JPR 寄生虫学研究期刊》的研究 2090 - 0031 2090 - 0023 Hindawi 10.1155 / 2017/6205257 6205257 研究文章 选择PCR诊断肠道寄生虫病:选择目标,内部分析,评价和比较与商业套件 http://orcid.org/0000 - 0002 - 6786 - 3551 Hartmeyer g . N。 1 2 http://orcid.org/0000 - 0001 - 7016 - 4711 赫伊 s V。 2 鉴于此 m . N。 1 2 德绍 r B。 3 坎普 M。 1 2 玛珊德 伯纳德 1 临床微生物学的研究单位 临床研究学院健康科学学院 南丹麦大学 欧登塞 丹麦 sdu.dk 2 临床微生物学部门 欧登塞大学医院 欧登塞 丹麦 ouh.dk 3 临床微生物学部门 Slagelse医院 Slagelse 丹麦 regionsjaelland.dk 2017年 30. 8 2017年 2017年 09年 05年 2017年 31日 07年 2017年 30. 8 2017年 2017年 版权©2017 g . n . Hartmeyer et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

粪便样本的显微镜是一个劳动密集型和不准确的技术检测肠道寄生虫引起的腹泻和聚合酶链反应是有吸引力的替代。几乎所有的寄生虫引起的腹泻病例九年段是由于在我们的实验室 兰伯氏贾第虫, 隐孢子虫物种,或 痢疾阿米巴通过显微镜检测。我们内部评估和选择singleplex实时聚合酶链反应(rt - PCR)检测99份粪便样本中对这些病原体的肠道寄生虫病疑似病例由显微镜进行测试。战略包括genus-specific PCR分析 c以及和 c . hominis,随后的PCR鉴定,区分这两个物种。 g . lamblia中检测出5 c以及68年一个microscopy-negative样本。内部rt - pcr检测的性能与三个商用多路复用测试(MT-PCR)装备系统81年粪便样本,收集在28 microscopy-positive 27 microscopy-negative样本的疑似病人肠道寄生虫病和26个样本个体没有怀疑寄生虫感染。内部分析更多的样本中发现寄生虫的寄生虫病疑似病例比任何包。我们得出这样的结论:商业套件针对有关寄生虫,但是他们的性能可能会有所不同。

 美联社Møller医学科学发展的基础 对其他Læge Fonden poulsen Mindelegat Beckett-Fonden 地区Syddanmarks和地区Sjællands Fælles Forskningspulje 南丹麦大学 欧登塞Universitetshospital 1。背景

正确识别人类微生物制剂引起腹泻的最佳治疗是至关重要的。检测致病肠道寄生虫通常是通过显微镜检查粪便样本。在过去的几年改变了支持使用PCR。研究表明,PCR的敏感性和特异性都比显微镜( 1- - - - - - 5]。此外,显微镜可能导致错误的结论,无害的寄生虫被解释为致病,而致命的寄生虫可能不能被检测到。这对肠道阿米巴(特别是被证实 6- - - - - - 10]。估算寄生的真正影响肠道感染,重要的是要建立有效的和可靠的实验室技术测试从病人粪便样本。使用优化实验室的方法能够改善患者安全通过快速和正确的诊断,从而导致及时适当的治疗。

本研究的目的是评估的后果替代显微镜实时PCR (rt - PCR)检测的肠道寄生虫引起腹泻。为了做到这一点,我们首先建立了寄生虫被检测到显微镜在我们实验室的九年,来确定哪些寄生虫相关患者人群。我们确定此前发现寄生虫会错过了通过引入有限数量的种特异的PCR检测以及很多情况下他们代表。然后我们内部singleplex rt - pcr检测的性能评估的三个最重要的肠道寄生虫病原体。最后,三个选择内部rt - pcr检测的性能检测 兰伯氏贾第虫, 隐孢子虫以及/ 隐孢子虫hominis,和 痢疾阿米巴相比三个商业多路实时PCR (MT-PCR)包。

