3 t3-l1细胞获得美国类型文化收集(写明ATCC cl - 173)和培养在37°C公司5%₂湿润的空气/ 95%。细胞被维护在杜尔贝科的鹰修改媒介(DMEM)和25毫米玫瑰,1% penicillin-streptomycin (100 U /毫升;100年 μg / mL), 10%小牛血清。融合后的细胞分化2天(0)在含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫),0.25 μ3-isobutyl-1-methylxanthine M地塞米松,0.5毫米,5 μ为48 h g / mL胰岛素;细胞是在10%的边后卫/ DMEM培养72 h的胰岛素。最后10%的边后卫/ DMEM每2天了。

分化后8天,细胞进行预处理在24小时内与介质包含0.1毫米蒜氨酸(西格玛化工有限公司)。相同的细胞培养介质与有限合伙人(100 ng / mL) 1 h在收获之前。培养介质中收集管和存储在−80°C。初步实验研究确定蒜氨酸的浓度在时间进程实验(数据未显示)。

从细胞总RNA分离利用Ultraspec试剂(Biotecx,休斯顿,德克萨斯州,美国)。第一链cDNA reverse-transcribed从0.5 μ总RNA的g采用M-MLV逆转录酶协议(表达载体)。互补脱氧核糖核酸是放大的设计利用的不同对特定的引物 PrimerExpress软件(表 1)。

实时定量PCR反应包含0.2 μ克/ μL reverse-transcribed总RNA, 18岁 μ正向和反向引物,和10 μL智商SYBR绿色SuperMix (Bio-Rad)。PCR与MiniOpticon 48-well板块执行实时PCR系统(Bio-Rad)。量化是由比较循环阈值方法,不变的腺嘌呤phosphoribosyltransferase ( Aprt)基因用于规范化。

获得从3 t3-l1脂肪细胞总蛋白,细胞从不同的治疗均质在50 μL•瑞帕缓冲与10毫米4°C补充钠原钒酸盐,100毫米PMSF和5.4毫克/毫升抑肽酶。不溶性材料被离心分离为30分钟13500 g在4°C。上层清液的蛋白质浓度由布拉德福德的方法决定。蛋白质变性的沸腾(5分钟);然后30 μg解决了sds - page分离胶和10%转移到止动剂PVDF膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。非特异性蛋白结合的PVDF膜降低了预培养1 h 22°C的TBS tween-20(0.1%)和5%牛血清白蛋白(BSA)阻断缓冲区。一夜之间,PVDF膜被孵化在4°C和单克隆抗体总磷酸化ERK1/2(细胞信号和圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),这是稀释1:1000年阻止缓冲区。孵化后,膜被洗5分钟三次TBS tween-20 (0.1%)。这些墨迹随后被孵化与peroxidase-conjugated二级抗体在TBS tween-20 1 h 22°C(0.1%)和5% (w / v)脱脂牛奶。评价蛋白质加载、孵化和reblotted反膜 β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术)。特定的乐队使用EZ-ECL化学发光检测设备(Amersham)和可视化/捕获膜是由接触RX的电影。带强度量化的数量一个软件(Bio-Rad)。

细胞因子和趋化因子测定细胞培养上清液用ELISA技术(Bio-Plex Pro化验;Bio-Rad实验室,Inc .)。检测下限是38个pg / mL il - 6、TNF - 21 pg / mL α,51 MCP-1 pg / mL。数据规范化和排除人工影响不同的细胞密度、总蛋白浓度测定每个好,浮在表面的细胞因子浓度除以蛋白质浓度。每个样本被ELISA以一式三份。值表示为平均值±标准平均误差(SEM) ( n = 6 井被用于每个实验组)。

一个 亩骶22000 65 - mer益生元从Sigma-Genosys集使用图书馆。的杂交实验中,RNA是利用细胞收集的文化。互补脱氧核糖核酸的合成,10 μ克总RNA作为模板,将dUTP-Cy3或dUTP-Cy5和相同数量的标签cDNA杂化22000益生元鼠标数组,如前所述[ 28, 29日]。

数组的采集和量化图像进行ScanArray 4000仪器使用附带的软件ScanArray 4000(帕卡德生物芯片;美国优秀的,MN)。所有图片都被如前所述[ 28, 29日]。在所有情况下,荧光信号从七到十倍的背景信号和背景评估总是立即评估在标记的位置。

