1。介绍
为了了解肿瘤细胞逃避免疫监视机制,因此可以开发抗肿瘤疗法,它是至关重要的调查机制,免疫系统与肿瘤微环境相互作用。肿瘤微环境强有力地抑制免疫反应对肿瘤细胞通过各种可溶性介质和机制(
1 - - - - - -
3 ]。
IL-17是一种炎性细胞因子起着重要的作用在调节白细胞游走在炎症反应
4 - - - - - -
8 ]。IL-17在炎症和自身免疫性疾病的作用已经被广泛的研究(
9 ,
10 ]。直到现在,IL-17在肿瘤发展中的作用是有争议的。最近的报告表明,肿瘤的生长增加IL-17缺乏小鼠和机制与NK细胞(
11 ,
12 ]。其他报告显示抑制肿瘤生长在IL-17缺乏小鼠由于增加myeloid-derived抑制肿瘤细胞(MDSCs)渗透和il - 6生产(
1 ,
13 ]。高机动组框1 (Hmgb1)是一种进化保守,chromatin-binding蛋白质,已经涉及到几种疾病包括脓毒症、关节炎、缺血再灌注损伤和癌症(
14 - - - - - -
16 ]。癌细胞发生了坏死细胞死亡可以释放Hmgb1进入当地的微环境。Hmgb1可以诱发慢性inflammatory-reparative反应并导致肿瘤细胞扩张和转移。Hmgb1也积极由炎症细胞分泌的,作为一个内生的危险信号与高亲和力和绑定几个受体包括TLR2, TLR4, TLR9识别,和愤怒
14 ]。Akirav等人此外,报告建议协会愤怒表达水平增加的IL-17生产(
17 ]。然而,Hmgb1的细胞和分子免疫机制在肿瘤的发展仍然是难以捉摸的。如何具体的先天免疫受体Hmgb1诱发促炎细胞因子,这些细胞因子如何'随后的先天免疫反应是完全不清楚。
在这项研究中,我们表明,Hmgb1刺激生产IL-23 RAGE-dependent的方式。IL-23促进IL-17主要由的表达
γ
δ T细胞。通过il - 6感应IL-17然后促进肿瘤的生长,进而激活Stat3在肿瘤。因此,Hmgb1-IL-23-IL-17-IL-6-Stat3轴有助于肿瘤小鼠黑色素瘤模型的发展。
2。材料和方法
2.1。老鼠
野生型C57BL / 6小鼠的实验动物中心,华中科技大学同济医学院,中国。IL-17−−/ 在C57BL / 6小鼠背景和愤怒−−/ 老鼠从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)。所有的老鼠被安置在特定无菌设施与普通食物和水随意。实验动物保健和使用委员会制度批准同济医学院(武汉,中国)。
移植肿瘤模型:协议的接种和测量肿瘤移植肿瘤模型中被报道之前(
18 ]。小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10购买来自美国文化集合类型。肿瘤细胞在小鼠注射南卡罗来纳州,肿瘤生长监测每3天。肿瘤的大小是用以下公式计算:肿瘤
大小
=
l
×
年代
×
H
×
π
/
6
(
l
长直径;
年代
,短直径;
H
、高度)
19 ]。
检查的影响IL-17 IL-23, il - 6在肿瘤生长,小鼠静脉输液治疗与腺病毒(广告)编码绿色荧光蛋白或鼠标IL-17A (Ad-IL-17)、il - 6 (Ad-IL-6),或IL-23 (Ad-IL-23) (109 空斑形成单位/鼠标)如前所述
20. ]。重组腺病毒用于鼠标IL-17A IL-23或il - 6过度使用生成AdEasy Adenoviral向量系统(Stratagene拉霍亚,CA)在ad - 293细胞根据制造商的指示
21 ]。两天后,老鼠注射B16-F10肿瘤细胞。
检查中和IL-17 IL-23或il - 6的影响
γ
δ 细胞在肿瘤生长,小鼠接种南卡罗来纳州B16-F10肿瘤细胞和治疗ip有100
μ g /鼠标正常大鼠的免疫球蛋白或鼠anti-mouse-IL-17马伯(美国Biolegend) -IL-23, -IL-6(美国eBioscience),
γ
δ 细胞受体nkg2d马伯(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在0(肿瘤接种的日子),1、6、10、14 (
