心肌梗死 炎症介质 1466 - 1861 0962 - 9351 Hindawi出版公司 548073年 10.1155 / 2013/548073 548073年 研究文章 IL-21调节释放促炎细胞因子在LPS-Stimulated巨噬细胞通过不同的信号通路 李 苏南 1 王 魏 1 傅 Shou-peng 1 王 剑法 1、2 刘 红梅 1 谢 鄯善 1 刘 Bing-run 1 李 杨 1 Lv Qing-kang 1 李 Zhi-qiang 1 雪 经 1 黄 Bing-xu 1 陈 魏 1 刘 Ju-xiong 1 Denizot 伊夫 1 兽医学院 吉林大学 长春130062 中国 jlu.edu.cn 2 动物科学学院和兽医 黑龙江八一农业大学 163319年大庆 中国 hlau.cn 2013年 26 12 2013年 2013年 21 09年 2013年 19 11 2013年 19 11 2013年 2013年 版权©2013年苏南李et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

本研究的目的是探讨在LPS-induced IL-21小鼠腹腔巨噬细胞的抗炎作用。结果表明,IL-21显著抑制LPS-induced mRNA的表达il - 1 β肿瘤坏死因子- α,在巨噬细胞il - 6,但是干扰素- γil - 10, CCL5或CXCL2。ELISA分析表明,IL-21也抑制TNF - LPS-induced生产 α上层清液和il - 6在文化。免疫印迹分析表明,IL-21明显抑制ERK和我 κB α磷酸化和NF - κB易位LPS-stimulated巨噬细胞,但它增加了STAT3磷酸化。流仪和免疫印迹分析表明,M1 IL-21减少巨噬细胞表面标记的CD86的表达,进气阀打开,TLR4 LPS-stimulated细胞。结果表明,IL-21降低il - 6和TNF - α生产通过抑制ERK的磷酸化和易位的NF - κB和促进从M1, M2巨噬细胞表型转变CD86的表达减少,进气阀打开,TLR4和通过增加STAT3磷酸化在LPS-stimulated细胞。

 1。介绍

Interleukin-21 CD4 (IL-21)是由激活+T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)和卵泡辅助T细胞。IL-21受体发现于2000年作为一个孤儿受体,首先表示作为小说NILR白介素受体和现在IL-21R [ 1, 2]。IL-21受体表达CD4检测到+CD8 T细胞,+T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突细胞(dc) [ 1- - - - - - 6),这表明IL-21有广泛的功能。此外,IL-21受体家族的成员共享的受体 γ链( γc)。类似于另一个 γc家族细胞因子,IL-21激活Jak1和Jak3 [ 1, 7, 8),和弱激活Stat5蛋白( 9]。最重要的STAT蛋白Stat3似乎IL-21信号。此外,phosphoinositol 3-kinase / Akt (PI3K / Akt)和Ras / MAP激酶(MAPK)通路也有助于IL-21信号( 10]。IL-21显然也对B细胞具有重要作用,T细胞、NK T细胞。例如,IL-21可以增强anti-CD40-induced人类b细胞增殖,但它能抑制增殖anti-IgM和il - 4 ( 2),可以提高NK T细胞的增殖反应 在体外与anti-CD3刺激,但只有当结合2或IL-15 [ 11]。

巨噬细胞是重要的先天免疫细胞座落在人体组织内,在那里他们接收和处理外国材料,死细胞,碎片和招募更多的巨噬细胞在炎症反应的信号。他们是高度异质的细胞可以迅速改变其功能以应对局部微环境信号(包括感染和损伤)。激活巨噬细胞不同显示不同的功能表型( 12- - - - - - 14]。巨噬细胞刺激与toll样受体(TLR)配体,如脂多糖(LPS)和/或干扰素- γ激活巨噬细胞,称为古典(M1巨噬细胞) 12- - - - - - 14),而激活等Th2细胞因子il - 4和IL-13生成或者激活巨噬细胞(M2巨噬细胞) 12- - - - - - 15]。M1巨噬细胞调节宿主的防御各种细菌,原生动物,在抗肿瘤免疫和病毒的作用。M2巨噬细胞有抗炎功能和调节伤口愈合。最重要的是,M1和M2表型分化可能不稳定的子集以同样的方式,例如,Th1、Th2细胞。极化激活的巨噬细胞在转录水平[一直得到广泛的研究 12]。NF - κB AP-1 PU.1 CCAAT / enhancer-binding蛋白质 α(C / EBP - α),IFN-regulatory因子5 (IRF5)已被证明调解M1 TLR配体激活。

