心肌梗死 炎症介质 1466 - 1861 0962 - 9351 Hindawi 10.1155 / 2017/3028082 3028082 研究文章 香烟烟雾暴露通过TFEB-Mediated自噬抑制细菌造成损伤和产生的吞噬作用的缺陷 http://orcid.org/0000 - 0003 - 2327 - 5747 Pehote 加勒特 1 博达 Manish 1 Brucia 凯瑟琳 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 1976 - 5340 Vij Neeraj 1 2 Gaggar 阿米特 1 医学院的 中央密歇根大学 愉快的山 心肌梗死 美国 cmich.edu 2 儿科和肺药 约翰霍普金斯大学医学院的 巴尔的摩 医学博士 美国 jhu.edu 2017年 28 12 2017年 2017年 12 08年 2017年 03 10 2017年 28 12 2017年 2017年 版权©2017 Garrett Pehote et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

介绍。香烟(CS)接触COPD-emphysema发病机理的主要危险因素。慢性阻塞性肺病的一个共同特征是受损的吞噬作用,导致频繁发作的病人导致发病率增加。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。因此,我们调查如果CS暴露导致自噬缺陷作为减少细菌间隙通过吞噬作用的机制,利用小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞) 铜绿假单胞菌(PA01-GFP)作为实验模型。 方法。短暂,原始细胞治疗与香烟烟雾提取物(CSE),氯喹(自噬抑制剂),TFEB-shRNA,雌性生殖道(异烟肼)-172年之前和/或非瑟酮为功能分析细菌感染。 结果。细菌清除PA01-GFP明显受损而生存被提拔CSE ( p < 0.01 ),自噬抑制( p < 0.05 ; p < 0.01 ),TFEB击倒( p < 0.01 ; p < 0.001 ),抑制雌性生殖道功能( p < 0.001 ; p < 0.01 )与对照组相比明显恢复的autophagy-inducing抗氧化药物,非瑟酮治疗( p < 0.05 ; p < 0.01 ;和 p < 0.001 )。此外,调查其他非瑟酮的药理特性表明,它有大量的黏液溶解的和杀菌活动( p < 0.01 ; p < 0.001 ),需要进一步调查。 结论。我们的数据表明,CS-mediated自噬缺陷作为一个关键机制参与产生的噬菌作用的缺陷,以及autophagy-inducing药物的治疗可能恢复CS-impaired吞噬作用。

 空姐医学研究所 YCSA_082131 1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是慢性炎症,肺气肿,反复出现的慢性感染的航空公司( 1- - - - - - 4]。目前,慢性阻塞性肺病是美国第四大死因,预计到2020年成为全球第三大原因( 1- - - - - - 3, 5]。死亡率增加的原因之一是增加吸烟,这是对COPD发病的主要危险因素之一( 1, 4]。

正如上面提到的,慢性感染是一个主要的贡献者阻塞性肺疾病的恶化和进展。具体来说,下呼吸道的慢性阻塞性肺病患者往往面临着细菌殖民化和病毒感染。最常见的细菌性病原体负责这些感染 链球菌引起的肺炎,nontypeable 流感嗜血杆菌, 铜绿假单胞菌( 2, 3, 6- - - - - - 9] 。这些病原体的存在和产生的感染导致增加炎症,减少肺功能恶化,导致慢性阻塞性肺病的进展和结果增加住院和死亡( 2, 3, 6, 7, 10, 11]。虽然在慢性阻塞性肺病慢性感染的确切原因尚不清楚,有越来越多的集中在设计新疗法改善COPD受试者的发病率随着时间的推移,因为长期抗生素治疗产生耐药性( 2, 7, 12- - - - - - 15]。

宿主防御细菌感染的一个重要方面是高度称为巨噬细胞的吞噬细胞( 3, 7, 10, 16]。这些细胞清除病原体的能力通过吞噬作用削弱肺部感染控制是必要的 3, 7, 11, 16]。因此,吞噬作用是一个必要的细胞过程,承认外国病原体/粒子和删除他们( 3, 7]。我们的初步研究表明,降低COPD气道的慢性感染可能包括肺泡巨噬细胞的吞噬能力的障碍 2, 3, 10]。一个可能的机制减少肺泡巨噬细胞吞噬作用是香烟——(CS)诱导自噬缺陷( 2, 12- - - - - - 14, 17- - - - - - 19]。简单地说,自噬是一个自我平衡的细胞过程,降低错误折叠蛋白质,受损的细胞器,和病原体,可受慢性CS曝光,COPD-emphysema发病机理的主要原因( 1, 12, 14- - - - - - 16, 19- - - - - - 21]。尽管研究表明CS暴露可能损害在巨噬细胞吞噬作用 2, 9, 11),的确切机制仍然未知。因此,在这项研究中,我们旨在调查的具体机制CS损害细菌清除率。我们首先关注评估转录因子的作用EB (TFEB),主自噬调节器,诱发各种自噬/溶酶体生物起源的转录基因根据我们最近的数据显示其重要作用COPD-emphysema发病机理( 15, 19, 22]。