19 ]。p-Stat3的抑制小白鼠注射通过口服填喂法WP1066(圣克鲁斯生物技术有限公司)在40毫克/公斤80年20部分DMSO溶液的混合物部分聚乙二醇300 (Sigma-Aldrich、东京、日本)每天一次(5天,2天)所描述的其他地方(
22 ,
23 ]。抑制Hmgb1,老鼠对ip 10毫克/鼠标甘草甜素(TCI,中国上海)天0(肿瘤接种的日子),2、5、10和15 (
24 ]。
检查MDSCs对肿瘤生长的影响,净化MDSCs (
2
×
1
0
6
/鼠标)coinjected南卡罗来纳州B16转椅黑色素瘤细胞(
1
×
10
6
/鼠标)野生型老鼠和肿瘤生长监测
19 ]。
2.2。免疫组织化学分析
B16-F10肿瘤细胞接种到小鼠。2周后,小鼠肿瘤组织是收获。5
μ m的部分肿瘤标本固定在丙酮被迅速冻结,permeabilized与甲醇,沾染了抗体特定CD8细胞或anti-proliferating核Ag (PCNA)或tyrosine-phospho-Stat3 (p-Stat3)(圣克鲁斯生物技术有限公司),并与二次抗体检测共轭Alexa萤石488(表达载体),如前所述[
25 ]。显微镜下使用数码相机拍摄照片(奥林巴斯,梅尔维尔,纽约)。血管在光学显微镜下数×200。阳性细胞数在每组10个领域。平均阳性细胞的数量字段计算和统计分析。
2.3。流式细胞术分析
检查肿瘤浸润细胞,肿瘤组织的小鼠肿瘤细胞接种B16转椅两周前被切成小块,消化RPMI 1640中含有胶原酶D(2毫克/毫升)(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)Dnase我(50
μ FCS g / mL),和10%。检测MDSCs、肿瘤细胞悬浊液和脾脏内或血液白细胞沾Alexa488-labeled CD11b和allophycocyanin-labeled Gr-1 Abs (BD生物科学)。细胞内细胞因子染色,淋巴细胞刺激了plate-bound anti-CD3和anti-CD28马伯(BD生物科学)在96 - 6 h平底的盘子。与anti-CD4 IL-17-producing分析,淋巴细胞被染色,cd8 -
γ
δ 细胞受体,-IL-17马伯(BD生物科学)根据制造商的指示。数据获得在FACSCalibur (BD生物科学)和分析使用CellQuest软件(BD生物科学)。
2.4。Tunel分析
凋亡细胞被TUNEL检测化验如前所述[
18 ,
19 ]。简而言之,小鼠的肿瘤样本接种B16转椅肿瘤细胞2周前在10%福尔马林固定,和部分。TUNEL分析了使用商业细胞凋亡检测设备根据制造商的指示(Promega,麦迪逊,WI)。部分与DAPI复染色和显微镜下拍摄×10个目标。凋亡细胞的数量计算,结果从10字段计算每组的统计分析。
2.5。实时定量rt - pcr
总RNA提取培养细胞或组织使用试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和反向转录成cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类生物技术、大连、中国)根据制造商的指示。目标基因的mRNA水平量化使用SYBR绿色主人混合(豆类生物技术,大连,中国)与ABI棱镜7900序列检测器系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。每个反应是在重复执行,相对基因表达的变化归一化
β 肌动蛋白水平测定使用的相对阈值周期的方法。引物序列所示补充表1在网上补充材料
http://dx.doi.org/10.1155/2013/713859。
2.6。免疫印迹
p-Stat3蛋白质水平的使用主要由免疫印迹anti-p-Stat3 Abnova,台北,台湾。蛋白质从细胞或组织中提取分离10% SDS-polyacrylamide电泳凝胶和转移到硝化纤维素膜(皮尔斯,罗克福德,IL)。与在TBS 5%脱脂牛奶被屏蔽后3小时,孵化了膜主要抗体(0.2表示
