepG2细胞。HepG2细胞孵化与1毫米远期运费协议/ BSA和不同浓度的cotreated厘米24 h。车辆细胞孵化0.1% DMSO在远期运费协议/ BSA的存在。控制细胞孵化BSA为1%。细胞MTT试验测定可行性(a)。定量分析细胞内脂质沉积的OD500海里 值使用油红O染色(b)。细胞内甘油三酯(c)和胆固醇(d)内容在细胞溶解产物的酶比色法测定使用商用设备。控制细胞的总胆固醇和TG水平分别为25.3±7.1,28.7±2.7
μ 分别g /毫克的细胞蛋白质。数据提出了三个独立实验的平均数±标准差。值不共享通用标明显不同(
p
<
0.05
)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
如图
1 (b) ,减毒FFA和厘米/ BSA-induced HepG2细胞胞内脂质沉积。接下来,我们调查是否两个提取物抑制细胞内TG和胆固醇的积累。和CM治疗显著降低FFA / BSA-induced细胞(图三酰甘油积累
1 (c) )。治疗(100
μ g / mL)显著降低胆固醇含量,减少的CM治疗尚不具备统计学意义(图
1 (d) )。
因为提取物具有明显抑制作用的脂质积累,我们试图发现的分子目标(s)和CM lipogenesis-related基因。如图
2 ,显著地抑制治疗或厘米的mRNA表达SREBP-1c和GPAT比赋形治疗。
图2
的影响和CM lipogenesis-related基因的mRNA表达。实时rt - pcr分析固醇调节元件结合蛋白1 (
SREBP-1c )(a)和glycerol-3-phosphate酰基转移酶(
GPAT )(b)的mRNA水平1 mM FFA / BSA-treated HepG2细胞。所有数据被规范化
GAPDH 信使rna,褶皱的变化表达式计算相对于控制细胞(1% BSA)处理。每个实验独立执行三次。数据均值±SD。值不共享通用标明显不同(
p
<
0.05
)。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.2。的抑制作用和CM FFA / BSA-Induced HepG2细胞的活性氧产量
过量的活性氧积累起着决定性作用的各种lipotoxic紊乱。治疗24小时后,车辆细胞表现出显著增加活性氧积累以DCF荧光,而coincubation HepG2细胞或厘米(25和100年
μ g / mL)导致明显降低与汽车相比细胞,这表明antilipotoxicity效应的提取也与其抗氧化相关属性(图
3 )。
图3
的影响和CM FFA-induced ROS生产。HepG2细胞孵化与1毫米远期运费协议/ BSA的24小时的存在或厘米。车辆细胞孵化0.1% DMSO在远期运费协议/ BSA的存在。控制细胞孵化BSA为1%。细胞内ROS生产使用荧光探针DCFDA量化。数据提出了三个独立实验的平均数±标准差。值不共享通用标明显不同(
p
<
0.05
)。
![]()
3.3。的抑制作用和CM条件Medium-Induced促炎细胞因子表达HepG2细胞
除了在肝细胞甘油三酯积累,慢性肝脏炎症还与非酒精性脂肪肝的发病机制密切相关。自激活单核细胞/巨噬细胞释放多种促炎介质导致诱导炎症。在这项研究中,的条件培养基LPS-stimulated THP-1单核细胞(张力腿平台/厘米)被用来在HepG2细胞诱导炎症反应。治疗与张力腿平台/ CM和cotreatment的张力腿平台/厘米或厘米(200年和400年
μ g / mL)没有明显影响细胞的生存对控制细胞(图
4(一) )。所以,400的浓度
μ g / mL被用于后续的实验来检验两个提取物的抗炎活性。以确定的影响和CM的mRNA的促炎细胞因子的表达,HepG2细胞治疗与提取的张力腿平台/厘米。如数据所示
4 (b) ,
4 (c) ,
4 (d) ,
4 (e) ,
4 (f) ,基因的mRNA表达编码促炎细胞因子TNF -
α 、il - 6、引发、il - 1
β ,TGF -
β 治疗后显著增加张力腿平台/厘米。或厘米治疗减少这些炎性细胞因子mRNA的表达。
图4
和CM抑制促炎细胞因子mRNA表达诱导的条件培养基源自LPS-stimulated THP-1细胞(张力腿平台/厘米)。细胞MTT试验测定可行性(a) mRNA水平的il - 1的实时rt - pcr分析
β (b)、il - 6 (c),引发(d)、肿瘤坏死因子-
α (e)和TGF -
β (f)与RPMI HepG2细胞培养介质(控制单元)和50%的张力腿平台/ CM(车辆细胞)或coincubated 400
μ 克/毫升或厘米50%张力腿平台/厘米。所有数据被规范化GAPDH mRNA,褶皱表达式计算相对于控制细胞的变化。每个实验独立执行三次。数据均值±SD。#
p
<