简而言之,这些初步研究表明,CS暴露诱发的本地化TFEB aggresome尸体,与肺功能下降,增加肺气肿在COPD受试者的严重性。( 15]。这一发现让我们评估可能的治疗方法诱导TFEB表达式作为一种诱导自噬的 15]。一种药物,我们追究TFEB感应是一个叫做非瑟酮类黄酮。非瑟酮是一种非处方膳食补充剂,充当抗氧化剂对大脑健康 15, 22, 23]。最近的研究在我们的实验室和其他非瑟酮已被证明诱导TFEB和必然地自噬 15, 18, 19]。

因此,本研究进一步研究慢性阻塞性肺病CS-impaired细菌吞噬作用的机制来解释反复发作的机制和原因。首先,我们验证的致病作用CS-induced自噬缺陷作为减少吞噬作用的机制可能占慢性慢性阻塞性肺病急性加重。我们还发现非瑟酮是有效恢复CS-impaired细菌吞噬作用。此外,非瑟酮还演示了一个额外的治疗潜力作为一个可能的黏液溶解的和杀菌。

 2。材料和方法 2.1。试剂和治疗

小鼠巨噬细胞细胞系,RAW264.7用作 在体外模型探讨香烟烟雾暴露及其对吞噬作用的影响。使用标准细胞培养过程如前所述[ 14]。简单地说,细胞维持在37°C公司的5%2与胎儿增长10%血清DMEM / F12媒体(RMBIO)和1% PS(青霉素和链霉素;英杰公司)。为 在体外香烟烟雾暴露,香烟烟雾提取物(CSE)是由燃烧两到三3 r4f research-grade香烟(肯塔基州列克星敦烟草研究所,大学,肯塔基州)和充气到血清DMEM / F12媒体(20毫升)。0.74的OD(320海里)被认为是100% CSE,和工作CSE浓度调整使用细胞培养媒体。作为一个模型CS-induced RAW264.7细胞自噬抑制,氯喹(30 μ米)是用于预处理的8小时。调查TFEB调节自噬的作用——xenophagy-mediated吞噬作用,TFEB表达式被撞倒在原始细胞通过使转染TFEB-Mission™成分(σ)24小时使用Lipofectamine 2000转染试剂(表达载体,卡尔斯巴德CA)后,协议由制造商提供。同样,囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)被抑制巨噬细胞使用雌性生殖道(异烟肼)-172抑制剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)的浓度10 μ米8小时检查雌性生殖道的可能角色CS-impaired吞噬作用。

2.1.1。< /斜体> <斜体>绿脓假单胞菌感染模型

调查如果吞噬缺陷可以通过改善TFEB-mediated自噬诱导,非瑟酮治疗是利用。自噬诱导物,半胱胺(250 μM;σ)是用作积极控制杀菌和黏液溶解的实验。实验中感染, 铜绿假单胞菌( 铜绿假单胞菌)应变 PA01gfp是培养在仅有15—18小时Bertani(磅;热费希尔科学,沃尔瑟姆,MA)肉汤和羧苄青霉素(1%,σ)选择PA01-GFP在37°C和250 rpm,颤抖的孵化器。这种文化的 PA01 -GFP是直接加入DMEM / F12媒体在每一个感染复数(MOI) 10。

 2.2。免疫印迹

我们先前描述的免疫印迹法( 20., 24)是用来量化表达的变化TFEB(主自噬调节器),雌性生殖道,p62 (aggresome标记) β肌动蛋白的可溶性蛋白质分数RAW264.7细胞。TFEB从圣克鲁斯生物技术,获得雌性生殖道- 181内部( 25), β肌动蛋白从σ。

 2.3。荧光显微法量化的吞噬作用

RAW264.7细胞被镀在12或24孔板和非瑟酮预处理8小时(20 μ米),CSE(5%)、氯喹(10 μ米),雌性生殖道(异烟肼)-172(抑制剂;10 μ米)或转染24小时TFEB-Mission™成分。治疗后,这些细胞被感染 PA01 -GFP的莫伊10 3小时前荧光显微镜。荧光图像捕获使用佐伊™细胞荧光成像仪(Bio-Rad)。 巴勒斯坦权力机构01-GFP-infected(荧光)和总(亮场)巨噬细胞在相同的领域被数来分析细胞的吞噬能力。巨噬细胞感染的百分比 PA01-GFP-infected巨噬细胞与巨噬细胞的总数是量化计算细菌由巨噬细胞间隙。