μ 在4°C g / mL)一夜之间,其次是孵化HRP-conjugated二级抗体(1:5000)为3小时。
β 肌动蛋白是用来装载控制对比样本。
2.7。ELISA
Signal-cell悬浮液由B16转椅肿瘤从野生型小鼠和IL-17收获−−/ 老鼠的
在体外 过夜。文化上层清液中il - 6浓度测定用ELISA试剂盒的研发体系。为
在体外 分析,106 /毫升B16转椅细胞被刺激24 h重组IL-17 10 ng / mL,然后在文化上层清液il - 6浓度测定(
13 ]。
2.8。统计分析
所有数据被当作意味着±SEM。双尾学生的
t
以及统计分析的应用
P
<
0.05
被认为具有统计学意义。数据分析使用棱镜软件(GraphPad软件,Inc .)。
3所示。结果
3.1。肿瘤生长抑制在IL-17 <一口>−−/ < /一口>老鼠
检查IL-17对黑色素瘤的影响增长,野生型老鼠和IL-17−−/ 与黑色素瘤细胞系小鼠接种南卡罗来纳州B16-F10 (
1
×
10
6
/鼠标),肿瘤生长监测。结果表明,黑素瘤细胞系生长B16-F10 IL-17显著抑制−−/ 小鼠与野生型小鼠相比(图
1(一) )。为了进一步确定IL-17促进肿瘤的生长,野生型小鼠注射输液Ad-IL-17或Ad-GFP (109 空斑形成单位/鼠标),然后接种B16-F10肿瘤细胞。结果表明,治疗Ad-IL-17显著增加肿瘤的生长而不及时治疗或控制老鼠Ad-GFP对待(图
1 (b) )。相反,野生型小鼠中和anti-IL-17 Ab治疗显著地抑制B16-F10肿瘤的生长与鼠免疫球蛋白(图处理的控制
1 (c) )。
IL-17抑制肿瘤发展的缺陷。与肿瘤细胞小鼠接种南卡罗来纳州,肿瘤大小都是被监控的。(一)野生型老鼠和IL-17−−/ 给小鼠注射B16-F10肿瘤细胞(
n
=
5
)。(b)野生型小鼠治疗静脉输液与Ad-IL-17或Ad-GFP (109 空斑形成单位/鼠标)或不及时治疗(没有)。两天后,老鼠与B16-F10接种肿瘤细胞,肿瘤生长监控(
n
=
5
)。(c)野生型小鼠接种B16-F10肿瘤细胞与正常rat-IgG或一只老鼠注射ip anti-mouse IL-17马伯(100
μ 天0 g /鼠标),1、6、10、14 (
n
=
5
)。控制老鼠不及时治疗(none)。(d) CD11b+ Gr-1+ MDSCs在脾脏、血液和肿瘤小鼠的肿瘤样本接种B16-F10肿瘤细胞2周前分析流式细胞仪(
n
=
5
)。(e) MDSCs纯化从脾脏B16转椅肿瘤的老鼠与LPS刺激过夜。CD11b+ 细胞从天真患肿瘤小鼠接受有限合伙人和担任控制。mRNA水平由实时rt - pcr和规范化
β
每个样本中肌动蛋白(
n
=
5
)。肿瘤大小的数据显示意味着±SEM和代表三个独立的实验。
P
*
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
检查IL-17缺乏对肿瘤的影响,从肿瘤小鼠肿瘤组织收集并进行分析。结果表明,在肿瘤增殖细胞的数量,沾染了PCNA Ab, IL-17显著降低−−/ 小鼠与野生型相比,动物(补充图
1
(
一个
)
)。相比之下,凋亡细胞的数量,这被TUNEL分析发现,在IL-17显著增加−−/ 老鼠(补充图
1
(
b
)
)。在肿瘤免疫网站对于肿瘤的命运很重要,和T细胞的渗透与预后密切相关(
26 ,
27 ]。我们发现CD8的渗透+ T细胞的肿瘤,肿瘤抑制的主要效应细胞,在IL-17显著增加−−/ 老鼠(补充图
1
(
c
)
)。
脾脏的MDSCs数量增加,血液和肿瘤的特点主要免疫异常在癌症患者和肿瘤的动物
28 ,
29日 ]。MDSCs被认为是一种不成熟的髓细胞,主要是确认为CD11b和Gr-1 double-positive小鼠细胞(
30. ]。我们发现CD11b的百分比+ Gr-1+ MDSCs在脾脏、血液和肿瘤IL-17−−/ 小鼠与野生型相比显著降低控制(图