0.05
与控制细胞;
∗
p
<
0.05
与载体的细胞。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.4。和CM降低胆固醇和三酰甘油含量OA / BSA-Treated系膜细胞
对系膜细胞的细胞毒性和CM是评估,表明两种提取物浓度的50,100年或200年
μ g / mL并不影响细胞的生存能力(图
5(一个) )。因此,这些浓度的提取都是用于进一步的研究。如图
5 (b) ,并在100年和200年的浓度厘米
μ g / mL显著减毒OA / BSA-induced在系膜细胞胞内脂质沉积。此外,(50、100和200
μ g / mL)明显降低TG和胆固醇含量,而厘米也表现出显著的抑制效应对TG和胆固醇积累但只在200年
μ g / mL和更少的程度(数字
5 (c) 和
5 (d) )。
图5
的影响和CM的脂质沉积在油酸(OA)刺激系膜SV40-Mes13细胞。系膜细胞与200年孵化
μ M OA / BSA和不同浓度的cotreated厘米12 h。车辆细胞孵化与0.1% DMSO OA / BSA的存在。控制细胞孵化BSA为1%。细胞生存能力是衡量Alamar蓝试验(a)。定量分析细胞内脂质沉积的OD500海里 值使用油红O染色(b)。细胞内甘油三酯(c)和胆固醇(d)内容在细胞溶解产物的酶比色法测定使用商用设备。控制细胞的总胆固醇和TG含量分别为9.8±0.1,7.5±0.2
μ 分别g / mg细胞蛋白质。数据提出了三个独立实验的平均数±标准差。值不共享通用标明显不同(
p
<
0.05
)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.5。的影响和CM TGF -β<斜体> < /斜体>和纤连蛋白水平在OA / BSA-Treated系膜细胞
考虑到已知TGF - - -的重要性
β 感应的矩阵生产系膜细胞在肾小球硬化,我们检查的抑制作用和CM OA / BSA-induced TGF -
β 分泌。如图
6(一) ,提取显著降低TGF -
β 的水平。免疫荧光染色显示增加纤连蛋白的存在在OA / BSA-treated系膜细胞。系膜细胞的治疗或厘米(200
μ g / mL)抑制纤连蛋白水平比车辆治疗(图
6 (b) )。因此,两种提取物对纤连蛋白的蛋白质水平的影响评估。如图
6 (c) ,当系膜细胞治疗OA / BSA,纤连蛋白浮在表面的蛋白质水平显著升高。与免疫荧光染色结果一致,同时提取还减少了OA的纤连蛋白诱导的分泌/ BSA(图
6 (c) )。接下来,我们观察到cotreatment或CM导致显著减少纤连蛋白mRNA水平相比治疗OA(图
6 (d) )。这些数据表明,两种提取物抑制油的段间质细胞激活。
图6
的影响和CM TGF -
β 和纤连蛋白表达在油酸(OA)刺激系膜SV40-Mes13细胞。TGF -
β 蛋白水平细胞上清液测定的ELISA方法(a)。观察纤连蛋白沉积的免疫荧光染色(b)。和CM抑制OA-induced纤连蛋白蛋白质水平(c)和(d) mRNA表达。数据提出了三个独立实验的平均数±标准差。值不共享通用标明显不同(
p
<
0.05
)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
4所示。讨论
与先前的研究一致(
17 ),治疗1毫米的远期运费协议引起脂质积累而不是对HepG2细胞毒性细胞(图
1 )。李等人。
19 )报道,甲醇提取的
其总黄酮 3 t3-l1鲜花显著抑制脂质积累脂肪细胞细胞在分化。在目前的研究中,我们观察到和CM有抑制作用的脂质积累在FFA-treated HepG2细胞(数字
1 (b) ,
1 (c) ,
1 (d) )。我们下一个检查是否和厘米可以影响脂质代谢的转录调控SREBP-1c GPAT。SREBP-1c是移植的脂肪生成的转录因子乙酰辅酶a羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶(FAS),促进新创脂肪酸合成导致肝脂肪变性(
20. ]。GPAT催化glycerolipid第一和病原反应一步合成。它有助于TG生物合成和脂滴的形成
21 ]。这两个表达下调和厘米SREBP-1c GPAT基因表达在FFA-overloaded HepG2细胞(图
2 )。崔et al。
14 )报道,polyphenol-rich
其总黄酮 提取预防脂肪肝减少SREBP-1c及其目标基因的表达FAS脂肪/ propylthiouracil-fed老鼠。因此,结果表明,和厘米的降脂效果的差别可能是介导的对这些SREBP-1c GPAT基因表达。值得注意的是,尽管治疗或厘米SREBP-1c的差别导致了一个重要的对这些基因的转录水平(图
