JT 毒理学杂志》 1687 - 8205 1687 - 8191 Hindawi出版公司 372986年 10.1155 / 2013/372986 372986年 研究文章 三氯蔗糖代谢的影响环境的细菌 http://orcid.org/0000 - 0001 - 8619 - 7366 奥木兰· 亚瑟 http://orcid.org/0000 - 0002 - 2155 - 1771 哈恩 格雷戈里 http://orcid.org/0000 - 0001 - 9070 - 1860 鲍尔斯 多利亚 http://orcid.org/0000 - 0003 - 4415 - 7563 斯文森 珍妮丝 http://orcid.org/0000 - 0002 - 9125 - 1811 Coughlin 查尔斯 Bursian Steven J。 生物学系 北佛罗里达大学 杰克逊维尔 FL 32224 美国 unf.edu 2013年 3 12 2013年 2013年 12 09年 2013年 10 11 2013年 10 11 2013年 2013年 版权©2013阿瑟·奥木兰·et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

三氯蔗糖是作为一种低成本开发人造甜味剂nonmetabolizable在人类。三氯蔗糖可以承受pH值和温度的变化,而不是退化的污水处理过程。因为分子可以承受热量、酸化和微生物降解,积累在环境和被发现在废水,河口,河流和墨西哥湾流。环境分离培养的三氯蔗糖寻找潜在的三氯蔗糖代谢或增长加速度响应。蔗糖素被发现无营养的,并演示了在所有六个分离抑菌效果。这种增长抑制直接接触与三氯蔗糖的浓度成正比,和抑制增长似乎是种专一性。抑菌效应可能是由于减少蔗糖吸收由细菌暴露于三氯蔗糖。我们已经确定,蔗糖素抑制转化酶和蔗糖透性酶。这些酶催化水解或不能有效的跨膜运输糖的替代品。当前环境浓度不应产生太大的影响以来环境细菌抑菌效果似乎基于奉献; however, as sucralose accumulates in the environment, we must consider it a contaminant, especially for microenvironments.

 1。介绍

三氯蔗糖是第一个noncalorie甜味剂制成的天然糖,被选择性氯化蔗糖生产,替代品的三个羟基氯( 1]。三氯蔗糖是稳定下增加热量和在一个广泛的酸性和碱性条件。因此,蔗糖素可用于烘烤或产品需要更长的保质期 2]。三氯蔗糖导致哺乳动物完全零热量的增加( 1]。人造甜味剂已经被环境科学家最近才考虑污染物( 3]。由于人类无法代谢这些分子,他们传递给环境通过人体排泄物和最高浓度(2800±1000 ng / L)的人造甜味剂结合污染物在污水处理水库( 4]。人造甜味剂如糖精和糖精等主要降解污水处理流程。然而,三氯蔗糖是发现在较高的浓度和退化的最低限度 4]。降解只发生在一定程度上在水解过程中,臭氧化和微生物过程表明三氯蔗糖的分解可能会缓慢和不完整导致地表水(三氯蔗糖的积累 5]。三氯蔗糖中已发现了河流在北卡罗莱纳,在墨西哥湾流,在佛罗里达群岛的海域 6]。科学家们检测蔗糖素在各种美国内陆地表水和监控其积累( 4]。大多数人造甜味剂是部分或完全分解由于使用高温废水处理流程和pH值的变化和持续的过滤。似乎,三氯蔗糖的能力能够承受剧烈的pH值和温度变化使其异常人造甜味剂( 5]。随着时间的推移,三氯蔗糖可能蔓延至其他水生和沿海生态系统,增加浓度( 5]。这些研究人员还推测,三氯蔗糖的持久品质可能导致慢性低剂量暴露对人类和环境健康不太为人所知的后果。

三氯蔗糖对环境微生物的影响在很大程度上是未知的。然而,研究人类的口腔和肠道细菌的抑制细菌生长的三氯蔗糖( 7]。在一项研究的126毫米三氯蔗糖成葡萄糖琼脂培养基总增长的抑制作用造成的 链球菌sobrinus6715 - 17, 链球菌sanguis10904年, 链球菌challis, 唾液链球菌, 放线菌viscosusWVU627 [ 7]。在一个相关的研究中被感染的老鼠 链球菌sobrinus蔗糖水饮食后,开发了龋齿病变( 8]。另一组大鼠给予相同的细菌但三氯蔗糖水而不是糖水有明显降低龋齿病变的牙齿。这些研究人员得出结论,口腔细菌无法生长的人工甜味剂因此产生更少的损害,表明三氯蔗糖noncariogenic [ 8]。相同的环境微生物抑制可能是真的。此外,如果蔗糖素抑制细菌生长,抑制的类型需要确认为杀菌(杀死细菌)或抑菌(细菌新陈代谢放缓),和这种抑制的机制应该阐明。