1 (d) )。MDSC的肿瘤促进功能与Arg-1活动的增加有关,MMP9, S100A8 [
30. ]。在我们的实验中,MDSCs纯化从脾脏肿瘤的老鼠与LPS刺激
在体外 一夜之间。结果表明,从IL-17 MDSCs−−/ 肿瘤小鼠表达低水平的Arg-1, MMP9, S100A8比野生型肿瘤小鼠(图
1 (e) )。
之前的论文表明,肿瘤细胞overexpressing IL-17显著促进新血管生长进入肿瘤组织(
7 ]。我们也调查了肿瘤组织的血管密度从野生型和IL-17获得−−/ 老鼠。免疫组织化学分析显示,肿瘤组织中的血管的平均数量在IL-17明显减少−−/ 老鼠(补充图
1
(
d
)
)。
3.2。损耗的<斜体>γ< /斜体> <斜体>δ< /斜体> T细胞抑制肿瘤的生长
识别的细胞来源IL-17生产在肿瘤的发展过程中,我们准备好的B16-F10直到从肿瘤小鼠2周后在野生型小鼠接种。IL-17生产分析了不同子集的淋巴细胞刺激后细胞内细胞因子染色试验和固定化anti-CD3 anti-CD28马伯
在体外 。我们发现IL-17主要由
γ
δ 而非CD4 T细胞+ T细胞、CD8+ T细胞渗透到肿瘤组织(图
2(一个) )。
IL-17主要是由
γ
δ T细胞和枯竭
γ
δ T细胞抑制肿瘤的生长。直到收集从B16-F10肿瘤组织B16-F10肿瘤细胞接种后2周。IL-17-producing细胞在t细胞子集被细胞内染色试验检测。(一)细胞的比例生产IL-17 (
n
=
5
)。(b)野生型小鼠接种B16-F10肿瘤细胞与正常rat-IgG或一只老鼠注射ip anti-mouse
γ
δ TCR马伯或anti-mouse NKG2D马伯(100
μ 天0 g /鼠标),1、6、10、14 (
n
=
5
)。然后肿瘤大小都是被监控的。(c) IL-17相对mRNA表达在肿瘤组织B16-F10肿瘤小鼠接受rat-IgG, -
γ
δ 细胞受体或nkg2d马伯(
n
=
5
)。(d)细胞的百分比在控制,生产IL-17反
γ
δ 细胞受体,anti-NKG2D治疗组(
n
=
5
)。(e)肿瘤生长在B16转椅肿瘤细胞接种小鼠从WT MDSC WT + anti-IL-17 MDSC, WT + Ad-IL-17 MDSC,和WT + Ad-IL-17 MDSC +反
γ
δ 细胞组(
n
=
5
)。肿瘤大小的数据显示意味着±SEM和代表三个独立的实验。
P
*
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
以前的论文表明,NKG2D表达检测肿瘤浸润
γ
δ T细胞(
1 ]。我们添加了反
γ
δ 细胞受体或anti-NKG2D马伯B16-F10带有肿瘤的老鼠。结果表明,野生型小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10增长显著地抑制反的治疗
γ
δ 细胞受体或anti-NKG2D马伯而不及时治疗或治疗rat-IgG(图
2 (b) )。增殖细胞的数量和平均血管和CD11b的百分比+ Gr-1+ MDSCs在肿瘤组织和反也显著降低
γ
δ 细胞受体或anti-NKG2D马伯管理局(补充图2 (a) 2 (c))。同时,IL-17生产被反深刻的封锁
γ
δ 细胞受体或anti-NKG2D马伯(图
2 (c) )。和减少IL-17 IL-17-producing生产是由于减少了
γ
δ T细胞(图
2 (d) )。这些发现表明,
γ
δ 肿瘤浸润细胞IL-17生产是至关重要的
γ
δ NKG2D增强T细胞在肿瘤微环境,这些影响。
此外,我们研究了MDSC的贡献
γ
δ T细胞致瘤的效果。结果显示减少肿瘤促进效应从anti-IL-17 MDSCs B16转椅治疗肿瘤的小鼠相比,从野生型。相比之下,MDSCs从野生型肿瘤小鼠服用Ad-IL-17促进肿瘤生长在相当大程度上比野生型小鼠肿瘤的控制。和增加肿瘤促进效应从Ad-IL-17 MDSCs B16转椅治疗肿瘤的老鼠与反政府废除
