JTR 甲状腺研究期刊》的研究 2042 - 0072 2090 - 8067 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/9843675 9843675 研究文章 Quercetin-Induced细胞死亡在人类乳头状甲状腺癌(B-CPAP)细胞 Mutlu Altundağ Ergul 1、2 2 Kasacı Tolga 1 Yılmaz Ayşe我 1、2 2 Karademir Betul 1、2 2 Kocturk Semra 2、3 3 Taga • 1、2 2 Yalcın 答:苏哈 1、2 2 弗朗西斯 Gary L。 1 生物化学系 医学院的 马尔马拉大学 Maltepe 34854年伊斯坦布尔 土耳其 marmara.edu.tr 2 遗传和代谢疾病研究中心 马尔马拉大学 Maltepe 34854年伊斯坦布尔 土耳其 marmara.edu.tr 3 生物化学系 医学院的 Dokuz Eylul大学 Inciralti 35340年伊兹密尔 土耳其 deu.edu.tr 2016年 20. 1 2016年 2016年 04 09年 2015年 16 12 2015年 22 12 2015年 2016年 版权©2016 Ergul Mutlu Altundağet al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

在这项研究中,我们研究了槲皮素的抗增殖作用对人类乳头状甲状腺癌细胞和凋亡机制的行动决定。我们使用不同浓度的槲皮素诱导细胞凋亡和测量细胞的可行性。细胞凋亡和细胞周期分析是由使用碘化膜联蛋白V和propidium流式细胞术。最后,我们测量改变caspase-3和裂解聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP)蛋白表达水平一半的蛋白质和细胞凋亡特征标记的表达水平在治疗和控制细胞蛋白酶体活动。槲皮素治疗人类乳头状甲状腺癌细胞导致减少细胞增殖和细胞凋亡率增加了半胱天冬酶激活。此外,它表明槲皮素诱导肿瘤细胞凋亡的表达下调一半的水平。总之,我们已经表明,槲皮素一半寿命表达式的差别引起对这些基因可能参与的减少chymotrypsin-like蛋白酶体活性,在秩序,诱发抑制生长和细胞死亡在甲状腺癌细胞。因此,槲皮素似乎是一个有希望的候选药物和细胞凋亡的差别一半对这些甲状腺癌细胞。

 1。介绍

甲状腺癌和乳头状甲状腺癌占所有恶性肿瘤的1%形成大多数情况下( 1]。B-CPAP是乳头状甲状腺癌细胞系,已知BRAF V600E突变。BRAF突变发生在大约8%的人类肿瘤和也普遍在乳头状甲状腺癌(36 - 69%) 2, 3]。癌症治疗旨在MAPK信号利用RAF的选择性抑制剂和MEK激酶抑制剂的一半 4- - - - - - 6]。一半是一个伴护蛋白质所必需的生存压力条件下也调节致癌蛋白的稳定性和活动( 5]。据报道,一半的抑制剂可能刺激突变b - raf蛋白质的蛋白酶体降解[ 6]。

蛋白质降解是化疗的一个重要方面由于肿瘤细胞可能通过这个途径产生耐药性。癌细胞有很高的蛋白酶体活动与正常细胞相比,癌细胞降解受损蛋白质的蛋白酶体活性对化疗药物产生耐药性( 5- - - - - - 7]。很多肿瘤显示休克蛋白水平增加(一半,Hsp70、Hsp60和Hsp27),促进肿瘤细胞生存,发展,和转移( 7, 8]。这些蛋白质也参与甲状腺癌的致癌途径。因为一半是已知与蛋白酶体降解系统交互,它成为重要的考虑化疗的作用。一半寿命从而抑制甲状腺癌治疗的可能提供一个新的途径。

另一方面,在动物和人类的研究表明,茶多酚,尤其是黄酮类化合物,起着重要的作用在调节肿瘤发生[ 7, 9]。槲皮素是一个组件的可吃的水果和蔬菜。它是一个天然黄酮,在高浓度存在不同的浆果,洋葱,苹果,和红酒 10]。槲皮素具有选择性抗增殖和抗肿瘤效果通过凋亡机制在不同的人类癌症细胞系( 11]。在这项研究中,我们使用一个乳头状甲状腺癌细胞系(B-CPAP)和研究槲皮素的抗增殖作用在这些细胞。我们已经确定底层的凋亡机制包括caspase-3激活,PARP乳沟,一半抑制蛋白酶体降解。