有限合伙人是一个主要组件的革兰氏阴性细菌外膜和刺激宿主免疫反应在交互模式识别受体TLR在宿主细胞表达。LPS激活NF - κB和MAPK的家庭,至少分为三个部分:细胞外signal-regulated激酶(erk) c-Jun n端激酶(物),和p38 MAPK,已与免疫细胞的释放细胞毒性等因素诱导没有合酶(间接宾语),环氧合酶(COX) 2,促炎细胞因子如TNF - α,il - 1 β,il - 6 ( 12- - - - - - 14]。IL-21据报道在免疫反应有重要作用。然而,几乎没有信息是否IL-21 LPS-induced巨噬细胞能够发挥抗炎作用。

本研究旨在探讨抗炎作用和机制的IL-21 LPS-induced在小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应。我们研究了mRNA表达蛋白质的分泌细胞因子和趋化因子的活动两个信号通路,MAPKs和NF - κB,被激活的TLR4和负责调节细胞内的促炎细胞因子的分泌。此外,我们还研究了M1巨噬细胞表面标记如CD86的表达,进气阀打开,TLR4和磷酸化STAT3的确认IL-21能否影响人口LPS-stimulated M1巨噬细胞的细胞。

 2。材料和方法 2.1。动物

雌性Balb / c小鼠(在18到22岁的g, 6 - 8周)购买实验动物中心的吉林大学白求恩医学院(吉林,中国)。老鼠被安置在恒定的温度和湿度下12小时的光暗周期和得到免费的食物和水。所有程序都是通过保护脊椎动物用于实验和其他科学目的。

 2.2。试剂

重组小鼠IL-21从PEPROTECH购买,脂多糖(LPS, 大肠杆菌055:B5巯乙酸)和肉汤买来西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。RPMI 1640胎牛血清(的边后卫)试剂盒试剂,Alexa萤石488膜联蛋白V /死亡细胞凋亡工具包获得从英杰公司(美国卡尔斯巴德)。小鼠肿瘤坏死因子- α,il - 1 β,和il - 6的分泌酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和Alexa萤石488 anti-mouse CD86, PE-Rat IgG2b,和PE-anti-mouse /人类CD11b抗体购自Biolegend(美国CA)。TLR4抗体,phospho-JNK(刺- 183 /酪氨酸- 185),物,phospho-p38 MAPK(刺- 180 /酪氨酸- 182),p38 MAPK, phospho-STAT3, STAT3, phospho-p44/42 ERK1/2, p44/42 ERK1/2, phospho-I κB - α(Ser 32),和我 κB - α从细胞信号技术,购买公司(贝弗利,MA)。NF -抗体 κ增殖细胞核抗原,B p65,山羊anti-rabbit IgG-HRP,兔抗体IgG-HRP,进气阀打开,肌动蛋白(-)购买的圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。

 2.3。细胞培养

小鼠腹腔注射4毫升的3%巯乙酸误事。四天后,老鼠被牺牲了。腹膜巨噬细胞被孤立的腹膜腔灌洗RPMI 1640补充10%胎牛血清和离心收集的。细胞被培养在RPMI 1640的密度 1 × 10 7 在60 mm文化菜或细胞/毫升 1 × 10 6 在24-well组织培养板补充10%胎牛血清,1%青霉素和链霉素37°C,和5%的公司2孵化器。两个小时后,不依从细胞被丢弃。剩下的贴壁细胞培养过夜直到他们用于实验。在所有的实验中,巨噬细胞与IL-21孵化(100 ng / mL)和/或有限合伙人(100 ng / mL)不同的时间点。

