1。介绍
在全球范围内,每年约3亿疟疾病例和一百万人死亡(
1 ]。多数疟疾病例和死亡被发现在撒哈拉以南非洲地区在婴儿和5岁以下儿童死亡率最高的年
2 ]。使用有效的药物来治疗疟疾病例是一个关键的干预。然而,抗疟药物治疗如以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)面对耐药性的日益增长的威胁(
3 ]。耐药寄生虫发展后长时间暴露于抗疟药。这种药压力促进寄生虫菌株的出现具有妥协或规避药物的分子机制的有效性。与ACT-resistant情况就是这样
恶性疟原虫 寄生虫,推迟寄生虫间隙,在东南亚已确定。日益增长的威胁行为和其他目前服用药物的耐药性疟疾治疗需要新产品的开发(
4 ]。
大约122种药品生产从94种植物通过发现人种植物引起的
5 ]。大多数传统药用植物被认为是安全的基于可用的人种的医学知识。药物已经生成从植物因为他们的可用性、有效性,及其作用方式(
6 ]。尽管如此,更多的研究是必要的发现、评估、和验证植物来源的新药(
7 ]。
大豆(
大豆 )属于植物大家庭
豆科 ,他们生长在热带、亚热带和温带气候地区。种子测量8到10毫米直径和成长在一个圆荚体类似豌豆(
8 ]。它们包含20%的含油量和富含植物化学物质的健康福利,因此使他们氾滥或功能粮食作物。(
9 ]。传统上,
大豆 叶、根和种子是用于治疗各种疾病,包括疟疾(
10 ]。工厂已经证明具有显著的生物活性如抗氧化剂(
11 ,抗炎
12 ,抗糖尿病的
13 ),抗抑郁药(
14 ),和抗菌
15 ]。大豆对动脉粥样硬化有愈合的潜力、骨质疏松症和各种类型的癌症包括那些影响前列腺癌、乳腺癌和子宫
15 ]。他们也含有异黄酮,被认为是一个主要因素的抗氧化活性豆类(
16 ]。一项研究大豆脂肪乳剂的抗疟属性显示
大豆 表现出一种很有前途的抑制对3 d7的活动
恶性疟原虫 与集成电路50 值从8.07±2.13,13.02±2.35
μ 克/毫升(
17 ]。本研究中使用大豆脂质提取Deharo等人被Intralipid®和Ivelip®商业产品用于静脉注射补充脂质。研究了大豆的抗疟潜力虽然根治方法无法建立。当前的研究着手评估antiplasmodial和大豆种子提取物的抗疟活动除了脂质提取。此外,毒性研究来确定提取的致命剂量。
2。材料和方法研究设计的概述
这项研究是一个实验室试验研究的潜在antiplasmodial和大豆抗疟活性(
大豆 )提取(SE)。原油antiplasmodial活动本身是通过评估antiplasmodial活动原油SE (
在体外 )
恶性疟原虫 文化和一个
鼠体内 鼠标疟疾模型(
在活的有机体内 )评估。进行了研究中心的生物技术研究和开发(CBRD)和动物屋在肯尼亚医学研究所(亚特兰大),分别。
2.1。采购的<斜体>大豆< /斜体>种子
大豆种子品种某人19收集和装在塑料纸袋从肯尼亚农业和畜牧业研究组织(KALRO)在内罗毕,肯尼亚,2018年10月。种子被风干3周在室温和粉使用实验室米尔斯。
2.2。制备大豆提取物
三种提取物(水、甲醇和肽)准备从研磨大豆种子。
2.2.1。水和甲醇提取制备
100克的大豆粉末浸渍在1升的各自的溶剂(水或甲醇)。解散后,样品的解决方案是动摇的孵化器瓶在中等温度37°C±2 7天。后来的采集标本瓶和过滤最初用棉布,然后绘画纸滤纸# 01这样一个透明的解决方案。水和甲醇滤液下放置在一个开放的水浴的溶剂蒸发35°C±2 6 - 7个小时每天,直到干提取。干提取物在−转移到瓶和存储20°C进行进一步分析和将来使用。
2.2.2。肽提取制备
