不同微生物菌株之间的歧视可以基于整个生物生化指纹。为此,傅里叶变换红外(ir)光谱是选择的方法之一,被证明是有效的定量分析细胞大分子组成。红外光谱是一种时间- chemicals-saving生物物理方法,使特征,筛选、歧视,和完整的微生物细胞或细胞组件的识别。这种生物指纹识别方法的主要优点是小样本,简单,节省时间的样品制备没有化学预处理,允许获得实时信息的大分子组成细胞。

它已经表明,傅立叶变换红外光谱有足够的分辨能力区分单基因敲除突变体在酵母( 1), 枯草芽孢杆菌及其gerD和突变体(基拉 2),定义良好的不同表型的歧视 金黄色葡萄球菌在液体媒体诊断和研究目的 3]。傅立叶变换红外显微镜的叶子被用来建立一个快速的方法筛选突变体植物细胞壁的广泛表型( 4),来识别不同类型的 拟南芥突变体( 5]。最近傅立叶变换红外光谱被用来研究细菌 肠杆菌属下水道和一些生物膜的突变体( 6]。

由于某些原因,呼吸道革兰氏阴性细菌的突变体 发酵单胞菌属mobilis可能代表特殊利益的傅立叶变换红外光谱分析和指纹。 发酵单胞菌属mobilis兼性厌氧,预留与高活性的乙醇发酵细菌发酵途径。同时,它具有有氧呼吸链,支持摄氧率高。由于仍然未知的机制,这种细菌呼吸是低耦合的ATP合成( 7]。最近,我们构造了一个ⅱ型NADH脱氢酶基因敲除菌株( ndh -)[ 8),细胞色素的淘汰赛 b 亚基的 b c 1 复杂( cytB-),子单元二世的淘汰赛 双相障碍终端氧化酶( cydB -)和过氧化氢酶基因敲除 凯特-)应变( 9]。所有这些突变株能够生长在有氧条件下,但有不同程度不同的呼吸代谢的改变。所有的突变株有明显的氧化应激的指标:相对于父类型有3 - 4次调节转录的超氧化物歧化酶,以定量rt - pcr ( 9]。显然,氧化应激机制应该为每个应变不同,只要呼吸代谢的变化有所不同。大分子组件,通过红外光谱分析,如细胞膜脂质,蛋白质,核酸,活性氧的主要分子靶点在氧化应激( 10]。因此,我们的目的是调查这些呼吸突变体的大分子组成红外光谱学、是否可以区分不同的呼吸代谢的改变生物质谱的分层聚类分析。

z mobilis写明ATCC 29191年,ⅱ型NADH脱氢酶基因敲除菌株( ndh -)[ 8),细胞色素的淘汰赛 b 亚基的细胞色素 b c 1 复杂( cytB-),亚基二世的淘汰赛 双相障碍终端氧化酶( cydB -)和过氧化氢酶基因敲除 凯特-)应变( 9)被构造,通过破坏各自的基因与抗氯霉素行列式,利用同源重组( 8, 9]。微量需氧的条件下接种体生物量生长在液体培养基中葡萄糖24 h。批处理文化是生长在无氧和有氧条件下在20毫升塑料试管》和50毫升玻璃烧瓶,分别和有氧文化在200 rpm搅拌。生长培养基中含有20 g / L葡萄糖,5 g / L酵母提取物和矿物盐,pH值6和温度+ 30°C。生物质样品收集在指数(7 h)和固定(24小时)增长阶段。细胞被洗两次蒸馏水和离心机。傅立叶变换红外光谱分析使用5 - 15 μL洗细胞水悬液倒出的硅板和干滴 T< 50°C。吸收光谱被记录在一个HTS-XT标范围(力量、德国)4000 - 400 厘米 - - - - - - 1 ,分辨率为4 厘米 - - - - - - 1 。碳水化合物的定量分析,核酸,蛋白质,脂类在生物质进行了( 11]。6.5数据处理作品的软件。层次聚类分析(HCA)是用于创建系统树图 z mobilis及其基因敲除突变体吸收光谱使用病房的算法。