 2.4。细菌的生存分析

原始细胞被播种到12或24孔板和非瑟酮治疗8小时(20 μ米),CSE(5%)、氯喹(30 μ米),雌性生殖道(异烟肼)-172 (10 μ米)或转染18小时TFEB-Mission™成分。这种治疗后,这些细胞被感染 PA01 -GFP的莫伊10 3小时。接下来,50或100 μl从这些文化和传播媒体收集2%磅琼脂板补充1%羧苄青霉素来选择 铜绿假单胞菌。这些盘子是在37°C孵化24小时和细菌菌落(cfu)统计量化细菌生存。

 2.5。杀菌和黏液溶解的实验

5%的粘蛋白(σ)在PBS溶液处理非瑟酮(20 μ米)或半胱胺(积极的控制;250年 μ米),搅拌12小时,直到溶解。300年 μl粘蛋白的解决方案是用移液器吸取到的1毫升无菌吸管,和旅行时间到达底部的吸管被记录。这是用来计算速度除以吸管的长度(厘米)28日记录时间,用来量化非瑟酮黏液溶解的活动。最后,为了评估非瑟酮的杀菌性能, PA01 -GFP是培养和处理非瑟酮(20和40 μ米)或半胱胺(积极的控制;250年 μ米),100 μ细菌培养的l是镀在96孔板和OD(600海里)被记录作为细菌生长的测量每3小时18小时。

 2.6。统计分析

作为数据平均值±标准平均误差(SEM)和不同群体之间的差异是使用标准的测试 t以及。的差异被认为是重要的如果 p 值≤0.05。微密度分析的结果从免疫印迹和荧光显微镜是利用ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)正如我们先前描述( 2]。

 3所示。结果 3.1。TFEB表达式是由非瑟酮在小鼠巨噬细胞

以前的出版物已经表明非瑟酮能够诱导自噬( 15, 18, 19, 22];因此,我们决定调查恢复CS-impaired吞噬作用的有效性。然而,这是首先需要确定的剂量非瑟酮用于进一步实验;因此,通过治疗RAW264.7细胞增加剂量的非瑟酮(0、10、20和40 μ米)8小时,我们首先选择合适的剂量。非瑟酮治疗后,血清总蛋白溶菌产物收集和TFEB表达的变化被量化。数据表明TFEB表达明显( p < 0.05 和 p < 0.001 )诱导RAW264.7细胞20和40 μ非瑟酮治疗(数字 1(一)和 1 (b))。因此,20 μ米非瑟酮剂量被选中作进一步调查,因为它是最低剂量诱导TFEB表达式。

非瑟酮诱发TFEB小鼠巨噬细胞中表达。(一)RAW264.7细胞治疗与非瑟酮剂量的增加(0、10、20和40 μ米)8小时。治疗后,细胞细胞溶解,总蛋白溶菌产物分离TFEB免疫印迹,以确定变化的表达式。免疫印迹分析显示增加TFEB(自噬调节器;在巨噬细胞中可溶性)表达式处理20 μM和40 μ非瑟酮。 β肌动蛋白被用作加载控制。(b)微密度分析TFEB表达的规范化 β肌动蛋白。数据代表 n = 4 每组和误差,描绘意味着±SEM, ∗ p < 0.05 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。20 μM剂量的非瑟酮诱发TFEB表达显著增加,因此选择进行进一步的试验研究。

 3.2。CS曝光损害在RAW264.7细胞吞噬作用

我们下一个调查如果CS暴露受损的小鼠巨噬细胞的吞噬作用和它的底层机制。在这些实验中,原始细胞使用非瑟酮(20 μ米)和/或CSE(5%) 8小时后感染PA01-GFP莫伊的10 3小时。荧光显微镜图像捕获使用Bio-Rad佐伊™使用ImageJ细胞荧光成像和分析软件。我们发现CS暴露显著( p < 0.01 )降低胞内细菌的数量与控制相比,明显( p < 0.01 非瑟酮治疗(数字)恢复 2(一个)和 2 (b))。发现了类似的趋势与另一个autophagy-inducing治疗药物,半胱胺(见附加图 1),它支持我们机械的发现CS暴露通过autophagy-impairment导致小鼠巨噬细胞吞噬功能缺陷。证实这个观察,实验重复了,通过流式细胞术分析。流式细胞术分析数据显示,CSE-treated巨噬细胞显著( p < 0.01 )降低PA01-GFP细菌数量显著( p < 0.05 (数字)增加了非瑟酮治疗 2 (d)和 2 (e))。作为功能性宣读,细菌生存被镀100量化 μl细胞培养基的显微镜和流式细胞仪实验2%磅琼脂板和孵化这些板块为24小时37°C,为了计数菌落(CFU)。CSE-treated集团在这两个实验的板块明显( p < 0.01 )更高的细菌生存和控制,而非瑟酮治疗显著( p < 0.01 , p < 0.001 )减少细菌生存(数字 2 (c)和 2 (f))。我们的研究结果表明,CS曝光损害细菌的小鼠巨噬细胞的吞噬作用,提高其生存,可以恢复通过自噬诱导非瑟酮。