 2。材料和方法

Propidium碘(π)、槲皮素(Q4951,纯度> 95%),MCA(甲基香豆素)suc-LLVY-MCA (succinyl-leucine-leucine-valine-tyrosine-methylcoumarin)和ATP从Sigma-Aldrich购买(美国)。WST-1工具包是罗氏诊断(美国)和赫斯特33342年污点从生活技术(德国)。膜联蛋白V /π是由微孔(美国),制定根据制造商的指示。抗体是caspase-3(猫使用。# 9662、细胞信号、美国)、裂解PARP(猫。# 9541、细胞信号、美国),一半(猫。# 4874、细胞信号、美国), β肌动蛋白(猫。# 4967、细胞信号、美国)和HRP-linked anti-rabbit免疫球蛋白(猫。# 7074,细胞信号,美国)。人类乳头状甲状腺癌细胞(B-CPAP)来自德意志Sammlung冯Mikroorganismen和Zellkulturen (DSMZ, 273年ACC)。

2.1。细胞生存能力分析

在rpmi - 1640细胞培养介质(Biochrom、德国)补充10%胎牛血清(Hyclone实验室、美国),penicillin-streptomycin谷酰胺1%,1% 5%的股份有限公司2孵化器在37°C。细胞生存能力监控使用WST-1工具包。槲皮素原液(500毫米)准备在二甲亚砜(DMSO)和存储在−20°C。与rpmi - 1640稀释介质之前被用于不同的化验和DMSO的最终浓度保持在0.1%以下。在可行性实验中,7×103细胞/被播种在96 - 100年孔板 μL培养基和暴露在不同浓度的槲皮素(10 - 200 μ米)。在24、48或72个小时,10 μL WST-1被添加到每个好,孵化2小时37°C。瓶上的盘子被彻底动摇了1分钟,记者底物的吸光度测量使用标在420 - 480海里(美国分子设备)。

 2.2。检测细胞凋亡、细胞周期分析和染色质染色

细胞凋亡的检测,0.5×106细胞被洗PBS和ApopNexin FITC凋亡检测设备(美国微孔)是用于分析。在每个测定1×104细胞被测量。所有的实验进行了一式三份和结果评估使用CellQuest程序(美国,正欲)。细胞周期分析,0.5×106细胞收获和离心机,上层的丢弃 12]。颗粒悬浮在PBS和70%冷乙醇。细胞与PBS洗一次,其次是孵化在PBS含有50毫克/毫升π2毫克/毫升DNase-free核糖核酸酶A 30分钟在室温下在黑暗中,他们分析了FACSCalibur流式细胞仪系统(美国,正欲)。染色质染色,细胞被槲皮素处理24小时,离心收集的300 g×5分钟,与3.7%多聚甲醛固定20分钟,然后沾10 μ赫斯特33342染料,持续15分钟。与PBS洗涤后,荧光是评估使用荧光显微镜(德国徕卡DFC 310 FX)。

 2.3。免疫印迹实验和蛋白酶体活性测量

为西方墨点法和蛋白酶体活性测量,1.8×106细胞被镀在10厘米文化菜肴。细胞被收获,200年细胞溶解 μL冷裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, pH值6.8,15毫米EDTA, MgCl 15毫米2,50毫米 β甘油,150 μg / mL洋地黄皂苷含二硫苏糖醇1毫米和100毫米phenylmethylsulfonyl氟化物)。样本在冰上孵化15分钟和离心后的上层清液收集在18000 g×10分钟。蛋白质浓度测定用BCA试验(皮尔斯化学、美国)。大约30 μ克总蛋白质是每个加载和sds - page分析根据Laemmli [ 13]。蛋白质被转移到由Turbo-Blot系统硝化纤维膜(Bio-Rad实验室、美国)。膜被封锁与5%的脱脂牛奶Tris-buffered盐水含有0.1%渐变20和免疫印迹一夜之间在4°C的主要抗体(一半,caspase-3和裂解PARP)其次是适当的辣根peroxidase-linked二级抗体。检测是使用西方Pico执行化学发光底物工具包(美国热科学)和ChemiDoc议员系统(Bio-Rad实验室、美国)。