准备肽提取、10 g的大豆粉末添加到100毫升冷提取缓冲(10毫米Na2 HPO4 15毫米,不2 阿宝4 100米MKCl, 1.5% EDTA) pH值5。的解决方案是孵化3小时在4°C。沉淀得到的饱和度和离心机在每分钟2500转。原油肽丸被风干,储存在−20°C进行进一步分析和将来使用。一个提取准备使用在两种
在体外 和
在活的有机体内 实验。尽管长时间的使用
大豆 提取几个月,它仍然继续活动,因此可能长的保质期。
2.3。植物化学的初步筛选
筛查的植物化学物质,大豆提取物(使用标准方法进行了一些修改
18 ]。
2.4。体外<斜体> < /斜体> <斜体> P的培养。恶性疟原虫< /斜体>
氯喹(CQ)敏感(D6)和CQ-resistant (W2)
恶性疟原虫 菌株被用来评估大豆提取物的antiplasmodial活动和部分红血球的阶段
在体外 。文化是保持在生物技术研究和发展中心(CBRD)肯尼亚医学研究所(亚特兰大)。的
恶性疟原虫 文化是保持根据载体和詹森(描述的方法
18 与一些细微的修改。
恶性疟原虫 (D6和W2)文化是保持新鲜的人类红细胞悬在4%比容RPMI 1640(σ)含0.2%碳酸氢钠,0.5% albumax和45
μ 50 g / L次黄嘌呤,
μ g / L庆大霉素和孵化37°C下5%的氧气的气体混合物,5%的二氧化碳,和90%的氮气。受感染的红细胞被转移到新鲜每天完成媒介来传播文化。在
恶性疟原虫 (印度应变)培养基,albumax汇集人类血清取而代之的是10%。寄生虫血症光学显微镜使用定性、定量测定(染色染色)。
2.5。体外<斜体> < /斜体> Antiplasmodial化验使用大豆提取物
评估antiplasmodial SE提取的活动,一个
在体外 系列采用微量分析技术措施的能力,提取抑制[G3H]次黄嘌呤的合并
恶性疟原虫 使用(
19 ]。96孔板上的实验。首先,25
μ l培养基的添加到所有96口井的井平底的微量滴定板除2nd 行。50
μ l整除的三种提取解决方案(水、甲醇和肽)补充道,一式两份,威尔斯的第二行。Titertek机动的手稀释剂(流实验室中的英国)被用于制造双重连续稀释的大豆提取64倍浓度范围。股票的解决方案(100
μ 3 g / ml)的大豆提取物稀释双重直到浓度为1.56
μ g / ml。磁化率测试是使用一个初始执行寄生虫血症增加200年的0.4%
μ l 1.5%的比容
恶性疟原虫 文化对每一个96孔板,除了最后4井的第一行。寄生和nonparasitized红细胞被添加到所有试验井的方式比容保持寄生虫血症0.4%和1.5%。在每个antiplasmodial测试之前,寄生虫文化同步环阶段串行氯喹治疗后获得。第一行作为积极的控制,因此不进行治疗。前4井作为负控制正常生长和含有200
μ l (
疟原虫 空白的红细胞。氯喹代替提取参考药物对标准化试验(积极的控制)。盘子在孵化后37°C(3%股份有限公司2 ,5%的人啊2 ,92%的人没有2 )48小时,radio-labelled次黄嘌呤被添加到每个(0.5
μ l在25
μ l培养基)。板块进一步孵化了18个小时,允许其吸收幸存的寄生虫。第二个孵化后,一夜之间,盘子被冻结在−20°C停止增长。板块在室温下解冻了收获前1.5小时。每个好使用Betaplate TM收获细胞收割机(华莱士,苏黎世瑞士),红细胞,转移到玻璃纤维过滤器,用蒸馏水洗净。干燥过滤器被插入到塑料薄膜与10毫升的液体闪烁计数Betaplate TM液体闪烁计数器(Wallac微βTrilux)。结果记录为每分钟计数(cpm)在每个浓度。被转移到MS Excel软件和数据表示为一个百分比的未经处理的控制。药物浓度抑制50%的能力