两个特定目标定义:(1)评价仪器内部特有的rt - pcr检测的性能 g . lamblia, c以及/ c . hominis和 大肠阿米巴在粪便样本提交检查寄生虫;(2)内部rt - pcr检测的性能比较和性能的三个商业MT-PCR包检测相同的寄生虫。

 2。方法 2.1。数据收集从实验室信息系统(LIS)

粪便样本数据检验了寄生虫从2005年10月到2015年1月从电子系统。样品和病人的总数和显微镜的结果被注册。

 2.2。粪便样本

总共125份粪便样本,其中99被显微镜因涉嫌寄生虫病检查,随机收集从患者胃肠道的抱怨在2010年6月和2015年1月之间。九十九年的这些样本包括客观(31 microscopy-positive和68 microscopy-negative)和八十一(28 microscopy-positive 27 microscopy-negative)包括用于测试目的。除了26个样本个体没有怀疑的寄生虫病包括没有显微镜对客观两个。

对于目标1,共99个样本被内部rt - pcr分析。对于目标2,共81个样本被内部rt - pcr分析,由三个商业MT-PCR包。所有样品都保持在−80°C到PCR进行。

 2.3。显微镜对肠道寄生虫

显微镜检查存在的卵巢囊肿是通常由检查iodine-stained wet-mount准备后formalin-ethyl醋酸浓度、×400的放大 11]。当在特定的请求 隐孢子虫物种, 环孢子虫物种,或 Cystoisospora物种被怀疑从常规显微镜涂片染色,修改Ziehl-Neelsen技术还研究了( 12]。

 2.4。内部rt - pcr

内部的PCR分析、DNA提取利用NucliSENS easyMAG系统(bioMerieux、法国)按照制造商的指示。DNA提取前,棉签就淹没到粪便样本和悬浮在4毫升生理氯化钠溶液。内部提取和PCR控制,phocine疱疹病毒(PhHV实验室毒株)被添加到每个样本DNA提取前( 13]。核酸在100年被筛选了 μl和PCR立即处理。

检测的三种肠道寄生虫( g . lamblia c,以及/ c . hominis和 大肠阿米巴在99个样本)进行singleplex rt - pcr分析是重复的。一个试验是检测检测 g . lamblia三个测试 c以及/ c . hominis,一个试验(实验3)包括区分 c以及和 c。最后一个试验 大肠阿米巴进行了测试,利用引物和探针(表吗 1)前面描述的 1, 4, 13- - - - - - 16]。

引物和探针用于内部实时PCR检测的研究。

寄生虫 正向引物序列,5′→3′ 目标 参考
反向引物序列,5′→3′
探针序列(FAM) 5′→3′
兰伯氏贾第虫 广汽GGC柠檬酸GGA CAA CGG TTTTG CCA GCG GTG苑GCCC GCG GCG GTC有条件现金援助GCT AG) ssu-rRNA Verweij et al。(2004)( 1]
C,以及孢子/ C。hominis (实验1) 结论TTT ACC AAT CAC AGA ATC ATC将军TGT GTT TGC CAA TGC ATA TGATCG GGT ATC有条件现金援助ATA的行动 DNA J-like蛋白基因 Bruijnesteijn范Coppenraet et al。(2009)( 4]
C,以及孢子/ C。hominis (实验2) 公司治理文化TTC TCT AGC柠檬酸TGA总部结论CAC GTG TGT TTG CCACCA ATC ACA棉酚柠檬酸柠檬酸棉酚TCG GGT ATC行动 DNA J-like蛋白基因 方丹和第5期(2002)( 14]
C,以及孢子/ C。hominis (实验3) 棉酚CTG TAC AGA TGC TTG GGA棉酚TCCTT CGT标签TTG AAT有条件现金援助CTT移行细胞癌TTG GAG CTC ATA柠檬酸G c . hominis探针结论GGA GCT CGT ATC AG) c以及探针 特定的蛋白编码基因 杨et al。(2013)( 15]
痢疾阿米巴 甘氨胆酸丙氨酸GTC GTG太极拳TAA CTCGCG广汽GGC柠檬酸TTA TAA CA猫TGA ATG AAT TGG CCA TT ssu-rRNA Verweij et al。(2004)( 1]Stensvold et al。(2010)( 16]
内部控制
Phocine疱疹病毒(PhHV) GGG注册会计师ATC ACA手枪TGA ATCGCG GTT CCA AAC GTA CCATTT TTA TGT GTC公司治理文化CAC猫CTG得到C 糖蛋白B Niesters(2001)( 13]