2(一个) ),进一步的研究将仍然需要调查是否两个提取物调节蛋白水解处理活动的内质网膜结合SREBP-1c前兆产生其转录活性氨基端形式。
粗甲醇或乙醇提取
o .桂花 花产生抗氧化活性
在体外 (
7 ,
22 ]。ethanolic提取75%
o .桂花 花显示抗氧化活性的减少acetaminophen-fed小鼠肝脂质过氧化作用[
11 ]。的总类黄酮
其总黄酮 逆转脂质过氧化和保护肝脏和肾脏lead-induced小鼠氧化损伤(
23 ]。符合这些先前的研究,和CM拥有抗氧化能力降低FFA-induced ROS生产(图
3 )。
肠道微生物发挥重要作用在正常的肠道功能和健康维护,和饮食成分可以影响微生物殖民的性质(
2 ]。证据表明,高脂肪饮食会影响肠道微生物群组成伴随着提高血浆内毒素水平。这些改变与肝脂肪变性和肥胖有关
24 - - - - - -
26 ]。有限合伙人的循环(内毒素)可以激活NF -
κ B,然后引发炎性信号通路。THP-1细胞应对类似的转录模式外周血单核细胞(PBMC)——派生的巨噬细胞与LPS刺激后
27 ]。LPS刺激后,THP-1细胞分泌增加大量的TNF -
α ,il - 1
β 、il - 6、引发和il - 10
28 ,
29日 ]。因此,我们使用了张力腿平台/ CM-treated HepG2细胞模型来模拟endotoxemia-mediated炎症在这项研究。我们的结果显示,或厘米治疗有效地抑制张力腿平台/ CM-induced mRNA的表达促炎细胞因子,如il - 1
β 、il - 6、引发、TNF -
α ,TGF -
β HepG2细胞(图所示
4 )。我们以前报道,水提取的
o .桂花 和
其总黄酮 还具有抗炎能力减弱LPS-induced一氧化氮(NO)生产原料264.7巨噬细胞(
30. ]。乙醇提取
o .桂花 鲜花可以明显减少促炎介质il - 6的表达水平,引发,没有在LPS-stimulated人类牙周韧带细胞(
31日 ]。的
n 己烷可溶性形式和nonsaponifiable脂质分数
其总黄酮 花提取物及其组件显示显著的抗炎活性对12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate——(TPA)诱导小鼠耳肿胀(
32 ]。和厘米可以王亚南活动结合在一起,通过调节脂肪沉积在肝细胞和调节炎症反应减少肝病的进展。
值得注意的是,和CM治疗显著地抑制TGF -
β 水平感应张力腿平台/厘米。自TGF -
β 抑制剂可能nephroprotective [
33 ),我们接下来检查可能nephroprotective性质和厘米oleate-treated系膜细胞。与肥胖相关的流行glomerulopathy越来越多,包括系膜基质的增加,肾小球基底膜增厚、肾小球硬化症。变化可能是独立的高血压和葡萄糖,或可能会先于他们的出现,可能是由于脂质积累在系膜细胞(
34 ]。和厘米也显示降脂效果的OA / BSA-treated肾肾小球系膜细胞(图
5 )。因此,和CM的TG-lowering效应可能有助于nephroprotective潜力。
Mishra和西蒙森(
18 TGF -]表明,油酸引起分泌物
β ,胶原、纤连蛋白和可以诱导myofibroblast在间质细胞表型。与他们的研究结果一致,200年
μ M OA / BSA TGF -治疗显著升高
β 纤连蛋白蛋白质水平(图
6 )。挂et al。
35 )报道,水提取物
o .桂花 减毒TGF -
β 1-induced细胞间和细胞外的原始人类肺成纤维细胞纤连蛋白和施加antifibrotic活动对肺纤维化。的热水提取
其总黄酮 花对2型糖尿病(被认为是有益的
36 ]。在这项研究中,我们表明,厘米可以扭转TGF -表达的增加
β 和纤连蛋白的沉积增加,分泌high-OA-treated系膜细胞(图
6 )。综上所述,和CM可能有益的天然药物发展的预防或治疗TGF -
β 介导的肝纤维化疾病。除了TGF -
β ,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)也会导致ECM积聚在糖尿病肾病(DN)的发病机制
37 ]。我们的初步数据显示,CM治疗(100、200和400
μ g / mL)显著废除high-glucose-induced MCP-1系膜细胞中蛋白质水平(数据没有显示)。因此,进一步调查的潜在保护作用和CM的DN将在未来的研究。
总之,花中提取的
o .桂花 和
其总黄酮 改善FFA-induced脂质沉积和ROS和具有抗炎活动HepG2细胞。此外,两个提取物抑制脂质积累,归纳TGF -
β 和细胞外基质堆积OA-overloaded小鼠系膜细胞。这些结果说明花中提取的
o .桂花 和
其总黄酮 可能有保护作用在非酒精性脂肪肝炎和肾纤维化。