 2。方法和材料 2.1。总结的方法

阐明蔗糖素对细菌生长的影响,细菌隔离是采样来自不同环境。每个细菌隔离调查了三氯蔗糖代谢。如果三氯蔗糖被发现无营养的细菌,对健康的影响观察细菌生长通过浊度测试通过培养细菌隔离TSB和修改媒体与不同浓度的蔗糖素。任何抑制类型的抑菌或杀菌;这是磁盘扩散试验和reculturing决定。最后这种抑制作用的机制是由酶识别和运输化验。基于分子动力学分析确定抑制的类型。运输抑制和减少催化可以竞争性抑制指标。

 2.2。增长/浊度测试

六个人隔离在大豆胰蛋白酶的肉汤培养( n = 5 )(TSB)(美国Difco实验室、MI)和孵化25°C。对照组由5毫升的TSB修改附加0.5毫升生长介质。实验团体包括5毫升TSB 0.5毫升的10、20、30日,按体积或40%蔗糖素补充说,收益率最终浓度的27.8毫米,55.78毫米,83.75毫米和111.7毫米。文化的浊度测量在620 nm曾经为9天每天使用24小时的间隔(红杉特纳340分光光度计)。

 2.3。三氯蔗糖代谢的验证

在M9肉汤培养基培养个人隔离( n = 6 )(TechNova、NS、加拿大)和孵化25°C。对照组由5毫升的M9汤没有碳源;实验组包括5毫升的M9汤与三氯蔗糖作为唯一碳源。文化的浊度测量在接下来的9天使用24小时的时间间隔和红杉特纳分光光度计波长620纳米。

 2.4。磁盘扩散试验和测定抑制的类型

每个细菌隔离spread-plated TSA的媒介。磁盘是由棉轮孔冲孔,浸泡1.6 M三氯蔗糖。磁盘被放置到表面的媒体,每个培养皿3磁盘( n = 9 )。样本在晚上25°C,孵化和直径测量区域的抑制。抑制的区域然后擦洗,用来接种新的TSA媒体。这些reculture盘子孵化在晚上25°C,然后检查增长。

 2.5。细胞死亡分析

每个隔离单独培养到六M9与葡萄糖琼脂板和6 M9与蔗糖琼脂板。三倍系列稀释的股票文化和spread-plated;350 μL(25.1毫米三氯蔗糖是涌上表面每个三氯蔗糖的添加组接种后不久。这些是孵化25°C 48小时,然后盘子是检查和菌落计数。细胞死亡的隔离,表现出最大的百分比在M9蔗糖培养基相比,M9葡萄糖运输抑制测试中被选为了阐明一种抑制机制。

 2.6。运输抑制试验

链霉菌属badius被选为运输抑制分析。这是由于在M9蔗糖培养基上抑制生长的很大程度上的挑战与三氯蔗糖。布拉德福德Coomassie试验进行了标准化蛋白浓度。,适当的细胞培养浓度被选为了产生适量的总蛋白的运输。三个测试组是用来衡量潜在的运输抑制:(1)仅0.1毫米蔗糖组;(2)蔗糖0.1毫米和0.1毫米蔗糖素组;蔗糖和(3)0.1毫米和0.1毫米甘露醇组作为控制以确保渗透压休克运输测试期间没有出现。每组包含700 μL稀释M9盐整除(64 g Na2HPO415 g KH2阿宝45 g、2.5克氯化钠和北半球4Cl / 5升H2O)和0.5 μL (14蔗糖(0.41 μCi / pmole)。最后300 μL细胞培养的平稳增长阶段提取并放在混合物和动摇。反应管的内容在25°C孵化2分钟。文化内容管被过滤到0.45 μ米孔隙大小过滤磁盘和洗2毫升的停止解决方案(冰冷的M9盐整除)。磁盘被过滤到一个管闪烁液和放射性测量通过贝克曼6500闪烁计数器。

 2.7。酶动力学:转化酶抑制试验

股票的解决方案准备0.3 U / L转化酶,1.5蔗糖,1 M三氯蔗糖,标准本笃的解决方案。两个测试组准备:(1)一套只蔗糖和(2)一套蔗糖和三氯蔗糖。蔗糖只有设置6反应管准备。每个反应管包含1毫升0.3 U / L的蔗糖酶,0.25毫升的本笃的解决方案,和0.75毫升pH值4缓冲。组中的每个管含有不同数量的蔗糖:2.5毫米,5毫米10 mM, 15毫米20毫米和25毫米。反应管在75°C孵化30分钟;每个管的吸光度为485 nm红杉特纳340分光光度计每2分钟。在5分钟的初始速度被记录。蔗糖和蔗糖素组6反应管准备。每一个反应管包含1毫升0.3 U / L的蔗糖酶,0.25毫升的本笃的解决方案,0.75毫升的pH值4缓冲区,三氯蔗糖和0.55毫米。每个管含有不同浓度的蔗糖,2.5毫米,5毫米10 mM, 15毫米20毫米,分别和25毫米蔗糖浓度。 Reaction tubes were incubated at 75°C for 30 minutes; the absorbance of each tube was measured at 485 nm on a Sequoia Turner 340 Spectrophotometer every 2 minutes. At minute 5 the initial velocity was recorded. Once these assays were completed, the velocities were analyzed and used to generate an enzyme kinetics plot to determine the type of inhibition sucralose exerted on invertase.