 2.4。实时rt - pcr

巨噬细胞( 1 × 10 6 /)与IL-21孵化和/或有限合伙人对3 h, 6小时、24小时。从细胞总RNA分离使用试剂盒试剂根据制造商的协议。各种基因的mRNA水平量化使用SYBR绿色QuantiTect rt - pcr试剂盒(罗氏、南旧金山、钙、美国)。GAPDH是作为内生参考。数据分析使用相对标准曲线法根据制造商的协议。每个基因的平均值GAPDH正常化后时间点显示最高的表达被用作校准器来确定IL-21R的相对水平, γc,肿瘤坏死因子- α、il - 10、il - 1 β、白介素、干扰素- γ伊诺,CXCL2、TLR4和CCL5在不同的时间点。此外,PCR产品解决1.5%的琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色。检测基因的引物序列如下:

基因 序列
GAPDH-Forward底漆 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′
GAPDH-Reverse底漆 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′
IL-21R-Forward底漆 5′-ACAACAACATCAGCCTTACA-3′
IL-21R-Reverse底漆 5′-AACAGACCAAATCCCAACA-3′
γc-Forward底漆 5′-GTCGACAGAGCAAGCACCATGTTGAAACTA-3′
γc-Reverse底漆 5′-GGATCCT GGGATCACAAGATTCTGTAGGTT-3′
il - 1 β正向引物 5′-CTCGGCCAAGACAGGTCGCTC-3′
il - 1 β反向引物 5′-CCCCCACACGTTGACAGCTAGG-3′
iNOS-Forward底漆 5′-GAACTGTAGCACAGCACAGGAAAT-3′
iNOS-Reverse底漆 5′-CGTACCGGATGAGCTGTGAAT-3′
干扰素- γ正向引物 5′-TGAGACAATGAACGCTAC-3′
干扰素- γ反向引物 5′-TTCCACATCTATGCCACT-3′
CXCL2-Forward底漆 5′-CACCAACCACCAGGCTAC-3′
CXCL2-Reverse底漆 5′-CTTCAGGGTCAAGGCAAA-3′
CCL5-Forward底漆 5′-ACCACTCCCTGCTGCTTT-3′
CCL5-Reverse底漆 5′-ACACTTGGCGGTTCCTTC-3′
肿瘤坏死因子- α正向引物 5′-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3′
肿瘤坏死因子- α反向引物 5′-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3′
IL-6-Forward底漆 5′-TTCTTGGGACTGATGCTG-3′
IL-6-Reverse底漆 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT-3′
IL-10-Forward底漆 5′-GGAGGGGTTCTTCCTTGGGA-3′
IL-10-Reverse底漆 5′-GTTTTCAGGGATGAAGCGGC-3′
TLR4-Forward底漆 5′-GAAACGGCAACTTGGACCTG-3′
TLR4-Reverse底漆 5′-ATGTGTTCCATGGGCTCTCG-3′

2.5。ELISA分析

巨噬细胞( 1 × 10 6 /)与IL-21孵化和/或有限合伙人6 h, 12小时和24小时。浮在表面的游离随后被用于TNF - α、il - 10、il - 1 β使用鼠标,il - 6化验酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒根据制造商的指示。

 2.6。免疫印迹分析

巨噬细胞(1×107/ 60毫米盘)与IL-21孵化和/或有限合伙人为5分钟,20分钟,60分钟。这些细胞被收集和冷PBS洗两次。悬架是混合缓冲(10毫米玫瑰,pH值7.5,10毫米氯化钾,EGTA 0.1毫米,0.1毫米EDTA,德勤1毫米,0.5毫米PMSF, 5 μg / mL抑肽酶,5 μ10 g / mL抑肽素, μg / mL亮抑酶肽)和细胞溶解由三个冻融循环。胞质分数是通过在12000×g离心20分钟在4°C。丸re-suspended在缓冲区B(20毫米玫瑰,pH值7.5,0.4 M氯化钠,EGTA 1毫米,1毫米EDTA, 1毫米德勤,PMSF 1毫米,5 μg / mL抑肽酶,5 μ10 g / mL抑肽素, μ在冰上g / mL亮抑酶肽)40分钟和离心机14000 g×20分钟在4°C。得到的上层清液作为可溶性核分数。在一些实验中,细胞悬液细胞溶解,溶解缓冲区根据制造商的指示(Beyotime、江苏、中国)。蛋白质含量测定用BCA蛋白检测试剂。蛋白(20 - 30 μg)受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳在10%,转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜与甘氨酸转移缓冲(192毫米甘氨酸,25毫米Tris-HCl (pH值8.8),甲醇20% (v / v))。后阻断特异性的网站屏蔽解决方案(5% (wt /卷)脱脂奶粉),膜在一夜之间被孵化与特定的主要抗体在4°C。细胞膜是培养一个额外的60分钟peroxidase-conjugated二级抗体室温。immunoactive蛋白被发现使用一个增强化学发光(ECL)免疫印迹检测设备。