恶性疟原虫 (集成电路50 )是由对数变换的药物浓度和放射性计数每分钟(cpm)使用公式:
(1)
集成电路
50
=
反
日志
日志
X
1
+
日志
Y
50
−
日志
Y
1
日志
X
2
−
日志
X
1
日志
Y
2
−
日志
Y
1
,
在哪里
Y 50 是cpm值介于寄生和nonparasitized控制文化,
X 1,
X 2的浓度,
Y 1,
Y 2是cpm值,分别为数据点上方和下方的cpm中点
20. ]。确定SE集成电路50 值分类表
1 根据所提供的标准(
21 ]。
表1
采用antiplasmodial活动的分类。
集成电路50 值(
μ g / ml)
类别的活动
> 100
不活跃的
50 - 100
低
10 - 50
温和的
≤10
高
2.6。动物处理、寄生虫接种和大豆提取物的抗疟效果
女性瑞士白化小鼠衰老6 - 8周大随机选择从内罗毕以及动物设施。他们重达到20±2 g和安置在已标示标准microlon II型笼实验房间。房间的相对湿度维持在60 - 70%。此外,适当的通风和室温下被观察到。动物喂养与提供可行的啮齿动物饲料和水
随意 。每个笼子里容纳五个老鼠每个测试样本。
鼠体内 安卡寄生虫是寄生虫的候选人评估减少小鼠(
21 ]。寄生虫是来自肯尼亚医学研究所以及内罗毕subpassage和维护的老鼠。血液感染
p .鼠 应变安卡从供体小鼠心脏穿刺到15毫升离心管含有1% (w / v)肝素。寄生血液稀释达到大约108 每毫升寄生的红细胞(红血球)。实验动物腹腔内感染0.2毫升(2×107 红细胞表面寄生)和随机分组。
2.7。药物和管理
大豆提取物、PBS和氯喹的口服药物测试组,消极组,分别和积极的集团。使用不锈钢金属喂养插管期间管理(
22 ]。
2.8。评估预防性大豆提取物的活性
SE和氯喹的预防性活动被Ryley用描述的方法评估和彼得斯
23 ]。小鼠随机分为5组,每组5老鼠在笼子里。组1 - 3是口头管理200,400和800毫克/公斤/天分别为SE。4组小鼠接种5毫克/公斤/天的氯喹(积极的控制),而5组小鼠接受安慰剂3%二甲亚砜和10%渐变组成的80年PBS(负控制)。管理SE继续连续3天,即,从0到每天3。第四天,老鼠注射
p .鼠 (安卡)。每个鼠标的寄生虫血症水平评估血涂片后72小时。存活率在所有组每天监控postinoculation 28天。Giemsa-stained薄血涂片准备从每只动物的尾巴确定寄生虫血症和抑制百分比。
2.9。评估疗效的大豆提取
SE的方法来评估schizontocidal活动建立感染被Tona et al。
24 使用了)。0.2毫升的
p .鼠 安卡(2×107 寄生红血球)腹腔内注入25老鼠第一天。两个小时后,小鼠随机分为5组,每组5老鼠。实验治疗组口服单0.2毫升剂量的SE的三个剂量水平的200年,400年和800年在组1到3毫克/公斤,分别。阳性对照组(4组),5毫升/公斤/天的氯喹是管理。5组,这是消极的控制,接受安慰剂(车辆;80年3%二甲亚砜,10%渐变PBS)。SE和药物管理每日3天0到3天。薄涂片染色准备从血液从尾巴获得收集每天的治疗监测感染的目的。寄生虫血症4天后确定最后一次治疗后(24小时)通过显微镜检查计数寄生虫4领域覆盖100红细胞的薄血膜采样实验老鼠的尾巴沾10%染色方案。之间的差异意味着每个视图的寄生虫数量负对照组(100%)和实验计算和百分数表示的寄生虫血症抑制(化疗抑制)为每个组,根据Tona et al。
24 ]:
(2)
寄生虫血症抑制
PS
=
一个
−
B
一个
×
One hundred.