γ
δ 细胞治疗(图
2 (e) )。
3.3。代IL-17 IL-23是至关重要的
调查的角色IL-23生产IL-17肿瘤浸润
γ
δ T细胞,IL-23p19, IL-23p40 IL-23测量的子单元。IL-23p19和IL-23p40 mRNA表达在肿瘤组织显著增加2周后B16-F10接种在野生型小鼠(图
3(一个) )。和IL-23p19和IL-23p40 mRNA的表达明显减少反
γ
δ 细胞治疗野生型老鼠或IL-17−−/ 小鼠B16转椅肿瘤与对照组相比(图
3 (b) )。需要进一步确定IL-23 IL-17A的生产,我们使用anti-IL-23p19或anti-IL-23p40抗体中和它的功能。黑色素瘤治疗的肿瘤生长明显抑制anti-IL-23p19或anti-IL-23p40马伯(图
3 (c) )。增殖细胞的数量,平均血管,CD11b的百分比+ Gr-1+ MDSCs也显著降低,anti-IL-23p19或anti-IL-23p40马伯管理与rat-IgG治疗(补充图3 (a) 3 (c))。同时,IL-17生产与治疗anti-IL-23p19深刻封锁或anti-IL-23p40马伯(图
3 (d) )。和减少IL-17 IL-17-producing生产是由于减少了
γ
δ T细胞(图
3 (e) )。
代IL-17 IL-23是至关重要的
在活的有机体内 和
在体外 。(一)IL-23p19 IL-23p40 mRNA水平分析了实时PCR从肿瘤小鼠肿瘤组织一个或两个星期后B16-F10接种(
n
=
5
)。(b) IL-23p19和IL-23p40 mRNA水平分析实时PCR在肿瘤组织两周从WT B16-F10接种后,WT +反
γ
δ 细胞受体,IL-17−−/ 组(
n
=
5
)。(c)野生型小鼠接种B16-F10肿瘤细胞和正常rat-IgG注入ip, -IL-23p19马伯,或者-IL-23p40马伯(100
μ 天0 g /鼠标),1、6、10、14 (
n
=
5
)。然后监控肿瘤大小(
n
=
5
)。(d) IL-17相对mRNA表达在肿瘤组织B16-F10肿瘤小鼠接受rat-IgG, -IL-23p19马伯,或者-IL-23p40马伯(
n
=
5
)。(e)细胞的百分比在控制,生产IL-17 anti-IL-23p19, anti-IL-23p40治疗组(
n
=
5
)。(f) IL-17-producing
γ
δ 与IL-23 T细胞刺激后。IL-17+
γ
δ T细胞刺激后,流式细胞仪分析了48小时。肿瘤淋巴细胞肿瘤中分离的小鼠B16-F10接种后1周。这些细胞被刺激与中、il - 1
β (50 ng / mL), IL-23 (50 ng / mL), 48小时或组合。(g)的分泌增加IL-17从肿瘤
γ
δ 与IL-23 T细胞刺激
在体外 。
γ
δ T细胞从肿瘤淋巴细胞纯化,mac和刺激中,il - 1
β (50 ng / mL), IL-23 (50 ng / mL)或48小时的组合。经过48小时的刺激,收集上清液,IL-17浓度由ELISA试剂盒测定。肿瘤大小的数据显示意味着±SEM和代表三个独立的实验。
P
*
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
为了进一步确认代IL-17-producing IL-23所扮演的角色
γ
δ T细胞,刺激肿瘤
γ
δ 与外生IL-23 T细胞
在体外 ;刺激后48小时内,IL-17-producing的百分比
γ
δ T细胞显著增加(图
3 (f) )。上层清液IL-17从纯化
γ
δ 与IL-23 T细胞刺激后增加,进一步提高了IL-23 + il - 1
β 刺激(图
3 (g) )。因此,
在体外 实验数据表明,IL-23 IL-17的生产需要
γ
δ T细胞。
3.4。Hmgb1-RAGE通路介导IL-23的生产
Hmgb1,有关分子及其受体愤怒增加肿瘤组织B16-F10接种2周后(图
4(一) )。和Hmgb1 mRNA的表达明显减少反