 2.7。流式细胞术

细胞被播种到6-well板的密度 1 × 10 6 每口井的细胞和治疗各种浓度的IL-21 (100 ng / mL)。24小时后,媒体吸气和细胞与PBS洗两次。然后这些细胞被沾FITC-conjugated膜联蛋白V和propidium碘(π)使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备根据制造商的建议(Calbiochem)。流式细胞术(美国BD生物科学)是用来确定凋亡细胞的比例。

此外,M1 CD11b巨噬细胞表面标记和CD86通过流式细胞仪测定。这些细胞被收获,水洗,孵化和Alexa萤石488 anti-mouse CD86抗体和聚乙烯anti-mouse /人类CD11b抗体治疗后30分钟IL-21和/或有限合伙人24 h。流式细胞术(美国BD生物科学)是用来确定CD11b的人口+CD86+细胞。

 2.8。统计分析

日期进行了分析使用GraphPad棱镜5 (GraphPad InStat软件,圣地亚哥,美国)。组间比较用方差分析Dunnett紧随其后的测试。数据是平均数±标准差。 P 值0.05或更少被认为是统计上的显著差异( P # < 0.0 0 1 从NT组明显不同; P * < 0.05 , P * * < 0.01 相比之下,LPS组)。

 3所示。结果 3.1。IL-21诱发IL-21R mRNA表达的老鼠巨噬细胞

在我们的研究中,超过97%的人口粘附细胞巨噬细胞是由特定的表面标记CD11b通过流式细胞术(图 1(一))。IL-21 IL-21R +功能受体 γc ( 6, 7]。研究IL-21的生物效应,我们首先评估IL-21R和的表达 γ在巨噬细胞通过rt - pcr c。令人惊讶的是,IL-21R表达增加,仅靠IL-21诱导,而对照组和LPS组(数据 1 (b)和 1 (c))。然而, γc表达式是高的巨噬细胞,在治疗后没有发现显著差异与IL-21 6 h(数据和/或有限合伙人 1 (b)和 1 (d))。

影响的IL-21 LPS-induced IL-21R和 γc mRNA表达小鼠腹腔巨噬细胞。小鼠腹腔巨噬细胞与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 6 h。巨噬细胞被染色和IgG2b CD11b抗体(a)。总RNA分离和分析实时rt - pcr对IL-21R (c) γIL-21R和c (d) γc表达式是内生控制GAPDH规范化。结果表示为平均数±标准差为每个组由三个独立的实验。

 3.2。IL-21抑制LPS-Induced巨噬细胞的细胞因子和趋化因子mRNA表达

传统的方法研究巨噬细胞激活 在体外与LPS刺激细胞,然后测量效应细胞因子和趋化因子生产和基因表达的变化。因此,我们调查是否IL-21治疗抑制细胞因子和趋化因子的基因表达。结果表明,治疗与有限合伙人仅导致巨噬细胞细胞因子的表达与对照组相比显著增加( P < 0.01 )。然而,IL-21显著抑制TNF - LPS-induced表达式 α、il - 6和il - 1 β相比LPS组( P < 0.05 或 P < 0.01 ,数据 2(一个)- - - - - - 2 (c)),但il - 10的表达、CCL5干扰素- γ,CXCL2被激活的巨噬细胞分泌,不是由IL-21抑制(数字 2 (d)- - - - - - 2 (g))。

影响的IL-21 LPS-induced小鼠腹腔巨噬细胞的细胞因子和趋化因子mRNA表达。巨噬细胞与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 3 h, 6小时、24小时。总RNA分离和分析实时RT - PCR对TNF - α(一)、il - 6 (b), il - 1 β(c)、il - 10 (d)、CCL5 (e)、干扰素- γ(f)和CXCL2 (g) mRNA的表达。所有这些内生控制GAPDH表达式被规范化。结果表示为平均数±标准差为每个组由三个独立的实验。 P # < 0.001 从NT组明显不同; P * < 0.05 , P * * < 0.01 相比之下,LPS组。