,
在哪里
一个 =意味着寄生虫血症-控制在4天
B 测试组=相应寄生虫血症。
作为寄生没有寄生虫血症比例计算。每100人的红细胞红细胞,而化疗抑制百分比为抑制寄生虫乘法相对于控制用百分比表示。存活率在所有组每天监控postinoculation 28天。寄生虫在负对照组化疗抑制认为经历了1%(药效的药物抑制寄生虫乘法)。
2.10。测定提取物毒性
半数致死量(LD50 )确定评估急性毒性的大豆提取使用的方法Lorke [
25 ]。方法腹腔内管理涉及不同剂量(1500、2500、3500和5000毫克/公斤)的SE的四组瑞士白化病老鼠。之后,小鼠的死亡率和表现体征可能的毒性监测。
2.11。数据和统计分析
分析数据平均值±标准偏差。
在体外 测试是在重复执行和数据被Microsoft Excel 2016的帮助下进行非线性回归分析确定集成电路50 。分析
在活的有机体内 工作是通过使用SPSS版本25。组内,对比的统计显著性减少寄生虫血症和生存时间达到使用单向方差分析(方差分析)和图基的诚实的显著差异事后测试。
2.12。道德的考虑
允许进行这项研究是获得科学和伦理审查单位(塞鲁)、(塞鲁没有学习。3795)。实验进行了符合动物保健和使用委员会(ACUC)和亚特兰大的规定。此外,值建立的国际实验动物使用和护理随访按照世界卫生组织的建议。腹腔内注射进行使用计23针。死亡在实验结束了在氧化碳(IV)气室中焚烧紧随其后。
3所示。结果
3.1。植物化学的分析
八个定性化学测试三个大豆提取物进行了确定酚类,类黄酮,单宁,类固醇,生物碱、皂甙、苷类和萜类化合物。结果显示存在类固醇、生物碱、皂苷的水提物和甲醇提取(表
2 )。黄酮类、类固醇、苷和肽提取单宁在场。
表2
植物化学的筛选结果的三种提取大豆提取。
植物化学的
水提物
甲醇提取
肽提取
酚类
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
类黄酮
- - - - - -
+
+
丹宁酸
- - - - - -
- - - - - -
+
类固醇
+
+
+
生物碱
+
+
+
皂苷
+
+
- - - - - -
配糖体
- - - - - -
+
+
萜类化合物
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
植物化学物质被表示为(+)或缺席(-)。
3.2。急性毒性研究
急性毒性的结果表明,提取没有造成死亡的剂量范围内1500 - 5000毫克/公斤在最初24小时内以及连续14天。这是一个清楚地表明,剂量使用是安全的。没有身体和行为的迹象overtoxicity减少电动机等活动,降低了身体/肢体语气,扭动,呼吸,死亡在观察别人。这提出了LD50 提取的大于5000毫克/公斤。
3.3。体外<斜体> < /斜体>评估Antiplasmodium SE的活动
三种不同提取物的的活动
大豆 对两株
恶性疟原虫 范围从活动适度活跃的水提物对甲醇和肽提取(表
3 )。甲醇和肽提取物显示良好的活动对D6和W2菌株。然而,甲醇提取显示最好的活性肽提取紧随其后。
表3
在体外 antiplasmodial活动三种提取的大豆
大豆。
治疗
提取收益率(%)
D6-IC50 (平均数±标准差)(
μ g / ml)
W2-IC50 (平均数±标准差)(
μ g / ml)
水提物
9.90
> 200
> 200
甲醇提取
7.40
10.142±9.043
14.867±3.439
肽提取
57.50
19.967±2.517
28.613±1.324
控制(CQ)
0.011±3.120
0.091±0.031
水提取物有集成电路50 > 200
μ g / ml,从而表现出没有活动的两种
恶性疟原虫 。
3.4。体内<斜体> < /斜体>甲醇和肽提取物的抗疟治疗活动<斜体>大豆< /斜体>
两种大豆提取物显示活动(甲醇和肽)
在体外 下进行抗疟活性检测与研究
p .鼠 ANKA-infected瑞士白化病老鼠。这是使用为期4天完成甲醇和肽提取物的抑制方法。这项研究的结果发表在表