CS曝光损害细菌间隙由巨噬细胞,促进细菌的生存。(一)原始细胞使用非瑟酮(20 μ米)或CSE(5%) 8小时。治疗后,这些细胞被感染 PA01-GFP 3小时的莫伊10。感染后,细胞与无菌PBS洗两次,其次是亮场和荧光显微镜(规模酒吧,100 μ米)。利用这些荧光图像量化被感染细胞的数量(胞内细菌)使用ImageJ软件。数据显示,CSE治疗显著地削弱细菌间隙,表示通过减少细胞内细菌的数量,由非瑟酮明显恢复。(b)所示的数据从图像(一)表示在这里意味着±SEM巨噬细胞感染的比例, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ p < 0.05 。(c)细胞培养媒体(100 μl)从(a)所示的实验群体传播2%磅琼脂板和孵化24小时37°C。菌落的数量(CFU)统计量化细胞外细菌的数量表示的细菌生存。CSE治疗导致显著增加细菌生存所控制的非瑟酮治疗。数据表示的意思是±cfu的扫描电镜, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 。(d)流式细胞术结果相同的原始细胞治疗组(a)所示显示CS-induced吞噬缺陷以及验证非瑟酮恢复CSE-impaired巨噬细胞吞噬功能的能力。(e)流式细胞仪的数据表示为意味着积极的吞噬细胞GFP荧光;显示为±SEM, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ p < 0.05 。(f)细菌生存分析的细胞培养基(100 μl)流式细胞仪实验显示的数量显著增加cfu CSE治疗后,由非瑟酮显著降低。数据代表的意思是±cfu的扫描电镜, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。这些数据表明CS曝光损害小鼠巨噬细胞的吞噬作用,自噬诱导可以恢复。

 3.3。抑制自噬损害间隙和促进PA01细菌在小鼠巨噬细胞的生存

CS暴露被发现抑制自噬引起aggresome形成慢性肺部疾病,如慢性阻塞性肺病( 1, 14, 15, 20.]。因此,我们调查CS-impaired自吞噬的可能机制失调的吞噬作用在原始细胞(巨噬细胞),通过预先处理这些细胞与非瑟酮(20 μ米)和/或氯喹(60 μ米)8小时。氯喹是一个自噬抑制剂,是用作积极控制CS-impaired自噬。治疗后,这些细胞被感染的莫伊PA01-GFP 10 3小时如上所述。后来,荧光图像捕获分析表明,自噬抑制显著( p < 0.01 )有害细菌间隙在原始细胞可以显著( p < 0.05 非瑟酮治疗(数字)恢复 3(一个)和 3 (b))。进一步探索对吞噬作用的影响,分析了细菌生存电镀实验媒体磅2%琼脂板和执行一个CFU计数。这种细菌生存分析的结果表明,自噬缺陷显著氯喹( p < 0.05 )增加细菌生存,这明显( p < 0.05 (图)减少非瑟酮治疗 3 (c))。这些结果证实自噬抑制由CS暴露结果在小鼠巨噬细胞吞噬功能障碍。

自噬抑制损害小鼠巨噬细胞的吞噬作用。(一)原始细胞使用非瑟酮(20 μ米)和氯喹(60 μ米)8小时。然后,这些细胞被感染 巴勒斯坦权力机构01-GFP 3小时的莫伊10。感染后,这些细胞被洗两次与PBS其次是亮场和荧光显微镜(规模酒吧,70 μ米)。ImageJ软件用于计算感染细胞的数量(胞内细菌)。数据显示,氯喹治疗损害吞噬作用的显著降低细胞内细菌数量的观察chloroquine-treated细胞,而非瑟酮证明所表现出的能力恢复吞噬作用显著增加细胞内的细菌的数量。(b)所示的数据(a)展示了均值±SEM巨噬细胞感染的比例, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ p < 0.05 。(c)媒体(100 μl)从实验组(a)息差2%磅琼脂板和孵化24小时37°C,和菌落的数量统计量化细胞外细菌的数量表示的生存。数据表明,自噬抑制导致PA01-GFP间隙的障碍,在细胞胞外细菌存活率明显高于使用氯喹治疗,一个自噬抑制剂。此外,非瑟酮显著减少细菌生存的预期。数据表示的意思是±cfu的扫描电镜, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 和验证自噬抑制导致原始细胞吞噬作用的障碍。