γ
δ 细胞治疗野生型老鼠或IL-17−−/ 小鼠B16转椅肿瘤与对照组相比(图
4 (b) )。黑色素瘤细胞系B16-F10增长明显抑制,和表达IL-23 IL-17愤怒明显下降−−/ 小鼠与野生型小鼠相比(数字
4 (c) - - - - - -
4 (d) )。使用Hmgb1抑制剂甘草甜素显著降低肿瘤大小(图
4 (c) )和生产IL-23 IL-17,重组鼠标IL-23政府废除了减少IL-17 Hmgb1抑制剂引起的表达和减少肿瘤大小(数字
4 (e) - - - - - -
4 (f) )。此外,增殖细胞的数量和平均血管和CD11b的百分比+ Gr-1+ MDSCs都显著降低肿瘤组织的愤怒−−/ 老鼠和甘草甜素治疗野生型小鼠与野生型小鼠相比,没有治疗(补充图4 (a) 4 (c))。这些发现表明Hmgb1-RAGE途径有助于IL-17表达式依赖IL-23生产然后促进肿瘤的生长。
Hmgb1-RAGE通路介导IL-23的生产。(a) mRNA水平的Hmgb1与愤怒被实时PCR分析肿瘤组织中肿瘤小鼠B16-F10接种后一到两周(
n
=
5
)。(b) Hmgb1与愤怒mRNA水平分析了实时PCR在肿瘤组织两周从WT B16-F10接种后,WT +反
γ
δ 细胞受体,IL-17−−/ 组(
n
=
5
)。(c)肿瘤生长在B16转椅带有野生型小鼠ip与10毫克/鼠标甘草甜素(GL)天0、2、5、10、15和B16转椅带有愤怒−−/ 老鼠(
n
=
5
)。(d) IL-23p19和IL-17相对mRNA表达在肿瘤组织B16-F10带有野生型小鼠和愤怒−−/ 老鼠(
n
=
5
)。(e) IL-23p19和IL-17相对mRNA表达在肿瘤组织B16-F10带有野生型老鼠GL GL + Ad-IL-23或处理不及时治疗(
n
=
5
)。(f)肿瘤生长与GL B16转椅肿瘤野生型小鼠,或GL + Ad-IL-23 GL + Ad-GFP或不及时治疗(
n
=
5
)。肿瘤大小的数据显示意味着±SEM和代表三个独立的实验。
P
*
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
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3.5。Stat3由IL-17激活,参与肿瘤的发展
Stat3激活肿瘤细胞和肿瘤相关炎症细胞在肿瘤进展中起着关键的作用,扩大肿瘤生存和肿瘤血管生成和抑制抗肿瘤免疫
31日 ]。之前的论文表明,IL-17表达呈正相关,Stat3活动日益增长的肿瘤(
13 ]。在我们的实验中,在B16转椅肿瘤从野生型和IL-17 Stat3活动−−/ 老鼠被磷酸化Stat3的免疫荧光染色检测(p-Stat3)。我们发现p-Stat3水平降低在IL-17 B16转椅肿瘤−−/ 老鼠和反
γ
δ 细胞治疗野生型小鼠,与野生型相比控制(图
5(一个) )。我们下一个测试是否Stat3抑制剂对肿瘤细胞B16转椅WP1066显示抗癌活性。我们发现在野生型老鼠B16-F10接种肿瘤的大小与治疗显著降低Stat3抑制剂WP1066(图
5 (b) )。细胞增殖和血管的数量和CD11b的百分比+ Gr-1+ MDSCs也显著减少肿瘤组织从WP1066对待野生型小鼠与野生型小鼠相比,没有治疗(数字
5 (c) - - - - - -
5 (e) )。
IL-17促进Stat3激活。(一)表示p-Stat3蛋白质含量(通过免疫印迹分析)在B16转椅WT的肿瘤组织,WT +反
γ
δ 细胞受体,IL-17−−/ 组(
n
=
5
)。(b)肿瘤生长在B16转椅带有野生型老鼠注射通过口服填喂法WP1066 40毫克/公斤每天一次(5天,2天)(
n
=
5
)。(c) PCNA的数量+ 从B16-F10肿瘤细胞在肿瘤组织野生型小鼠接种后2周(
n
=
5
)。(d) CD11b+ Gr-1+ MDSCs B16-F10肿瘤的野生型小鼠的肿瘤样本中(
n
=
5
)。(e)的肿瘤组织的血管数量B16-F10带有野生型小鼠(