微阵列数据分析使用GenArise自由软件。GenArise的目标是识别基因通过计算一个intensity-dependent适合使用微分表达式 z 分数,成功应用和最近报道 28, 29日]。应用这些标准,用的元素 z 分数> 2个标准差(SD)可能差异表达的基因。

表示为均值±SEM的结果。统计分析,GraphPad棱镜软件采用单向方差分析测试应用比较治疗效果。建立了显著差异的Turkey-Kramer测试。的值 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

以前,我们决定施加影响的蒜氨酸浓度检测基因的表达;探测浓度分别为0.1,0.3,0.6,和1.0毫米(数据未显示)。从这个我们选择0.1毫米的最低浓度能够产生一个清晰的效果。

细胞因子il - 6与肥胖与胰岛素抵抗相关的主题,通过地诱导受体激活( 30.]。蒜氨酸预处理后,信使rna的il - 6水平明显降低(图 1(一))。相比之下,TNF -水平 αmRNA显然没有显著影响,虽然略微倾向减少蒜氨酸进行预处理细胞也指出(图 1 (b))。

此外,我们检查MCP-1表达式,因为它是由多种细胞产生,包括脂肪细胞、炎症刺激反应( 31日]。正如预期的那样,我们发现了一个显著增加MCP-1 LPS-treated脂肪细胞中表达。有趣的是,我们又观察到显著减少MCP-1 mRNA水平LPS-stimulated脂肪细胞用蒜氨酸预处理时(图 1 (c))。

此外,我们验证Egr-1的表达,它被描述为诱导细胞因子和激素通过激活MAPK通路,与胰岛素抵抗相关的 32]。再一次,信使rna表达水平明显降低蒜氨酸预处理即使在有限合伙人炎性刺激(图 1 (d))。

以证实这些结果,我们评估这些细胞因子的分泌蛋白质含量和释放到文化媒体由ELISA决定。蛋白质含量检测LPS刺激后,由蒜氨酸显著降低预处理、il - 6的情况下(图所示 2(一个))和Mcp-1(图 2 (d))。此外,我们观察到降低TNF - α水平(图 2 (b)),虽然这是小,没有达到统计学意义。此外,我们检测脂联素水平(图 2 (c)),因为这是一个重要的联盟之间的肥胖和胰岛素抵抗和被认为是一种抗炎蛋白( 33]。对照组的脂肪细胞分泌大量的脂联素(图 2 (c)),这显然是降低LPS刺激。组中使用蒜氨酸,可以观察到略有增加生产这种蛋白质;然而,它不能克服严重减少了由有限合伙人。

自从LPS诱导炎症在脂肪细胞通过ERK1/2 [ 30.)和il - 6和Egr-1细胞内信号传导机制融合在这个通路,我们下了蒜氨酸预处理是否影响ERK1/2磷酸化。LPS刺激能够增加磷酸化的蛋白质含量ERK1/2,和蒜氨酸预处理颠覆了这种效应显著降低这一水平,近达到控制水平(数据 3(一个)和 3 (b))。

考虑到许多其他分子在有限合伙人可以参与炎症效应和抗炎效应的蒜氨酸在这个模型中,我们决定执行一个微阵列分析确定影响其他基因参与。微阵列GeneArise软件的分析后,我们发现,共有22000个基因的微阵列分析,总共有2426个基因(11%)修改他们的表情,用 z 分数2和6.2之间的至少一个执行的三个比较,下列哪是:控制和有限合伙人;控制和蒜氨酸+有限合伙人和有限合伙人和蒜氨酸+有限合伙人。其余没有表现出显著差异表达,获得 z <±2.0的分数。

与对照组比较(nonstimulated脂肪细胞),有限合伙人治疗,有或没有蒜氨酸预处理,显然修改315个基因的表达(上调255和60表达下调基因)两者之间的共同点比较(控制和有限合伙人以及控制和蒜氨酸+ LPS)。当大卫分析软件( 34]在高收敛性,237 315(75%)对应于确定基因,可分为64个基因簇根据功能聚类分析。这个概要文件是完全符合许多先前的报道关于有限合伙人对众多基因的基因表达的影响。达成浓缩得分的集群> 1.5根据大卫分析( 34),以及代表基因的表达显著修改有限合伙人在3 t3-l1分化脂肪细胞,独立于蒜氨酸预处理可以参考表 1 sm(见表1-SM在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2013/381815)。因此,作为第一个结论,这里的315个基因检测所修改的有限合伙人证实的影响有限合伙人也扩大全景关于有限合伙人在分化的脂肪细胞的影响 在体外,包括一些新基因的mRNA表达最可能受有限合伙人炎性刺激。