 3.3。IL-21 LPS-Induced生产降低TNF -α<斜体> < /斜体>和细胞培养上清液中il - 6

巨噬细胞激活是伴随着细胞因子的分泌。在这里,我们表明,IL-21治疗抑制TNF - LPS-induced mRNA的表达 α、il - 6和il - 1 β。接下来,在巨噬细胞的文化上层清液浓度由夹心ELISA测定。治疗与有限合伙人仅导致巨噬细胞显著增加细胞因子生产相比NT组( P < 0.001 )。然而,IL-21治疗显著地抑制TNF - LPS-induced生产 α和il - 6与LPS组( P < 0.05 ,数据 3(一个)和 3 (b))。的分泌il - 1 β细胞培养上清液中不能被检测到。

IL-21 LPS-induced肿瘤坏死因子——的影响 α和在小鼠腹腔巨噬细胞il - 6分泌文化上层的巨噬细胞与IL-21孵化(100 ng / mL)有限合伙人的存在与否(100 ng / mL) 6 h, 12 h和24 h。肿瘤坏死因子-的浓度 α(a)和il - 6 (b)由ELISA测定。价值观代表了平均数±标准差的三个独立的实验。 P # < 0.001 从NT组明显不同; P * < 0.05 , P * * < 0.01 相比之下,LPS组。

 3.4。IL-21明显抑制ERK的磷酸化LPS-Induced巨噬细胞

MAPK通路中起关键作用的调节细胞生长和分化和控制细胞对细胞因子和胁迫的响应。促炎介质(如TNF的表达 α,il - 1 β和il - 6)已被证明是调制LPS-induced巨噬细胞MAPK通路。检查是否抑制炎症反应的IL-21还通过MAPK信号通路,介导胞质蛋白提取和p38 MAPK的磷酸化,ERK1/2,物被免疫印迹检测。结果表明,IL-21触发激活ERK1/2在20分钟,和LPS刺激显著增加ERK1/2的磷酸化,p38 MAPK, 5点物,20日分别和60分钟。然而,IL-21明显抑制ERK的磷酸化LPS-induced巨噬细胞在20分钟和60分钟( P < 0.01 ,数据 4(一)和 4(b))。IL-21弱抑制磷酸化p38 MAPK和物在LPS-induced巨噬细胞(图5分钟 4(一), 4(c) 4(d))。然而,的水平non-phosphorylated MAPK同种型没有群体之间显著的差别。

影响的IL-21 LPS-induced MAPKs信号途径在小鼠腹腔巨噬细胞。巨噬细胞( 5 × 10 6 )与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 5分钟,20分钟,60分钟。胞质蛋白免疫印迹分析的ERK1/2, p38 MAPK和物磷酸化。肌动蛋白的检测是估计每个车道protein-loading控制。价值观代表了平均数±标准差的三个独立的实验。 P * < 0.05 , P * * < 0.01 相比之下,LPS组。

 3.5。IL-21抑制我<斜体>κB < /斜体> <斜体>α< /斜体>磷酸化和NF -κ<斜体> < /斜体> B易位LPS-Induced巨噬细胞

NF -的激活 κB是不可或缺的促炎介质如肿瘤坏死因子的激活 α、il - 6和il - 1 β在LPS-stimulated巨噬细胞。NF - κB / Rel转录因子存在于细胞溶质的活性抑制包裹着我 κB蛋白( 16- - - - - - 18]。我通过磷酸化激活发生 κB - α在Ser32 Ser36紧随其后proteasome-mediated退化,导致释放和核易位的活跃NF - κB ( 16- - - - - - 18]。因此,NF -的激活 κB在巨噬细胞通过测量评估我的磷酸化程度 κB - α蛋白质。结果表明,我的磷酸化 κB - α在LPS-induced增加巨噬细胞,但它明显抑制IL-21在60分钟( P < 0.01 ,数据 5(一个)和 5 (b))。因为NF - κB必须转移到细胞核一旦发布了其抑制剂激活基因转录,核蛋白质提取和NF -评估 κB易位。结果表明,NF - κB易位中检测出的核蛋白质LPS-induced巨噬细胞开始5分钟,可检测到60分钟。然而,IL-21显著抑制LPS-induced NF - κB易位( P < 0.01 ,数据 5 (c)和 5 (d))。