n
=
5
)。肿瘤大小的数据显示意味着±SEM和代表三个独立的实验。
P
*
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
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(d)
![]()
(e)
![]()
3.6。通过一个IL-6-Dependent IL-17激活Stat3机制
il - 6是一个Stat3活化剂和在不同癌症[升高
32 ]。因此我们确定il - 6介导IL-17-driven Stat3激活肿瘤设置。结果表明,IL-17刺激肿瘤细胞il - 6生产B16转椅
在体外 (数据
6(一) - - - - - -
6 (b) )。然后我们测试通过肿瘤IL-17是否影响il - 6生产
在活的有机体内 。刚收获从野生型小鼠B16转椅肿瘤细胞产生相对高水平的il - 6,这是减少IL-17缺陷(图
6 (c) )。在我们的进一步研究中,野生型小鼠与肿瘤细胞B16转椅的挑战,其次是治疗IL-6-neutralizing抗体或控制老鼠免疫球蛋白。结果表明,管理anti-IL-6马伯但不是鼠免疫球蛋白抗体显著抑制肿瘤的生长和p-Stat3表达野生型老鼠。额外的管理重组il - 6成B16-F10肿瘤IL-17−−/ 老鼠导致肿瘤大小和p-Stat3表达明显增加,而其他重组IL-17管理到B16-F10带有野生型老鼠anti-IL-6马伯处理没有显著改变肿瘤的生长和p-Stat3表达式(数字
6 (d) - - - - - -
6 (e) )。
IL-17激活Stat3在肿瘤依赖il - 6生产。(a) il - 6水平B16转椅肿瘤细胞治疗24小时与重组IL-17评估定量实时PCR。(b) il - 6水平B16转椅肿瘤细胞治疗24小时与重组IL-17评估ELISA。(c) Signal-cell悬浮液由B16转椅肿瘤WT、WT +反
γ
δ 细胞受体,IL-17−−/ 组织培养
在体外 一夜之间;上层清液被收集和化验的il - 6水平(
n
=
5
)。(d)在B16转椅肿瘤细胞接种小鼠肿瘤生长WT + Rat-IgG WT + anti-IL-6 WT + anti-IL-6 + Ad-IL-17 IL-17−−/ + Ad-GFP, IL-17−−/ + Ad-IL-6组(
n
=
5
)。(e)指示p-Stat3蛋白质含量(通过免疫印迹分析)在B16转椅肿瘤组织从WT + Rat-IgG WT + anti-IL-6 WT + anti-IL-6 + Ad-IL-17 IL-17−−/ + Ad-GFP, IL-17−−/ + Ad-IL-6组。肿瘤大小的数据显示意味着±SEM和代表三个独立的实验。
P
*
<
0.05
。NS =不显著。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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4所示。讨论
本研究揭示了一个重要角色在黑色素瘤的发展。Hmgb1-IL-23-IL-17-IL-6-Stat3轴Hmgb1刺激生产IL-23 RAGE-dependent的方式。IL-23促进IL-17主要由的表达
γ
δ T细胞。通过il - 6感应IL-17然后促进肿瘤的生长,进而激活Stat3在肿瘤。
IL-17之间充当桥梁的适应性和先天的基因表达程序的豁免通过强大的感应典型的炎症反应,免疫反应过程中提供一个独特的位置(
9 ]。最近,它已被证明,IL-17是由不同的包括CD4 t细胞亚群+ CD8 T细胞,+ T细胞,
γ
δ T细胞和中性粒细胞
5 ]。在我们的实验中,我们发现高浓度的IL-17在黑色素瘤肿瘤组织,和小CD4的数量+ 和CD8+ T细胞产生IL-17, IL-17-producing得多
γ
δ T细胞在肿瘤组织。因此,我们的发现提供了明确的证据表明,
γ
δ T细胞是主要IL-17-producing淋巴细胞黑色素瘤B16转椅的子集。