另一方面,我们发现2108个基因修改的蒜氨酸促炎LPS刺激后行动。其中,125个基因被修改的子群进行比较(54的至少两个调节和71年与一个表达下调 z 分数> 2.0);因此我们可以考虑这些基因的表达由蒜氨酸改性预处理。当大卫分析软件( 34]在高收敛性,100(80%)和确定这些基因分为23个功能集群。这些功能集群可以重整旗鼓分成九个功能类别集群功能明显的相似之处。表2-SM数据可以参考。

根据以往的作品( 28, 29日),我们进一步进行更详细的分析基因达到一个值 z > 2.5的分数(上升或下调)两组之间的比较。我们建议基因拟合这些条件的最大相关性和表达水平是由蒜氨酸改性预处理对促炎的刺激的反应。所有的基因被蒜氨酸改性预处理唯一比较或中位数 z 得分在2.0和2.5之间的被排除在分析之外。high-stringency标准,我们获得28基因调节的蒜氨酸和35个表达下调(全部结果可以参考表3-SM和4-SM)。当个人分析,在调节基因,我们发现最相关的组包括10个基因(36%)和免疫球蛋白和t细胞受体有关。第二个相关包括八国集团比为不同的酶编码基因,最后的第三组八个不同的基因和两个额外的身份不明的基因(表 2)。在蒜氨酸基因表达下调,我们发现一个主要的群体,包括15癌症相关的基因(表 3),除了一群五基因编码的酶,和第三组七个基因与不同的功能。值得注意的是第四组包括10个未知基因,代表29%的蒜氨酸基因表达下调。

因此,我们现在这里的基因表达谱引起LPS刺激后,脂肪细胞接收到一个蒜氨酸预处理。这些结果提供大而清晰的证据支持蒜氨酸行动,这明显逆转有限合伙人的促炎效应,以及执行其他并行效果,因为有一个明确的基因表达谱的转变。

分化脂肪细胞配备能力直接回应先天免疫挑战由革兰氏阴性细菌(有限合伙人 21, 23, 36]。一些研究显示的相关性3 t3-l1脂肪细胞,完全分化 在体外和LPS刺激,作为一个有用的模型测试分子展品抗炎效果,能够调节脂肪组织的炎症状态( 37]。LPS引起诱导il - 6生产、upregulation TLR-2,脂联素受体1和2的差别,对这些 36]。多个信号通路调节LPS诱导il - 6 ( 38, 39]。这些途径包括NF - κB c-JNK ERK、抑制G蛋白和PKC介导的过程,和toll样受体激活相似但不同的信号通路由于他们能够招募不同的适配器蛋白质( 22]。

LPS诱导脂肪细胞的脂解作用通过地和ERK1/2信号( 40]。关于地,这种受体识别有限合伙人作为配体( 41),它是由有限合伙人证明刺激脂肪细胞胰岛素信号变弱刺激NF - κB信号,减少一种蛋白激酶磷酸化,并增加炎症细胞因子基因的表达,如肿瘤坏死因子- α和3 t3-l1脂肪细胞il - 6 ( 42),这表明受体在胰岛素抵抗的发生肥胖和2型糖尿病。另一方面,ERK1/2激活炎性改变脂肪细胞的诱导是至关重要的( 43),导致增强NF - κB活动( 44]。激活PPAR - β/ δ抑制增强细胞因子在脂肪细胞的生产防止NF - κB通过ERK1/2激活,产生影响,可能帮助预防胰岛素抵抗[ 30.]。此外,刺激LPS诱导adipocytic 3 t3-l1脂肪细胞的胰岛素抵抗通过参与物( 45]。因此,ERK1/2信号和物在脂肪组织生理信号相关调控胰岛素敏感性和脂解作用[ 40, 45]。所有这些背景的基础上,考虑到这里给出的结果,它是合理的提出可能的分子机制之一蒜氨酸预防有限合伙人的效果(图 4)。

因素之一,可能减轻脂肪细胞的炎症反应,它已经表明,预处理的脂肪细胞脂联素发挥抗炎活动通过抑制il - 6、TNF - α从脂肪细胞发炎和MCP-1生产 46, 47]。这个抗炎作用可能是通过抑制NF -介导的 κ活动,以及通过增加PPAR - γ表达式。最近,Gomez-Arbelaez等人表明,年龄是能够改善代谢综合征患者脂联素水平后12周( 48]。在这里,我们表明,24小时预处理的蒜氨酸能够部分恢复LPS-stimulated脂肪细胞的脂联素水平。这进一步支持蒜氨酸的抗炎效果。