傅立叶变换红外光谱的 z mobilis写明ATCC 29191父类型及其突变体生物量生长在有氧或无氧条件下进行了分析,定量分析和HCA。

记录吸收光谱的比较显示,谱带概要文件的变化区域1140 - 1110和1665 - 1645 厘米 - - - - - - 1 ,从而表明父母和突变细胞大分子组成的差异。乐队在1183年(P = O;切断),1095 (P = O;碳水化合物)、1108、1515(蛋白质, NH 3 + 的 α氨基酸组,酪氨酸),1521 ( NH 3 + 侧链的氨基酸组),1660年和1657年 厘米 - - - - - - 1 (酰胺我, β表)改变形状和/或强度被用于歧视( 12]。1515年和1521年之间的转变 厘米 - - - - - - 1 指定细胞蛋白质组成的变化取决于增长conditions-anaerobic /有氧,指数/固定相。

所有样本的定量分析是为了获得数据的碳水化合物,核酸,蛋白质,脂质浓度生物质(数据未显示)。浓度并不宽的变化取决于组件)(2 - 8%,但表达清楚这些数据的分析结果表明,细胞大分子成分取决于生长条件。在所有菌株在有氧生长条件下脂质浓度高于厌氧生长。例如脂类的内容 z mobilis亲本菌株细胞干重4% (DW)和2% DW相应地在有氧和厌氧生长条件下。众所周知,细胞的脂质含量增加是对压力的反应。总碳水化合物的含量是高突变株细胞受到生长条件(+ /−氧气,7或24小时)。例如,碳水化合物浓度 cydB -突变体在指数期(后7 h)在有氧环境下DW 21% DW但在厌氧条件下17%。定量的数据分析结果表明,歧视的父母和突变株可以基于核酸和脂质浓度培养液的细胞。核酸的浓度和脂质在父母和突变剂生物量中以不同的比例,他们的比例是用于应变分化。核酸脂质浓度比率 z mobilis亲本菌株, 凯特- - - - - -, ndh, cytB -, cydB -菌株分别为6.95,4.42,5.33,5.16,和5.13(±0.3)相应。值得注意的是,这显然比杰出的值Z 。mobilis亲本菌株的变异衍生品和对应良好预期的程度的生化病毒株之间的相似性。因此,过氧化氢酶基因敲除菌株不同于所有的呼吸链突变体。发现有更多的相似之处 cytB -和 cydB -压力,部分电子传递中断,和他们之间 ndh,在接近于零的呼吸率。

下一步是创建HCA的分化方法 z mobilis父母和敲除突变株。成立这个向量归一化,2 nd-derivative光谱在三个光谱范围1185 - 950,1483 - 1360,3022 - 2832 厘米 - - - - - - 1 HCA,功能的样品在不同的生长条件和阶段。这显然系统树图显示,两个截然不同的集群的耗氧和厌氧生长的菌株。所有接种体样品的父母和基因敲除突变株明显是歧视和形成subcluster之一。这些结果表明,细胞的生化组成的影响,可以改变通过选择合适的发酵条件。

由于上述HCA的系统树图和定量分析数据歧视 z mobilis父母和敲除突变株甚至用培养液的光谱,创建另一个HCA的方法。二阶导数培养液光谱分析在几个区域:1665 - 1645,1544 - 1510,1301 - 1086,1220 - 1174,1120 - 1086 厘米 - - - - - - 1 选择诊断HCA的山峰或地区。特点是选择两个区域:1120 - 1086和1301 - 1086 厘米 - - - - - - 1 诊断区域被选中,1301 - 1086 厘米 - - - - - - 1 包括核酸振动模式特征。HCA系统树图(图 1)清楚地显示之间的歧视 z mobilis父母和敲除突变株,之间的区别 kat -呼吸和呼吸突变体,不同突变体的相似性 cydB -和 cytB——突变体。这些结果符合定量分析数据和估计的突变体建设。

傅立叶变换红外光谱定量分析显示变化的细胞大分子成分取决于应变特性和生长条件。歧视的 z mobilis写明ATCC 29191亲本菌株及其基因敲除突变株可以基于核酸脂质浓度的比值。HCA显示为Z是有效的 。mobilis写明ATCC 29191亲本菌株和呼吸敲除突变株歧视的接种体红外光谱并表示增长环境的影响(曝气、生长阶段)的大分子组成细胞。