 3所示。结果/讨论

所有6隔离有更少的集落形成单位(cfu)对媒体的接触三氯蔗糖比阳性对照组的M9蔗糖和M9葡萄糖(图 3)表明一个抑制作用。生物没有三氯蔗糖代谢如图 1,这表明蔗糖素对细菌无营养的。

复合生长曲线描绘普通细菌生长的各种碳源6隔离。M9培养基含有葡萄糖作为唯一碳源作为一个积极的控制,M9培养基仅包含三氯蔗糖作为碳源是实验组,M9的介质中,不含碳源作为“饥饿节食”或消极的控制。这样做是为了表明存在,如果有的话,三氯蔗糖的代谢。

阐明蔗糖素对细菌生长的影响,浊度测试。隔离是亚文化( n = 5 )在27.8毫米、55.78毫米、83.75毫米、111.7毫米蔗糖素进一步阐明蔗糖素对细菌生长的影响。增长曲线显示降低增长与文化接受三氯蔗糖相比没有得到三氯蔗糖(图的控制 2)。一般来说,三氯蔗糖浓度越大被暴露于细菌,细菌生长速率越低。并不是所有的浓度抑制。最集中的稀释(28.7毫米)显示没有任何抑制影响的六个细菌隔离。55.7毫米三氯蔗糖有轻微抑制分离和明显不同( P < 0.001 只有2的隔离。标准错误意味着显示显著差异( P < 0.001 实验组和对照组之间的)修改与83.75毫米和111.7毫米三氯蔗糖。最后一维方差分析测试数据点为每个治疗显示显著差异( P < 0.001 实验组和对照组之间的)修改83.75毫米和111.7毫米三氯蔗糖。这些结果表明三氯蔗糖作为细菌的生长抑制剂的影响来自不同属。

增长曲线环境隔离。每个分离培养与不同浓度的蔗糖素TSB修改。开放的圆圈表示积极的控制,封闭循环是27.8毫米,封闭广场是55.3毫米,露天广场是83.7毫米,封闭的三角形是111.7毫米。阳性对照组由没有三氯蔗糖添加到TSB为了确定正常生长。这是执行确定蔗糖素对细菌生长的影响。83.7毫米和111.7毫米浓度显著( P < 0.05 )为每个隔离抑制与对照组相比。55.3毫米的浓度显著( P < 0.05 )抑制与对照组相比 Stenotrophomonassp.和 Ensifer arboris。

细胞死亡的比较图抑制在不同碳源媒体。每个隔离在克分子数相等的培养(111毫米)大量的蔗糖或葡萄糖作为碳源,与样品还含有三氯蔗糖的一半。最后进行菌落计数。

磁盘扩散分析( n = 9 )表现出广泛的区域抑制物种的反应是不同的。抑制被认为是显著的。每个清除区取样,用于接种新的培养皿。再生表明抑菌效果,明确区域采样的增长。再生是相同的菌落形态和克性格为每个隔离与原始文化。这个结果表明,蔗糖素并不是一个杀菌代理(表 1)。

磁盘扩散试验数据;区域的抑制。从抑制再生区进行了测试 ( n = 9 ) ;不再生表明抑菌抑制杀菌。

隔离 抑制+ /− 再生
米。U sp。13 + 是的
年代。sp。I_61 + 是的
r . borbori + 是的
c . murlinae + 是的
大肠arboris + 是的
美国badius + 是的

阐明抑菌抑制作用的机制,微分增长影响正常的碳源而暴露于三氯蔗糖被利用。细菌分离培养时部分抑制在M9琼脂三氯蔗糖和葡萄糖蔗糖M9与三氯蔗糖琼脂。媒体包含三氯蔗糖的菌落计数持续低于媒体自由的三氯蔗糖(图 3)。 链霉菌属badius显示显著的抑制作用( P < 0.001 包含媒体)三氯蔗糖。这种抑制是大于其他隔离,和更大的抑制是观察蔗糖M9培养基比葡萄糖M9培养基。标准错误的手段是用来测试是否这种抑制作用显著。因此, 链霉菌属badius是用于运输测试(图 3)。