总之,我们发现预处理与蒜氨酸中和LPS-induced炎症。我们的研究结果表明,蒜氨酸会使il - 6和MCP-1表达式,以及ERK1/2磷酸化。在此基础上,我们的数据显示,投机可以发生有关的蒜氨酸的影响是可能通过NF -造成的 κB系统,作为一个信号通路用于抑制细胞因子在脂肪细胞(图生产 4)。然而,这个提议机制并不完全排除其他可能性,如,例如,减少炎症通过,已经描述,蒜氨酸抗氧化作用,可以作为补充途径。

山下式等。 493)表明,当与LPS刺激,t3-l1脂肪细胞与小鼠巨噬细胞cocultured,这些调节基因的表达与炎症有关,胰岛素抵抗和血管生成。作者分析了只有5693个基因的基因表达谱。在这里,我们分析了22000个基因的基因表达谱与蒜氨酸LPS刺激有或没有预培养后;因此我们的研究结果扩展3 t3-l1脂肪细胞的基因表达谱引起LPS刺激,这是符合规定的表达基因相关肽激素的刺激做出反应,胞质面上泡,DNA / RNA解旋酶,死/ DEAH箱式、磷酸腺苷,吞噬作用的积极监管,监管vesicle-mediated运输、和ATP-dependent解旋酶活动,作为主要集群分析(表1-SM)表示。

我们这里显示蒜氨酸预处理诱导的基因表达谱在有限合伙人炎症刺激反应(表 2和 3)。当我们详细分析了蒜氨酸基因调节的预处理与更高的值 z 分数(> 2.5)在两个比较,我们发现10基因与免疫球蛋白生产和t细胞受体(表 2),这表明蒜氨酸可以施加影响3 t3-l1脂肪细胞诱导lymphopoietic活动。这是高度相关的慢性炎症在肥胖诱导的脂肪细胞和影响t细胞激活( 50]。由脂肪细胞免疫球蛋白受体的表达已经提到的部分( 51, 52];然而,它几乎没有受到关注。在这里,我们表明,蒜氨酸诱发微分六immunoglobulin-related基因的表达和四个t细胞受体相关基因3 t3-l1脂肪细胞。这些免疫球蛋白可以作为抗炎信号或者至少可以影响脂肪细胞的代谢,与T细胞受体基因,可能影响脂肪细胞和T细胞之间的信号传导。

也是有关蒜氨酸似乎上调Cnpy4 (PRAT4B)表达式,因为这个分子是一个伴侣,与地的规定有关膜定位( 53),可以作为负调节TLR-1表面走私的 54]。因此,因为有限合伙人行动是由地,因此可行的推测,蒜氨酸作用可以调节这种受体贩卖或膜内的分布,以抵消LPS刺激。

另一方面,在蒜氨酸与基因表达下调,我们发现通过差别最高的基因对这些蒜氨酸 Dck(脱氧胞苷激酶)。它被描述3 t3-l1-differentiated脂肪细胞表达水平很低与增殖3 t3-l1细胞[相比 55];此外,另一个相关的两个基因与脂肪细胞的分化过程中,计价 Aamdc( 56]和Foxp1 [ 57),也被下调。这反映了,确认了3 t3-l1细胞完全分化为脂肪细胞由有限合伙人preincubated蒜氨酸和刺激。

此外,我们的分析显示,一群15与癌症相关的基因(表 3)。大蒜的抗癌的特性都记录在案。因此,我们在座的一系列基因的表达被蒜氨酸表达下调,这需要更多的研究来揭示他们的参与对蒜氨酸治疗和介入致因素。最后,我们展示了一群10个基因表达下调,蒜氨酸和未知的函数关系,表明相关部分的蒜氨酸的影响仍有待确定。

综上所述,我们的结果可能部分解释蒜氨酸引发的效应;然而,进一步研究了上游和下游效应器分子将是必要的为了理解炎症信号在这些障碍的作用。分析的某些其他基因的角色作为未知函数,表达式的明显改变,在我们实验室正在进行中。此外,它将测试感兴趣的蒜氨酸也在免疫细胞的影响,如巨噬细胞、或在一个 在活的有机体内研究中,在脂肪组织中巨噬细胞浸润。因此,其他未知机制似乎占有限合伙人的损失责任在脂肪细胞与脂肪组织发炎。