 3.4。TFEB击倒导致小鼠巨噬细胞吞噬功能障碍

先前的研究已经表明,TFEB是主自噬调节器启动各种自噬/ lysosomal-related基因的转录 15, 19, 26- - - - - - 28]。它也表明CS暴露导致TFEB本地化aggresome体内导致肺功能下降( 15]。因此,我们探索TFEB在自噬的作用——xenophagy-impaired吞噬作用被推倒TFEB表达原始细胞与非瑟酮预处理(20紧随其后 μ米)8小时,感染PA01-GFP莫伊10 3小时。荧光图像获取,然后分析使用ImageJ软件显示,细菌清除率明显受损( p < 0.001 )TFEB击倒。此外,非瑟酮治疗能够显著( p < 0.001 )救援细菌清除率(数据 4(一)和 4 (b))。接下来,细菌生存被计数量化cfu使用细胞培养媒体从这个实验中,如上所述。TFEB击倒细胞明显( p < 0.01 )更高的细菌生存比的控制,控制显著( p < 0.001 通过与非瑟酮治疗(图 4 (c))。因此,数据表明,自噬的调节TFEB CS-impaired吞噬作用的作用。

TFEB击倒损害小鼠巨噬细胞的吞噬作用。(一)原始细胞转染TFEB-Mission™shRNA 24小时。转染后的细胞是用非瑟酮预处理(20 μ米)8小时。之后,细胞被感染 PA01-GFP 3小时的莫伊10。感染后,这些细胞被洗两次与PBS其次是亮场和荧光显微镜(规模酒吧,70 μ米)。利用荧光图像计数被感染细胞的数量(胞内细菌)使用ImageJ软件。数据表明,细菌清除率显著抑制所表示的TFEB击倒细胞的胞内细菌数量明显降低。同时,非瑟酮显著恢复细菌间隙,表明细胞内细菌的数量的增加。(b)的数据,表示成比例的巨噬细胞感染,这是显示为±SEM, n = 4 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。(c)细菌生存分析是由细胞培养基(100蔓延 μl)从实验组(a), 2%磅琼脂板,孵化24小时在37°C。cfu计数量化了胞外细菌的生存。这些数据表明,减少TFEB表达显著增加细菌生存由于受损的吞噬作用。此外,非瑟酮能够恢复吞噬作用由cfu明显减少。数据表示均值±cfu的扫描电镜, n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 3.5。雌性生殖道抑制损害在RAW264.7细胞吞噬作用

CS接触已经证明通过积累aggresome体内引起雌性生殖道功能障碍( 2, 25, 29日, 30.]。这个障碍已经与自噬和增加细菌殖民化受损有关 2, 31日- - - - - - 34]。因此,我们研究了雌性生殖道的作用功能障碍与CFTR172受损由初加工原始细胞吞噬作用抑制剂(10 μ米)和/或非瑟酮(20 μ米)8小时后跟PA01-GFP感染的莫伊10 3小时。荧光图像分析表明,抑制雌性生殖道显著( p < 0.001 )受损的细菌间隙控制相比,明显( p < 0.001 非瑟酮治疗(数字)恢复 5(一个)和 5 (b))。原始细胞的吞噬功能进一步评估这个实验的细胞培养基镀2%磅琼脂板为24小时37°C和计数菌落以量化细菌生存。这些结果表明,雌性生殖道显著抑制( p < 0.01 )增加细菌生存,这明显( p < 0.01 (图)减少了非瑟酮治疗 5 (c))。这些结果表明,雌性生殖道功能障碍在吞噬作用障碍也有作用。为了研究非瑟酮是否能恢复CS-induced雌性生殖道功能障碍,原始细胞治疗CSE(5%)和/或非瑟酮(20 μ米)8小时,总蛋白质溶解产物被孤立。在雌性生殖道免疫印迹是用来量化变化表明显著( p < 0.05 )降低膜雌性生殖道表达式(c波段)CSE曝光,这明显( p < 0.05 非瑟酮治疗(数字)恢复 5 (d)和 5 (e))。因此,数据表明,CSE CFTR减少膜检测小鼠巨噬细胞表达,可能由于雌性生殖道错误折叠,CS-impaired自噬,和雌性生殖道aggresome积累,进一步加重吞噬反应。