IL-21 LPS-induced NF -的影响 κB信号途径在小鼠腹腔巨噬细胞。巨噬细胞( 5 × 10 6 )与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 5分钟,20分钟,60分钟。核和胞质蛋白从巨噬细胞被免疫印迹分析与特定的抗体。肌动蛋白和PCNA检测估计为每个车道protein-loading控制。价值观代表了平均数±标准差的三个独立的实验。 P * < 0.05 , P * * < 0.01 相比之下,LPS组。

 3.6。IL-21阻止LPS-Induced巨噬细胞的凋亡

IL-21 (1 μg / mL)据报道,诱导细胞凋亡在B淋巴瘤细胞系( 19]。为了评估是否这个细胞凋亡与细胞因子减少生产,巨噬细胞(1×106)沾FITC-conjugated膜联蛋白V和propidium碘(PI)与IL-21被培养24小时后和/或有限合伙人。结果表明LPS促进细胞凋亡与NT组( P < 0.001 )。然而,IL-21显然阻止LPS-induced巨噬细胞凋亡( P < 0.05 ,图 6)。

IL-21 LPS-induced细胞凋亡在小鼠腹腔巨噬细胞的影响。巨噬细胞( 1 × 10 6 )与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 24 h,沾FITC-conjugated膜联蛋白V和propidium碘(π)。价值观代表了平均数±标准差的三个独立的实验。 P * < 0.05 相比之下,LPS组。

 3.7。IL-21 LPS-Induced巨噬细胞M1巨噬细胞的数量减少

M1和M2表型分化可能不稳定的子集以同样的方式,例如,Th1、Th2细胞。普遍的观点是,巨噬细胞可以进行动态不同的功能状态之间的转换信号驱动的组织微环境,包括细胞因子,生长因子,microorganism-associated分子模式。为了确认是否IL-21可以促进从M1对M2表型转变,M1巨噬细胞表面标记CD11b和CD86评估通过流式细胞术( 12]。超过92.88%的人口粘附细胞M1巨噬细胞是由特定的表面标记CD11b和CD86染色后孵化有限合伙人。IL-21不会影响CD11b人口+CD86+细胞相比NT组。然而,IL-21 CD11b的人口减少+CD86+细胞LPS-stimulated细胞相比LPS组( P < 0.05 ,数据 7(一)和 7 (b))。

影响的IL-21 LPS-induced在小鼠腹腔巨噬细胞细胞表面标记物的表达。巨噬细胞( 1 × 10 6 )与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 24 h。(a)和(b)控制策略用于识别M1巨噬细胞存在于基于表面分子CD11b和CD86腹膜巨噬细胞。总蛋白(c) - (e)巨噬细胞被免疫印迹分析与特定的抗体。肌动蛋白的检测是估计每个车道protein-loading控制。价值观代表了平均数±标准差的三个独立的实验。 P * < 0.05 , P * * < 0.01 相比之下,LPS组。

M1-activation标记的产生一氧化氮(NO)在许多生理过程中起着至关重要的作用,尤其是在宿主先天免疫系统抑制微生物生长,肿瘤细胞生长,肿瘤转移( 20.]。的释放是由进气阀打开。伊诺的表达是评估确认是否IL-21可以影响的人口在LPS-induced巨噬细胞M1巨噬细胞。结果表明,伊诺的信使rna表达水平明显增加仅被LPS刺激后,但IL-21治疗显著地抑制LPS-induced伊诺mRNA和蛋白表达( P < 0.01 ,数据 7 (c)和 7 (d))。此外,IL-21也抑制TLR4的mRNA和蛋白表达,另一个M1巨噬细胞的表面标志,LPS-induced巨噬细胞( P < 0.05 ,数据 7 (d)和 7 (e))。

 3.8。IL-21 LPS-Induced STAT3磷酸化增加巨噬细胞

IL-21激活Jak1和Jak3。然而,最重要的STAT蛋白Stat3似乎IL-21信号。由于优势STAT3和STAT6激活结果在M2巨噬细胞极化 21),我们也评估了STAT3磷酸化LPS-induced巨噬细胞。结果表明,治疗IL-21单独触发的磷酸化STAT3在5分钟,20分钟。此外,IL-21明显增加的磷酸化STAT3在5分钟(LPS-induced巨噬细胞 P < 0 。 005年 ,图 8)。