25 μl反应混合物包含1 x TaqMan®快速普遍PCR反应混合液,2 x没有AmpErase®)(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),引物的1000 nM和200 nM的探测器和5 μl DNA洗出液。

实时PCR进行使用一个应用生物系统公司7500快速实时PCR Thermocycler(热费希尔科学)以下循环条件:95°C,持续20秒,紧随其后的是45 95°C的周期为3秒和60°C,持续30秒。

PCR产物进行分析使用序列检测软件v.1.4(热费希尔科学)。手动循环阈值设置为0,1,一个自动基线。样本被视为积极的如果Ct-value≤42和指数曲线。正面和负面的提取和PCR控制被包含在所有PCR分析。

singleplex内部的rt - pcr检测 g . lamblia, c以及/ c . hominis(试验1),和 大肠阿米巴是集体叫工具包和三个商业MT-PCR包相比,用于客观2 79个样本。

 2.5。诊断检测盒

三个不同的商业工具可以在市场测试:RIDA®基因寄生凳子面板(PG1705) R-Biopharm AG)、达姆施塔特,德国(kit B), LightMix®模块化肠胃炎TIB的MOLBIOL化验,柏林,德国(kit C),和BD马克斯™肠道寄生虫面板从双相障碍的诊断,富兰克林湖,美国新泽西州(kit D)。B和C DNA提取试剂盒是描述的内部分析。装备D、DNA提取是根据BD马克斯肠寄生虫面板说明BD MAX系统。在所有的商业工具,我们使用内部控制DNA,推荐和包含在包中。七十九个样本进行重复三个包,按照制造商的指示。包B进行了PCR检测使用一个应用生物系统公司7500快速实时PCR Thermocycler以下循环条件:1分钟在95°C,紧随其后的是45 95°C的周期为30秒15秒和60°C。工具包C进行PCR检测罗氏LightCycler 480®II实时仪器使用以下循环条件:10分钟在95°C,紧随其后的是50周期95°C,持续5秒,5秒62°C, 72°C为15秒。装备D分析显示了BD马克斯肠寄生虫面板说明BD MAX系统。包被认为积极正面的结果,如果一个人的两个副本是积极的,用于目标2。

 2.6。分析

McNemar检验法测试是用于统计比较的配对数据在目标1。

 2.7。伦理、生物和数据存储

这项研究是一个博士项目的一部分,通过数据保护局(j.nr丹麦。2008-58-0035)。所有样本存储在一个批准的研究生物−80°C建立了这项研究。数据存储在一个批准和安全门户属于丹麦南部地区。

 3所示。结果 3.1。读出来的数据

在2005年10月到2015年1月,10593 4887名患者的样本检查肠道寄生虫。基于显微镜报道diarrhoea-causing寄生虫 g . lamblia(500 / 237患者的样本), 隐孢子虫物种(78 / 41名患者的样本), 大肠阿米巴或大肠阿米巴/ dispar(159 / 62患者的样本) 环孢子虫物种(25 / 12患者的样本)。如前所述( 10大多数寄生虫报告为 大肠阿米巴显微镜后最有可能 大肠dispar,这被认为是不致病的。在这些数据的基础上我们决定研究中测试 g . lamblia和 c以及/ c . hominis因为他们导致疾病的频率。为 隐孢子虫sp.严重疾病导致的免疫功能不全的患者和对公众健康的重要性作为代理的食物和水传播疫情也导致了决定。另外一个测试 大肠阿米巴包括因为阿米巴痢疾、阿米巴肝脓肿是严重的条件,要求立即和适当的治疗。因此只有极少数情况下cyclosporiasis(每年大约一在我们的诊断实验室)将错过的选择目标。