非瑟酮复苏缺陷由雌性生殖道抑制吞噬作用。(一)原始细胞使用CFTR172抑制剂和/或非瑟酮(20 μ米)8小时后感染 PA01-GFP3小时的莫伊10。感染后,这些细胞被洗两次与PBS和观察使用亮场和荧光显微镜(规模酒吧,70 μ米)。荧光图像被用来计数的数量巨噬细胞感染(细菌细胞内)使用ImageJ软件。数据表明,抑制雌性生殖道损害吞噬细菌数量显著降低的细胞内所示,由非瑟酮显著恢复治疗。从(a) (b)数据表示为均值±SEM巨噬细胞感染的比例, n = 3 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。(c)细菌生存分析都使用了手机媒体(100 μl)从实验小组,镀2%磅琼脂板和孵化24小时在37°C。克隆形成单位细菌计数显示,雌性生殖道抑制导致更高数量的cfu代表受损的吞噬作用,由非瑟酮显著恢复治疗。数据表示均值±cfu的扫描电镜, n = 2 , ∗ ∗ p < 0.01 。(d)原始细胞治疗CSE和/或非瑟酮(20 μ米)8小时。治疗后,血清总蛋白溶菌产物分离和分析免疫印迹的雌性生殖道的表达和p62表达的变化。免疫印迹分析表明,膜雌性生殖道表达式(c波段)显著减少了CSE曝光,这是明显恢复非瑟酮治疗。 β肌动蛋白被用作加载控制。CFTR (e)微密度分析检测和p62表达规范化 β肌动蛋白。数据代表 n = 3 每组和误差,描绘意味着±SEM, ∗ ∗ p < 0.05 。因此,数据显示,雌性生殖道抑制影响巨噬细胞的吞噬能力。此外,非瑟酮显示能够纠正这种CFTR-mediated吞噬缺陷在原始细胞。

 3.6。非瑟酮显示承诺杀菌和黏液溶解的用于治疗慢性阻塞性肺病

许多慢性肺疾病的发病机制涉及慢性炎症,反复发作,粘液积聚( 2, 13, 17, 31日, 35- - - - - - 39]。因此,一种治疗方法,控制这些疾病的特征是非常理想的处理慢性发作。半胱胺就是这样一种药物已知的抗氧化,抗炎,autophagy-inducing,黏液溶解的,和杀菌性能 13, 14, 40, 41]。类似地,非瑟酮(非处方药物)也有抗氧化和消炎作用,以及作为一个强有力的autophagy-inducing药物( 15, 23, 42- - - - - - 44]。此外,最近的研究表明,有效杀死各种细菌和病毒( 45- - - - - - 48可以帮助患有慢性或反复发作。因此,我们研究了对PA01-GFP非瑟酮的杀菌性能。为此,PA01生长15小时在磅汤治疗非瑟酮(20或40 μ米)。在治疗,OD(600海里)记录量化文化里的细菌的数量。这是重复每3小时18小时。OD的变化的分析表明,40岁 μ非瑟酮显著( p < 0.01 )抑制细菌增殖。接下来,这个实验是重复与非瑟酮(40 μ米)或半胱胺(250 μ米)治疗。这些数据证实40 μ米非瑟酮治疗显著( p < 0.001 )受损的细菌生长表明其杀菌属性(数据 6(一)和 6 (b))。接下来,我们关注的黏液溶解的潜力非瑟酮搅拌5%粘蛋白的解决方案在一夜之间有或没有非瑟酮(20 μ米)或半胱胺(积极的控制;250年 μ米),粘蛋白混合(300 μl)然后用移液器吸取到的1毫升无菌吸管,和粘蛋白的速度记录的表示粘液粘度的变化。数据显示,非瑟酮和半胱胺治疗显著( p < 0.001 )粘蛋白溶液的粘度下降表明非瑟酮有黏液溶解的潜力(图 6 (c))。这些发现表明,非瑟酮可能是一个有效的治疗复发性或慢性急性加重的慢性阻塞性肺病。

非瑟酮演示了杀菌和黏液溶解的特性。(一) PA01LB培养基中生长15小时然后接受非瑟酮(20和40 μ米)。在治疗,OD(600海里)记录量化文化里的细菌的数量。随后,OD是每3小时18小时分析细菌增殖的变化。40 μ米非瑟酮相比,演示了一个显著的抑制细菌生长的控制。数据表示均值±SEM、 n = 3 , ∗ ∗ p < 0.01 。从(a) (b)实验过程是重复与非瑟酮(40 μ米)或半胱胺(250 μ米)。数据显示,非瑟酮相比显著减少细菌的数量控制和半胱胺治疗。数据表示的意思是±SEM、 n = 5 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。粘蛋白(c) 5%的解决方案是激起了一夜之间有或没有非瑟酮(20 μ米)或半胱胺(250 μ米),300 μl的黏液混合然后用移液器吸取到的1毫升无菌吸管,和粘蛋白被记录的速度表示粘液粘度的变化或黏液溶解的活动。数据显示,两个半胱胺(积极控制)和非瑟酮显著减少粘蛋白的粘度表明非瑟酮有黏液溶解的潜力。数据表示的意思是±SEM、 n = 5 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 4所示。讨论