IL-21对LPS-induced STAT3信号通路在小鼠腹腔巨噬细胞。巨噬细胞( 5 × 10 6 )与IL-21孵化(100 ng / mL)存在与否的有限合伙人(100 ng / mL) 5分钟,20分钟,60分钟。巨噬细胞胞质蛋白通过与特定的抗体免疫印迹分析。肌动蛋白的检测是估计每个车道protein-loading控制。价值观代表了平均数±标准差的三个独立的实验。 P * < 0.05 相比之下,LPS组。

 4所示。讨论

IL-21 CD4细胞产生的+T细胞和NK T细胞,先天和适应性免疫反应多效性的影响,如提高淋巴细胞的增殖,提高CD8细胞毒性+T细胞和NK细胞,促进B细胞的分化成浆细胞,抑制dc的抗原递呈功能,proapoptotic B细胞和NK细胞的信号。生物IL-21活动是由一个特定的IL-21R, IL-21R链结构相关,与常见的 γc信号转导( 22, 23]。腹膜腔是一个独特的隔间中各种免疫细胞和巨噬细胞的一般居住功能研究。在这项研究中,我们第一次评估IL-21R和的表达 γc在巨噬细胞。如图 1,IL-21R是从小鼠巨噬细胞表达的,和它的表达与IL-21调节的刺激。此外,的表达水平 γc mRNA没有改变被IL-21和/或LPS刺激后。

趋化因子和肿瘤坏死因子等细胞因子的产生 α、il - 6和il - 1 β通过激活巨噬细胞在不同的生理过程中起着至关重要的作用,尤其是在宿主先天免疫系统抑制微生物生长,肿瘤细胞生长和肿瘤转移。肿瘤坏死因子- α是最早的和主要的内源性中介。肿瘤坏死因子-的重要表达 α已被证明在许多类型的炎症过程。细胞因子il - 6是一个重要的中介发布在许多免疫和炎症反应 24]。IL-21报道抑制LPS-induced细胞因子在人类生产monocyte-derived DCs ( 25]。在这项研究中,我们已经证明,IL-21R腹膜巨噬细胞中表达。因此,我们假设IL-21有可能直接行动能力巨噬细胞抑制促炎细胞因子和趋化因子生产。为了证实IL-21潜在的抗炎作用 在体外,生产LPS-induced巨噬细胞的细胞因子和趋化因子进行了研究。如图 2,细胞因子和趋化因子mRNA的表达显著增加巨噬细胞在有限合伙人的挑战,和IL-21能够抑制TNF的表达 α、il - 6和il - 1 β3小时、6小时和24小时在LPS-induced巨噬细胞,但不是il - 10, CCL5,干扰素 γ,CXCL2。此外,TNF -的浓度 α、il - 6和il - 1 β在上层清液游离也发现和治疗后显著增加与有限合伙人。如图 3,IL-21能够抑制TNF -的生产 α分别和白介素12 h和24小时。在本文中,我们发现il - 1的mRNA的表达 β,但不是蛋白质分泌,这可能是有关il - 1的成熟 β。在哺乳动物中,inflammasomes由感官NLRs,适配器蛋白质称为ASC, caspase-1蛋白酶,及其活化处理的结果procaspase-1 caspase-1激活,然后pro-IL-1劈开 β和pro-IL-18分泌细胞因子il - 1 β和地震 26, 27]。有限合伙人在这个实验中使用的浓度太低发起inflammasome组装或pro-IL-1灭亡 β生物活性il - 1 β。这些结果表明,IL-21 LPS-induced巨噬细胞具有抗炎作用。

进一步描述的性质抑制IL-21对细胞因子的影响生产,MAPKs和NF - κB信号转导途径,由有限合伙人以及激活TNF - α和il - 1 β在巨噬细胞,检测。首先,我们检查的影响IL-21 p38的磷酸化,兵,和物,已与免疫细胞的释放细胞毒性等因素进气阀打开,cox - 2和促炎细胞因子激活的巨噬细胞( 28, 29日]。如图 4,所有三个家庭的LPS诱导激活MAPKs巨噬细胞在不同的时间点。然而,治疗IL-21明显抑制ERK的磷酸化LPS-induced巨噬细胞。结果表明,IL-21 LPS-induced巨噬细胞可以抑制细胞因子的生产,至少在某种程度上,通过抑制ERK的磷酸化。