蛋白酶体活性,细胞被孵化在寒冷的225毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.8)包含MgOAc 7.5毫米,7.5毫米MgCl245毫米氯化钾,1毫米二硫苏糖醇,在液氮治疗15秒,然后在40°C水浴1分钟(3次)。溶菌产物是离心机在15000 g×30分钟在4°C。fluorogenic肽succinyl-leucine-leucine-valine-tyrosine-methylcoumarin (suc-LLVY-MCA)在200年作为底物的浓度 μ米测量chymotrypsin-like (CT-L)蛋白酶体的活动。测量活动的20多岁和26 s蛋白酶体,ATP是添加到反应混合物。60分钟的孵化后37°C,甲基香豆素解放测量在360海里激发荧光读者和485海里排放。结果计算使用免费甲基香豆素(MCA)作为标准 14]。

 2.4。统计分析

影响的意义治疗组相比,方差分析(方差分析)其次是图基的多重比较和Bonferroni期末测验。 p 值小于0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。槲皮素对细胞活力的影响

乳头状甲状腺癌(B-CPAP)细胞与不同浓度的槲皮素治疗(10、25、50、75、100、150年和200年 μ米)24、48和72小时调查槲皮素对细胞活力的影响。如图 1槲皮素治疗对抑制和增殖的影响在不同的剂量和时间。24小时后观察两相的影响。虽然细胞生存能力下降10、25、50和75 μM浓度与对照组相比,有显著增殖效应在高剂量。48和72小时后这些变化不太明显,可能是蒙面的增殖效果和/或相对较短的半衰期为槲皮素。在这些初步实验观察倍增时间24小时。因此,对于进一步的实验,这个时期和10 - 75 μ被选中的M槲皮素浓度。

不同浓度的槲皮素对细胞活力的影响。细胞与不同浓度的槲皮素治疗(10 - 200 μ米)24、48和72小时和细胞生存能力是衡量WST-1化验。所有数据点代表平均数±标准差, n = 3 。治疗的手段和意义之间的差异进行了分析使用方差分析和Bonferroni期末测验。 p ∗ < 0.05 与控制, p ∗ ∗ < 0.01 与控制, p ∗ ∗ ∗ < 0.001 与控制。

 3.2。细胞凋亡、细胞周期分析和染色质染色

图 2显示比例的细胞发生凋亡的变化在10槲皮素治疗后24小时内,25日,50和75 μ与对照组相比。B-CPAP细胞染色Annexin-V和π是紧随其后的是流式细胞术测定凋亡细胞死亡的百分比。早期的百分比(Q2)和后期(Q3)凋亡细胞quercetin-induced增加细胞凋亡。我们的研究结果表明,比例的细胞发生细胞凋亡增加槲皮素浓度与对照组相比,但凋亡率高和类似在50和75 μM浓度(图 2 (b))。细胞周期分析的结果表明,细胞的百分比分布在不同的阶段在低浓度槲皮素没有改变,但在50和75 μM浓度sub-G1和S期细胞的数量增加,而G0 / G1期细胞的数量减少(图 3)。染色质染色与赫斯特33342年显示形态变化,如细胞表面气泡和形成的细胞凋亡的身体治疗后50 μM槲皮素(图 4)。

流仪分析quercetin-induced B-CPAP细胞凋亡细胞死亡。细胞与不同浓度的槲皮素治疗(10 - 75 μ米)24 h。细胞凋亡是评估使用膜联蛋白V-FITC和π染色流式细胞术(a)紧随其后。细胞左下象限(膜联蛋白V-FITC−π−)是可行的;那些在右下象限(膜联蛋白V-FITC + /π−)早期凋亡和那些在右上象限(膜联蛋白V-FITC + / PI +)迟到凋亡或坏死。细胞凋亡酒吧图表(b)代表平均数±标准差, n = 3 。治疗的手段和意义之间的差异进行了分析使用方差分析和图基的多重比较检验。 p ∗ < 0.05 与控制, p ∗ ∗ < 0.01 与控制, p ∗ ∗ ∗ < 0.001 与控制。

流仪分析quercetin-induced B-CPAP细胞的细胞周期分布。细胞与不同浓度的槲皮素治疗(10 - 75 μ米)为24小时。破坏细胞周期分析流式细胞仪显示sub-G1(凋亡细胞),G0 / G1, G2 + M (a)细胞周期阶段酒吧图表代表细胞的百分比在不同细胞周期阶段(b)。治疗的手段和意义之间的差异进行了分析使用方差分析和Bonferroni期末测验。细胞周期酒吧图表(b)代表平均数±标准差, n = 3 。 p ∗ < 0.05 与控制。