的一个方面CS-induced COPD-emphysema发病机理是恒定的细菌殖民化引起反复发作的低航空主题导致高发病率和死亡率[ 2, 49- - - - - - 51]。研究表明,CS曝光损害吞噬,这也许可以解释这些急性加重 2, 11, 52- - - - - - 54];然而,机制尚不清楚。我们的研究首次证实CS暴露明显受损的细菌( 铜绿假单胞菌PA01-GFP)小鼠巨噬细胞的吞噬作用和改善生存。接下来,探讨可能的潜在机制障碍,我们专注于自噬和xenophagy, CS受损的风险。CS-induced自噬和xenophagy障碍模型,我们用氯喹治疗原始细胞,自噬抑制剂(如积极的控制),并发现细菌清除率显著阻碍及其生存显著增加。以来,CS-impaired自噬噬菌作用的承诺作为一个潜在的机制缺陷在COPD-emphysema发现会导致反复发作,我们进一步研究了这一过程。我们发现主自噬的可拆卸的监管者,TFEB表达式,在原始细胞严重受损的间隙PA01-GFP和显著增强其生存。这一发现是非常重要的在理解因为TFEB主自噬机制监管机构( 15, 19];因此,降低其表达导致损伤的自噬和xenophagy发现小鼠巨噬细胞吞噬作用的主要监管机构。因此,我们得出结论,CS-induced自噬缺陷可能占COPD-emphysema科目的功能失调的吞噬作用,图中描述的机制 7。此外,先前的调查表明雌性生殖道的作用在吞噬的规定( 2, 25, 33),以及获得雌性生殖道功能障碍引起的CS曝光。因此,我们发现,与雌性生殖道抑制剂诱导雌性生殖道功能障碍172年明显受损的细菌吞噬作用和增加了生存在原始细胞,这表明雌性生殖道的作用CS-induced吞噬作用,调节TFEB-mediated自噬。因此,我们的调查显示,首次CS-impaired自噬和xenophagy功能调解一个获得雌性生殖道的缺陷作为底层机制吞噬缺陷中发现慢性阻塞性肺病。

示意图表示显示香烟烟雾诱发机制通过TFEB-mediated自噬在慢性阻塞性肺病急性加重损伤。我们机械的分析表明,CS / ROS暴露导致aggresome TFEB积累的身体,从而削弱autophagy-regulating蛋白质的表达导致慢性自噬抑制。此外,CS接触也会导致减少雌性生殖道膜表达,由于其类似aggresome体内积累进一步加重自噬。这CS-mediated慢性自噬缺陷引发噬菌作用的缺陷,导致增加细菌感染复发机制或慢性发作COPD-emphysema科目。此外,非处方抗氧化治疗药物,非瑟酮诱发TFEB恢复水平的自噬蛋白表达,纠正了CS-induced吞噬缺陷。因此,建议治疗的潜在非瑟酮或autophagy-inducing药物在控制COPD-emphysema科目的反复发作。

此外,它已被证明,CSE富含活性氧化剂物种(ROS)的有害效应在许多细胞过程和呼吸功能。此外,ROS和CSE有抑制自噬被证明 18, 20., 55),支持我们的研究结果,CS-impaired自噬作用在巨噬细胞吞噬功能障碍观察。此外,活性氧导致雌性生殖道功能障碍( 2, 25, 56),我们发现进一步加剧CS-induced自噬缺陷导致吞噬缺陷。因此,CS-induced自噬和xenophagy障碍和雌性生殖道功能障碍协同机制调解吞噬功能障碍在COPD受试者。因此,我们研究了如果这吞噬功能障碍可以减轻通过使用一个自噬调节,抗氧化药物,非瑟酮。非瑟酮是黄酮具有抗炎和抗癌特性( 15, 23, 44, 57]。非瑟酮也被证明函数作为一个自噬诱导物( 15]。在这项研究中,我们发现,诱导自噬的一种抗氧化剂,非瑟酮,明显恢复CS-impaired吞噬功能,从而显著降低细菌生存的原始细胞。非瑟酮也能明显恢复吞噬作用,当雌性生殖道功能被抑制。这些发现表明,非瑟酮或其他autophagy-inducing抗氧化药物提供了一个新颖的治疗方法治疗反复发作的COPD-emphysema针对自噬的机械作用和xenophagy吞噬功能障碍。这是很重要的,因为这些发作的持续治疗用抗生素导致耐药性细菌,导致死亡率增加( 49, 58, 59]。因此,通过专注于恢复巨噬细胞的吞噬功能在COPD受试者,而不是直接针对细菌,可以防止反复发作和慢性阻塞性肺病患者细菌耐药性。