在灭活细胞中,NF - κB细胞溶质中局部由于其绑定和我 κ然而,b细胞被激活时,有限合伙人,我 κB我磷酸化 κB激酶和退化。然后释放NF - κB是易位到原子核( 30.),它绑定到特定的DNA序列称为响应元素(重新)和诱导促炎因子的表达 16- - - - - - 18]。诱导基因已知transactivated NF - κB包括,但不限于,TNF - α,il - 1 β、il - 6、引发、干扰素- γ,进气阀打开,CXCL2 CCL5在巨噬细胞 31日]。如图 5结果表明,我的磷酸化 κB α在巨噬细胞诱导后增加了有限合伙人,但它被显著地抑制IL-21 60分钟。此外,NF - κB易位LPS-induced巨噬细胞的细胞核中发现开始5分钟,可检测到60分钟,但这是被IL-21 20分钟和60分钟。这些结果表明,IL-21 LPS-induced巨噬细胞,还可以抑制细胞因子的生产至少部分通过压制我 κB α磷酸化和NF - κB易位。

IL-21 (1 μg / mL)据报道,诱导细胞凋亡在B淋巴瘤细胞系( 19]。因为IL-21的可能性可能促进LPS-induced巨噬细胞的细胞凋亡,细胞凋亡的检测进行确认是否这个凋亡相关细胞因子的减少生产。如图 6,IL-21显然阻止LPS-induced LPS组相比,巨噬细胞凋亡。结果表明,抑制细胞因子的生产不是由细胞凋亡诱导治疗后与IL-21 LPS-induced巨噬细胞。

巨噬细胞极化信号驱动的组织微环境,包括细胞因子,生长因子,microorganism-associated分子模式。至少 在体外LPS-activated巨噬细胞几小时后成为无法激活后大部分的促炎基因引发刺激( 32]。然而,他们保留的能力引起许多其他基因的表达,包括__arg1、Il10, Mrc1 [ 12例如,]。这个改变对二次刺激响应性的状态通常称为内毒素耐受和结果在全球持续开关的基因表达程序从促炎M1签名M2-like消炎表型( 33]。因此,我们评估了从M1, M2表型转变来确认是否与il - 6和TNF -的生产下降 α。巨噬细胞通常是区别于DCs的微分表达式表面制造商如F4/80 CD11b CD18(也称为MAC1)、CD68、Fc受体( 34]。此外,TLR4、CD86和伊诺是重要的M1巨噬细胞表面标记 35]。在这篇文章中,细胞染色CD11b和CD86抗体被认为是M1巨噬细胞。如图 7,IL-21 M1 LPS-induced人口减少巨噬细胞相比,LPS组。此外,IL-21抑制TLR4基因和蛋白质表达和伊诺LPS-stimulated巨噬细胞。优势的STAT3和STAT6激活导致M2巨噬细胞极化,与免疫抑制和肿瘤进展 21]。IL-21激活Jak1和Jak3。此外,最重要的STAT蛋白STAT3似乎IL-21信号。因为IL-21可能促进M2巨噬细胞极化的可能性,我们评估了磷酸化STAT3 LPS-induced巨噬细胞。如图 8,IL-21显然增加了STAT3在LPS-induced巨噬细胞的激活5分钟和20分钟。我们的研究结果表明,IL-21促进从M1, M2巨噬细胞表型转变伊诺的表达减少,CD86和TLR4通过增加STAT3磷酸化在LPS-stimulated细胞。

总之,我们的研究表明,IL-21促进从M1, M2巨噬细胞表型转变伊诺的表达减少,CD86, TLR4和增加STAT3磷酸化LPS-stimulated细胞,并导致减少的磷酸化ERK和NF -易位 κB,从而降低TNF - α和il - 6生产。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。作者仅负责内容和论文的写作。

 作者的贡献

苏南Li Wei Wang Shou-peng傅,剑法王同样贡献了这项工作。

 确认

这项工作受到了国家重点基础研究项目的资助中国(2011 cb100805),长江学者和创新研究团队项目在大学(PCSIRT,没有。IRT1248),中国国家自然科学基金(31072100)。

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