 3.2。目标1

内部rt - pcr检测 g . lamblia是积极的13 14 microscopy-positive在5 microscopy-negative样品和样本。这三个测试rt - pcr检测 c以及/ c . hominis是积极的在10的11 microscopy-positive样本以及在一个microscopy-negative样本。选中的特有的内部rt - pcr检测发现预期的病原体在所有microscopy-positive样品除了一个样品(6号、表 2),基于显微镜的报道 g . lamblia和一个示例(23号、表 2), 隐孢子虫spp。没有一个rt - pcr检测或MT-PCR工具检测到预期的寄生虫在这些样本可能代表假阳性显微镜报告(表 2)。的 隐孢子虫分析3确定 c . hominis在4和 c以及在八个样本。的 大肠阿米巴rt - pcr分析仅仅是积极的在1 8 microscopy-positive样品和没有microscopy-negative样本。七个microscopy-positive阴性样品 大肠阿米巴PCR分析时都是积极的 大肠dispar种特异的PCR。

从不同的测试套件和样品不一致的结果。

样本数量 麦克风。 G 我 一个 r d 我 一个 G 我 一个 r 贾第虫属 隐孢子虫
工具包一个 工具包B 工具包C 工具包D 工具包一个 工具包B 工具包C 工具包D
6 贾第虫属 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
7 贾第虫属 + / + 0/0 + / 0 + / + 0/0 0/0 0/0 0/0
8 贾第虫属 + / + + / + + / + 0/0 0/0 0/0 0/0 + / 0
9 贾第虫属 + / + + / + + / + + / 0 0/0 0/0 0/0 0/0
12 贾第虫属 + / + + / 0 + / 0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
15 加密 0/0 0/0 0/0 0/0 + / + 0/0 + / + + / +
18 加密 0/0 0/0 0/0 0/0 + / + + / + + / 0 + / +
23 加密 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
24 加密 0/0 0/0 0/0 0/0 + / + + / + 0/0 + / +
32 undet + / + 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
33 undet + / 0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
34 undet + / + + / + + / + + / + 0/0 0/0 0/0 0/0
35 undet + / + + / + + / + + / + 0/0 0/0 0/0 0/0
42 undet 0/0 0/0 0/0 0/0 + / + + / + + / + + / +
49 undet + / + + / + + / + + / 0 0/0 0/0 0/0 0/0
总积极 9 6 7 5 4 3 3 5

麦克风=显微镜;undet =未被发现;+ =积极;0 =负面的。重复测试结果显示为+ / +, +/ 0,0/0。不和谐的结果以粗体显示。装备=内部rt - pcr分析,工具包里达B =这样解释基因寄生凳子面板(PG1705),装备C = LightMix模块化的肠胃炎化验,和装备D = BD马克斯肠寄生虫面板。

无统计差异的数量正样本在显微镜和PCR检测的三个选择寄生虫( p = 0,22)。

 3.3。目标2

设备检测到的 g . lamblia在三个样品超过设备B, C两个样品超过工具包,和四个样品超过工具d c以及/ c . hominis设备检测到的一个积极的样品超过设备B和一个积极的样品包C,但仅有不到装备D .工具包D呈阳性 c以及/ c . hominis在样例(8号)的其他包检测 g . lamblia(表 2)。所有包检测 大肠阿米巴在相同的样本。

所有样品的测试,从重复的决定不一致的结果在一个示例使用内部分析(装备),两个使用工具包B,两个使用工具包C,并使用工具D(表三 2)。

没有一个MT-PCR包确认的存在 g . lamblia样本数量的32和33岁的在两个两个,一个是积极的两个复制,分别由内部rt - pcr。这两个样本来自同一个病人。样品三天后是积极的史坦顿国家参考实验室测试时血清研究所 。样本数量32和33因此被认为是真阳性但虚弱。

样品86号(没有显示在表 2)只是测试套件A、B和D,因此不包括在总数中。在这个示例中,装备都是积极的 g . lamblia和 大肠阿米巴,在的两个副本。这并不是证实了其他的测试套件。