与赫斯特33342年B-CPAP细胞染色质染色。箭头表示出泡,染色质凝聚。荧光显微镜,徕卡DFC 310外汇,放大:40 x。

 3.3。免疫印迹分析

图 5结果显示免疫印迹分析。乳沟caspase-3和PARP证实细胞凋亡在更高的浓度。当细胞暴露在50和75 μ从35 M槲皮素,caspase-3裂解19 kDa。槲皮素治疗B-CPAP细胞中表达下调一半的表达与控制。这些结果表明quercetin-induced癌细胞凋亡的差别可能与对这些基因的一半水平。

免疫印迹分析caspase-3劈理(a),一半寿命PARP解理(b)和(c)蛋白表达水平B-CPAP槲皮素治疗后细胞。微带强度进行了分析。折叠蛋白表达水平的变化计算后乐队被规范化 β肌动蛋白。治疗的手段和意义之间的差异进行了分析使用方差分析和Bonferroni期末测验。酒吧图表表示平均数±标准差, n = 3 。 p ∗ < 0.05 与控制, p ∗ ∗ < 0.01 与控制, p ∗ ∗ ∗ < 0.001 与控制。

 3.4。蛋白酶体活性的分析

我们也测量了chymotrypsin-like蛋白酶体活性(CT-L) 20多岁和26 s蛋白酶体的槲皮素(图 6)。CT-L显著抑制在25 - 75 μ槲皮素。一半的槲皮素抑制似乎参与减少B-CPAP细胞的蛋白酶体活性和细胞凋亡。

蛋白酶体活性测定槲皮素治疗后B-CPAP细胞。fluorogenic肽suc-LLVY-MCA被用作衡量chymotrypsin-like衬底(CT-L) 20岁和26 s蛋白酶体活动。治疗的手段和意义之间的差异进行了分析使用方差分析和Bonferroni期末测验。酒吧图表表示平均数±标准差, n = 3 。 p ∗ < 0.05 与控制, p ∗ ∗ < 0.01 与控制。

 4所示。讨论

分化型甲状腺癌是最常见的人类乳头状和滤泡性甲状腺癌的内分泌恶性肿瘤的两种主要的变异 1]。乳头状甲状腺癌占80%的甲状腺癌,已经被改变为特征的几个蛋白激酶( 15]。阴et al。 9报道说,类黄酮物质具有强力的抗增殖活性 在体外对各种人类甲状腺癌症细胞系和暗示,他们可能被用作治疗药物甲状腺癌的管理。虽然不同群体研究槲皮素在不同癌症细胞系,诱导细胞凋亡的细胞和分子机制尚未完全阐明 16, 17]。

在这项研究中我们报告抗增殖效果槲皮素对人类乳头状甲状腺癌的细胞。我们的研究结果表明,槲皮素抑制扩散尤其是在50和75 μM浓度。槲皮素浓度显著降低甲状腺乳头状癌细胞生存所观察到的类似于其他癌症细胞,如肝细胞瘤( 16)、肺( 17),结肠( 18)、白血病和乳腺癌[ 19]。在先前的研究中,结果表明,槲皮素抑制增长不同的甲状腺癌细胞系( 20.]。此外,槲皮素被报道成一个强大的多酚诱导细胞凋亡在白血病细胞系IC50值介于8和33 μM和AP50值(50%的浓度的细胞进行细胞凋亡)19到50岁之间不等 μ米( 21]。槲皮素的抗增殖作用被认为是所生产的细胞周期阻滞在G1期( 22]。在我们的研究中,我们已经表明,槲皮素抑制甲状腺乳头状癌细胞扩散,引发细胞凋亡在50和75 μ浓度,但细胞S期只在75年被捕 μ米的浓度。

槲皮素被发现有一个微分对细胞周期的影响在不同的骨髓和淋巴细胞株在上述研究[ 22]。虽然他们的细胞周期数据显示主要G0 / G1被捕,一些治疗细胞s阶段和G2M被捕。槲皮素的抗增殖作用机制乳腺和表皮样癌细胞在最近的一项研究调查D 'Archivio et al。 23]。这些作者观察到的两相的影响类似于我们的发现和报告剂量依赖的S期逮捕槲皮素的浓度更高。