一种新型运输测试是测试开发的这一现象。一个0.1毫米甘露醇控制被用来确保三氯蔗糖的影响并非由于渗透压休克。甘露醇是使用,因为它具有相同的三氯蔗糖在液体媒体渗透的影响。小动物——一张长有 t 以及表明有明显降低( P < 0.01 C)的运输14标记为蔗糖的 链霉菌属badius当暴露于三氯蔗糖(图 4)。

传输数据:抑制pmol /(毫克蛋白×min) 链霉菌属badius。这表明,三氯蔗糖是蔗糖的抑制剂通过运输蛋白质吸收 美国badius。列是意味着±1扫描电镜( n = 5 )。

进一步收集抑制的分子机制,进行了酶化验使用蔗糖酶催化蔗糖降解[ 9]。选择转化酶由于其守恒和广泛使用的微生物世界,被发现在细菌和真菌。人们已经发现在整个域细菌:在极端微生物,肠道菌群和环境细菌物种和高百分比的演化支之间的同源性(9;10;11;12)。蔗糖酶的酶催化蔗糖的分解成葡萄糖和果糖。初始反应速率和整体反应速率的转化酶抑制酶时悬浮在含有三氯蔗糖(图的解决方案 5)。这表明,三氯蔗糖转化酶的抑制剂的酶活性。动力学情节准备用不羁的初始速度反应抑制反应的摩尔浓度的蔗糖( 9)(图 5)。结果双尾 t 动力学研究显示测试 V 马克斯 的值没有显著不同( P > 0.05 ),但 K 米 值的反应明显不同( P < 0.05 )(图 5;表 2)。这是指示性之间的竞争性抑制蔗糖转化酶和蔗糖素绑定,蔗糖有亲和力越高,这就是为什么;抑制性影响。

转化酶反应速率动力学常数从图 5。 V 马克斯 单位在每分钟吸光度的变化和公里毫米。值意味着+ /−1 sem ( n = 5 ) 。

K 米 V 马克斯 希尔系数
积极的控制 6.66 ± 0.842 2.13 ± 0.16 2.37 ± 0.56
75毫米三氯蔗糖添加 18.52 ± 9.78 2.69 ± 1.25 1.88 ± 0.65

酶动力学曲线的初始速度不受约束转化酶反应,与三氯蔗糖转化酶抑制。重叠 V 马克斯 但是不同的值 K 米 值的反应表明竞争性抑制。误差线意味着±1扫描电镜( n = 5 )。

蔗糖素减少蔗糖的吸收和分解细菌通过竞争结合位点作为一个潜在的抑菌效应增长试验中观察到的机制。在以前的牙科研究蔗糖素引起的口腔细菌增殖次数少,防止空泡形成( 10]。其他研究也指出,实验室小鼠三氯蔗糖可检测粪便细菌少,肠道细菌被抑制蔗糖素( 11]。之前也表示抑制细菌生长的环境微生物研究蔗糖素( 12]。可能是以前的研究是抑菌的抑制,和这些口腔和肠道细菌测试赞同环境细菌试验结果提出了沟通。

本研究的主要结论是,三氯蔗糖是一种环境污染物。它会随着时间的推移积累在水生环境中,因为它是不可能打破(这需要细菌代谢)。先前的研究表明,细菌财团可以部分代谢三氯蔗糖di-chloro-aldehyde形式;然而,这些研究表明,三氯蔗糖的碳不纳入细菌财团的生物质 13]。这意味着该财团没有完全消化三氯蔗糖,这些研究也指出,细菌财团的成员不能单独对三氯蔗糖作为碳源的代谢( 14]。

当前环境的三氯蔗糖水平(平均约300 ng / L根据位置)对细菌生长可能不会有任何影响。我们假定当前环境的三氯蔗糖浓度太低会影响到环境的细菌大量水生环境。细菌生活在微环境可能会经历增长抑制由于微环境中不同浓度的水。

然而,三氯蔗糖在增加它的浓度由于其无法被降解pH值和温度变化 4]。这是目前在污水废水的几个水平 μg / L(磅)。瑞典环境保护署警告说,其分解缓慢和生态系统的影响在很大程度上是未知的;他们强调特定浓度水平可能导致损害节肢动物和蓝藻社区( 15]。

蔗糖素抑制抑菌;。目前三氯蔗糖环境浓度太低影响细菌目前生活在淡水或土壤系统。在这些环境中三氯蔗糖的浓度随着时间在不断的增加( 4]。微环境可以抑制由于三氯蔗糖积累经验这些环境可能有限的水资源量。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。本文的作者没有直接金融与商业身份的论文中提到可能会导致利益冲突,他们也没有收到任何第三方的资金。

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