抑制由粪便成分不是问题在这项研究中,据报道之前( 17]。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们评估PCR检测为更换显微镜常规检测diarrhoea-causing寄生虫。只与显微镜PCR检测特定的寄生虫。仔细选择目标的PCR检测是强制性的。同样重要的是要注意diarrhoea-causing寄生虫的出现在人口不针对选定的PCR检测和化验的患者数量受到排斥的特殊罕见的寄生虫( 18, 19]。

基于先前的频率检测显微镜和疾病严重程度我们决定建立PCR检测 g . lamblia, c以及/ c . hominis和 大肠阿米巴。之前唯一diarrhoea-causing寄生虫检测并没有针对性的PCR检测 环孢子虫种虫害和多一点的一个案例中平均每年。

三个不同的化验 c以及/ c . hominis执行同样但是化验1导致CT值和最低的是用于目标2。分析3区分 c . hominis和 c以及和用于随后的物种鉴定的阳性样本。快速物种鉴定为流行病学调查是有价值的。

内部rt - pcr检测 g . lamblia和 隐孢子虫种虫害microscopy-negative样本病人怀疑患有肠道寄生虫病,从而出现比显微镜更敏感。PCR此前报道更敏感比显微镜检测特定的寄生虫。在十抛在2007年的研究,PCR显示3.6%的敏感性比显微镜 贾第虫属在临床粪便样本( 32011年],斯塔克斯研究,PCR有更好的灵敏度为2.9% 贾第虫属和更好的敏感性为2% 隐孢子虫比显微镜( 5]。我们发现PCR检测到4.1% 贾第虫属比显微镜,但没有发现任何差异 隐孢子虫在这项研究中。PCR在显微镜的主要优点是获得的特异性之间的歧视 大肠阿米巴和 大肠dispar( 7- - - - - - 10]。从最初公布的七个八个样本 大肠阿米巴显微镜是消极的内部rt - pcr和随后被确认为 大肠dispar。

比较四个测试套件,包括内部试验基础装备,显示不同的复制测试结果。测试单一的决定可能会导致错误的结果在少数的情况下。未来可能会增加使用这些化验在重复运行测试。

本研究的局限性是首先样本大小,不允许差异的统计分析内部显微镜和rt - pcr检测的性能。倾向的内部检测被认为当比较变异复制和敏感的商业测试工具。

的肠道寄生虫病病例的数量在我们注册的LIS多年来,收集更多的样品需要时间。寄生虫microscopy-negative样本的检测表明,更换显微镜与PCR会增加积极的利率,从而缩短所需的时间来建立大样本集合。

 5。结论

在我们的设置相关的测试 g . lamblia, C,以及孢子/ C。hominis,和 大肠阿米巴。我们希望更换显微镜与内部rt - pcr检测这些寄生虫会导致积极的利率更高 g . lamblia和 C,以及孢子/ C。hominis,而假阳性结果 大肠阿米巴将会避免的。添加第二个测试区分 c以及和 c . hominis将有价值的暴发的早期发现。

这里所有的商业MT-PCR工具评估检测相关的目标。然而,一些性能的变化被认为在使用工具时。方法检测肠道原生动物的选择可能取决于设置。PCR显微镜相比不太敏感,不具体,更耗费时间,更依赖于个人技能。商业PCR试剂盒的使用可能有吸引力在实验室处理中等数量的样本,而内部可以建立PCR检测和维护大型吞吐量分析,主要是由于降低成本。

 信息披露

赞助商没有任何作用,研究设计,数据的收集、分析和解释。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项研究是一个博士项目的一部分从丹麦后组织和支持格兰特:美联社Møller基础医学科学的进步,“Fonden其他Læge poulsen Mindelegat,“Beckett-Fonden,地区Syddanmarks和地区Sjællands Fælles Forskningspulje,南丹麦大学,临床微生物学欧登塞大学医院的部门。作者感谢实验室工作人员的部分部门的寄生虫学临床微生物学欧登塞大学医院,欧登塞,丹麦,他们帮助收集粪便样本和临床微生物学在Slagelse医院,Slagelse,丹麦,使用他们的BD MAX系统,特别蒂娜Vasehus马德森,博士,协助测试。他们也感谢陈明博士在临床微生物学,医院的日德兰半岛南部,Sønderborg,丹麦,修改论文。

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