细胞凋亡是一种形态不同的程序性细胞死亡。损伤细胞凋亡可以与一些疾病包括癌症。因此,诱导肿瘤细胞的凋亡可能是一个有前途的癌症治疗方法( 4]。包括我们在内的几项研究已经表明,槲皮素等黄酮类化合物治疗肿瘤细胞诱导细胞凋亡等相关属性以及抗病毒,抗氧化,抗炎和抗增殖活动 9- - - - - - 11, 17, 21, 24]。确定相关性 在体外多酚的影响临床使用,必须考虑他们的生物利用度和这些相对较高的浓度是否在等离子体是可以实现的。有人建议,生理浓度的多酚类物质及其代谢产物在等离子体不会超过10 μ米( 25, 26]。茶多酚的生物利用度是数据仍然有限,但有证据表明,槲皮素从植物获得产品可以导致血浆浓度微摩尔的 27]。公布的注意,也是了不起的槲皮素在人体药物动力学数据表明,1 - 2克的膳食补充剂槲皮素可能导致等离子体浓度10至50 μM和这些诱导细胞凋亡和表达下调凋亡蛋白浓度 在体外( 28]。还可以引发细胞凋亡。还存在,代表一个家庭的半胱氨酸蛋白酶,是关键的蛋白质调节凋亡反应。其中,caspase-3凋亡机制的关键蛋白,激活caspase-3负责细胞凋亡的形态学特征,包括DNA碎片和膜起泡 29日]。我们测量了caspase-3 PARP和观察到的乳沟quercetin-induced细胞死亡伴随增加活动的caspase-3刺激细胞凋亡和DNA的分子级联的碎片。热休克蛋白(休克)非常保守,在主要细胞过程有不同的作用。一半是分子伴侣和保护生物免受压力引起的细胞损伤。据报道有一个监管角色的某些步骤凋亡级联( 5]。在这项研究中,我们已经表明,槲皮素诱导细胞凋亡的能力在B-CPAP细胞其一半的抑制活性。这种效应可能代表一种机制,通过这种饮食植物多酚化合物可能发挥其抗癌效果。

癌细胞与正常细胞不同,增加了蛋白酶体的活动是至关重要的生存和无拘束的扩散 30., 31日]。蛋白酶体活性是通过不同的监管机构监管包括热休克。一半寿命等,主要负责保持蛋白质在折叠状态功能。它还在蛋白酶体降解过程中扮演了重要的角色。一半寿命除了所有这些重要的功能,防止蛋白质聚合( 32]。近年来,芹黄素等不同的茶多酚,儿茶素、槲皮素、杨梅酮已报告作为蛋白酶体抑制剂在肿瘤细胞诱导细胞死亡( 33]。也报道,各种水果和蔬菜的精华,特别是葡萄提取物,能够抑制蛋白酶体活性,这抑制与肿瘤细胞凋亡( 34, 35]。我们也观察到,槲皮素可以显著抑制蛋白酶体活动在一个chymotrypsin-like蛋白酶体活性的浓度的方式减少了槲皮素的浓度。此外,我们的数据可能会提供一个联系和差别一半对这些蛋白酶体抑制通过增加蛋白质聚合。

 5。结论

虽然研究近年来生成新的靶向治疗甲状腺癌,差距仍然是治疗复发性乳头状癌不适合手术切除。我们已经表明,槲皮素会使一半的表达,减少chymotrypsin-like蛋白酶体活性相关,这些影响抑制增长和半胱天冬酶依赖在乳头状甲状腺癌细胞凋亡细胞死亡。假设这些影响导致细胞一定的压力条件触发凋亡细胞死亡机制通过caspase-3激活和PARP乳沟。因此,一半似乎抑制甲状腺癌药物开发的一个重要方法。然而,一半寿命抗增殖和凋亡效应的分子机制还有待确定。

 利益冲突

本文作者确认的内容没有利益冲突。

 作者的贡献

Ergul Mutlu Altundağ和Tolga Kasacı贡献同样这项工作。

 确认

本研究支持的马尔马拉大学研究委员会(凹陷- c -公羊130313 - 0063)和土耳其的科学技术研究委员会(图- 110 s281)。

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