此外,慢性阻塞性肺病和其他慢性肺疾病的特点是炎症,氧化应激,粘液分泌增加,细菌感染( 7, 12, 35, 38, 39, 60- - - - - - 62年]。因此,理想的治疗这些疾病将解决所有的这些方面,而不是只针对一个特定的治疗慢性阻塞性肺病(s)的特征。半胱胺就是这样一种药物的属性已经被证明能够影响这些特征的慢性呼吸道疾病发病机理( 13, 14, 41];因此,我们研究了非瑟酮的治疗能力相比,半胱胺(作为一个积极的控制)。非瑟酮具有抗氧化,抗炎、杀菌性能对一些细菌( 23, 57]。此外,我们的调查显示,非瑟酮可以充当黏液溶解的半胱胺类似的有效性,以及抑制PA01-GFP的生长。这些发现表明,非瑟酮已承诺在治疗其他阻塞性肺疾病的致病特点,如COPD-emphysema和囊性纤维化。然而,进一步的研究是必要的为非瑟酮的确切化学性质,占其黏液溶解的和直接的杀菌活性。

尽管我们的发现在非瑟酮直接杀菌活动,这个属性只占1.2倍降低细菌生存在我们的实验。与此同时,在我们的吞噬作用实验,减少细菌生存是四倍;因此,它可以断言,显著降低细菌生存fisetin-treated组在这些实验是自噬诱导的结果。这种说法是有可能的,因为非瑟酮的直接杀菌效果的影响是最小的相比,我们的观察在phagocytosis-mediated细菌间隙,这意味着恢复phagocytosis-influenced细菌杀死这些结果。这进一步支持CS损害TFEB-mediated自噬作为一种机制COPD-emphysema吞噬缺陷的主题,以及非瑟酮的治疗可能恢复通过TFEB感应吞噬作用。此外,CS-acquired雌性生殖道功能障碍是TFEB-mediated自噬缺陷放大,这导致aggresome逮捕雌性生殖道正如我们最近描述( 25, 56]。因此,正如预期,autophagy-inducing抗氧化剂如非瑟酮和半胱胺不仅增强CS-impaired自噬也由此产生的雌性生殖道功能障碍和吞噬的缺陷。

 5。结论

总之,我们建立CS-impaired自噬和xenophagy作为一个关键机制参与产生的噬菌作用的缺陷。此外,autophagy-inducing药物和抗氧化特性,如非瑟酮还原CS-impaired吞噬展示其治疗潜力在控制复发加重COPD-emphysema和其他慢性呼吸道疾病。

 信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。当前所属Neeraj Vij说,女士,博士,总裁和首席执行官,Vij生物科技有限责任公司,美国马里兰州巴尔的摩。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

 作者的贡献

Neeraj Vij说的构思和设计研究;Garrett Pehote Neeraj Vij说,凯瑟琳Brucia,博达资源分析和解释研究;加勒特Pehote Manish博达,凯瑟琳Brucia Neeraj Vij说了实验;Garrett Pehote Neeraj Vij说,凯瑟琳Brucia, Manish博达起草和编辑的手稿。

 确认

支持的研究是空姐临床医学研究所(FAMRI)的年轻科学家奖(YCSA_082131) Neeraj Vij说。

 补充材料

补充图1。半胱胺恢复CS诱导小鼠巨噬细胞吞噬缺陷。(A)的原始细胞预处理与半胱胺(250μM)和/或CSE(5%) 8小时。治疗后,这些细胞被感染了 PA01-GFP 3小时的莫伊10。然后,无菌PBS的细胞被洗两次,其次是亮视场和荧光显微镜(酒吧,规模70μm)。利用这些荧光图像量化被感染细胞的数量(胞内细菌)使用ImageJ软件。数据显示,CSE治疗显著地削弱细菌间隙,表示通过减少细胞内细菌的数量,由半胱胺显著恢复治疗。(B)所示的数据从图像表示这里意味着±SEM巨噬细胞感染的比例, n = 3 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。细胞培养基(C)(100μl)所示的实验群体传播在2% LB-agar盘子和孵化24小时在37°C。集落形成单位(CFU)的数量统计量化细胞外细菌的数量表示的细菌的生存。CSE治疗导致显著增加细菌的生存。半胱胺治疗显示减少细菌生存;然而,这是无关紧要的。数据表示的意思是±cfu的扫描电镜, n = 3 , ∗ p < 0.05 。

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