IL-17在肿瘤生长的作用是有争议的,尽管它已经深入调查,和机制还不能很好地解决。一些出版物提出IL-17的角色在促进肿瘤生长
7 ,
11 ,
33 ]。然而,最近的一篇论文显示,肿瘤生长在IL-17增加−−/ 老鼠MC38肉瘤肿瘤系统[
34 ]。可能IL-17可能有不同的角色在不同的肿瘤和肿瘤模型。在我们的实验中,我们发现IL-17促进黑色素瘤B16转椅增长,而封锁IL-17抑制肿瘤的生长。IL-17促进白介素感应和Stat3激活。治疗的Stat3抑制剂WP1066 B16-F10肿瘤细胞接种野生型老鼠导致减少增殖细胞,减少血管,和低CD11b百分比+ Gr-1+ MDSCs。在进一步的研究中,我们发现额外的管理重组il - 6成B16-F10带有IL-17−−/ 老鼠导致肿瘤大小和p-Stat3表达明显增加,而其他重组IL-17管理到B16-F10带有野生型老鼠anti-IL-6马伯处理没有显著改变肿瘤的生长和p-Stat3表达式。符合我们的发现,先前的论文表明,IL-17诱导il - 6生产由肿瘤细胞和基质细胞,进而激活Stat3 (
13 ]。这些数据表明,il - 6可能是下游IL-17的目标,和IL-17激活IL-6-dependent Stat3在肿瘤。
IL-23 heterodimeric细胞因子,由连杆的p40 p19亚基,刺激t细胞的分化和功能连接先天和适应性免疫系统(
35 ]。IL-23已成为一个新的球员在促进肿瘤的生长和发展
36 ]。最近的报告表明,IL-23p19−−/ 老鼠非常抵抗皮肤乳头瘤、纤维肉瘤、和三种不同的模型实验肿瘤转移(
37 ]。IL-23 / IL-17轴也被报道参与自身免疫疾病,缺血再灌注损伤和癌症
38 - - - - - -
40 ]。我们的结果表明,IL-23p19 IL-23p40 mRNA表达显著增加黑色素瘤肿瘤组织,和损耗IL-23导致减少增殖细胞和血管,减少CD11b百分比+ Gr-1+ MDSCs,抑制IL-17表达式。这些数据表明,IL-23是黑色素瘤的发展和必不可少的奥林匹克教育一代IL-17。
Hmgb1,一个高度保守的核蛋白质,作为炎症和细胞损伤的早期中介和扮演一个关键的角色在许多致病状态包括癌症。Hmgb1被观察到的高表达在某些主要肿瘤包括黑色素瘤和结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(
41 ]。越来越多的证据表明,主要信号通路被激活Hmgb1的相互作用及其受体的愤怒。这个途径的重要性
在活的有机体内 被封锁的观察表明Hmgb1 /愤怒交互抑制肿瘤的生长。和相关的机制是降低il - 6水平(
42 ]。我们的实验表明,Hmgb1及其受体的表达愤怒是增加黑色素瘤肿瘤组织。封锁Hmgb1-RAGE通路抑制黑色素瘤肿瘤生长和减少生产IL-23和IL-17。此外,重组鼠标IL-23政府废除了IL-17表达减少,减少肿瘤大小Hmgb1抑制剂引起的。这表明Hmgb1-RAGE途径导致分泌IL-17依赖IL-23生产然后促进黑色素瘤肿瘤的生长。报告Kortylewski等人表示,IL-23调节性T细胞的免疫抑制活性增强肿瘤微环境内,部分通过IL-23-dependent Stat3激活(
43 ]。野等人此外,最近的研究表明,Hmgb1增强抑制性调节性T细胞的功能通过RAGE-mediated机制和有限的数量和活动传统的T细胞(
44 ]。这些数据表明,Hmgb1-IL-23-IL-17-IL-6-Stat3轴在黑色素瘤肿瘤发展中起着举足轻重的作用在一个小鼠模型,和阻止这个轴的任何部分将减弱黑色素瘤肿瘤的生长。
总之,我们的研究提供了证据,Hmgb1-RAGE途径刺激生产IL-23促进表达IL-17主要是生成的
γ
δ T细胞。IL-17然后通过Stat3激活促进肿瘤生长依赖白介素感应。虽然还需要进一步的调查来充分说明精确的分子和细胞机制参与免疫调节,Hmgb1-IL-23-IL-17-IL-6-Stat3轴导致肿瘤生长在黑色素瘤的小鼠模型。