4 。Chemosuppresion成立于剂量依赖性的方式使用SE提取物抗疟治疗四天后(200 - 800毫克/公斤)。均值寄生虫血症治疗组与甲醇范围从3.48±0.37,5.99±0.18,而动物对待肽提取变化从3.61±0.27,5.87±0.25。寄生虫血症在负对照组的平均值为12.87±0.26。寄生虫血症比例有明显差异的测试组与未经处理的对照组相比,(
P
<
0.001
)。在800毫克/公斤,提取了chemosuppresion最高。值得注意的是,有一个微小的区别chemosuppresion积极的控制和两个提取物。提取物能够延长生存的动物治疗后终止相比,消极的控制。
表4
在活的有机体内 粗提物的抗疟药活动
大豆 在测试4天治疗和动物生存时间。
治疗
剂量(毫克/公斤)
平均数±标准差寄生虫血症(%)
%抑制寄生虫
平均生存时间(天)
甲醇提取
200年
5.99±0.18
53.45
10.50±0.58
400年
4.54±0.22
64.67
11.25±0.96
800年
3.48±0.37
72.93
16.25±0.96
肽提取
200年
5.87±0.25
54.39
11.00±0.82
400年
4.52±0.13
64.89
12.40±1.14
800年
3.61±0.27
71.90
15.60±1.52
CQ
1.19±0.36
90.72
28.25±1.50
车辆(80年3%二甲亚砜和10%渐变PBS)
12.87±0.26
5.00±0.82
∗
结果表示为平均数±标准差。
3.5。体内<斜体> < /斜体>抗疟预防性活动<斜体>大豆肽提取的< /斜体>
在预防性试验,寄生虫血症在负对照组明显高于任何测试组(
P
<
0.001
)。所有的动物阳性组显示抑制寄生虫血症83.09%。肽提取物抑制寄生虫血症组为64.66%,57.12%,和43.14%剂量的800,400和200毫克/公斤。平均寄生虫血症与肽治疗组范围从3.94 + 0.46 - 6.35 + 0.22。这项研究的结果发表在表
5 。肽提取能够延长生存的动物治疗后终止相比,消极的控制。
表5
在活的有机体内 粗提物的抗疟药活动
大豆 在预防性测试4天postparasite暴露和动物存活时间。
治疗
剂量(毫克/公斤)
平均数±标准差寄生虫血症(%)
%抑制寄生虫
平均生存时间(天)
肽提取
200年
6.35±0.22
43.14
7.50±0.58
400年
4.78±0.30
57.12
9.25±0.96
800年
3.94±0.46
64.66
10.25±0.96
CQ
1.89±0.16
83.09
28.25±1.50
车辆(80年3%二甲亚砜和10%渐变PBS)
11.16±1.15
5.00±0.82
∗
结果表示为平均数±标准差。
4所示。讨论
许多抗疟药物目前在市场上已从植物和天然产物开发(
25 ]。
恶性疟原虫 抵抗现有的抗疟药需要改进药物干预措施的发展(
26 ]。这一挑战的最佳解决方案仍然可能治疗植物(
27 ,
28 ]。青蒿素衍生物已被用于管理疟疾长(
29日 ]。奎宁是获得广泛用于治疗疟疾
金鸡纳树皮ofcinalis 植物(
30. ]。大多数人在非洲由于购买力大大依赖传统的补救措施(
30. ]。本研究调查了大豆抗疟活动和安全属性(
大豆 ),以确定其潜在的小说和便宜的抗疟代理。
这项研究清楚地显示潜在的活动
大豆 种子提取物对疟疾。甲醇和肽提取植物化学的分析揭示了类黄酮的存在,生物碱,类固醇,苷与水提物中只有类固醇和生物碱。据报道,口服的植物化学物质如皂苷、丹宁酸和酚类具有抑制细胞免疫能力(
31日 ]。之前的研究表明,在植物次生代谢物的数量可以检查药物研究中发挥更大的作用。以前,生物碱、皂苷、类黄酮和单宁已经证明援助抗菌和抗疟活动被选中的药用植物
32 ]。值得注意的是,我们的结果符合Arora的(
14 )报告的生物碱、黄酮类、单宁和皂甙在确定抗菌效果
大豆 。因此,这项研究的结果可能已经受到单一或组合的提到的植物化学的粗提取物中成分发挥活动对抗疟疾。
一个理想的抗疟应该安全无任何副作用。我们跑的毒性研究评估使用这种植物提取的适宜性。结果表明,浓度的提取上的应用
在活的有机体内 实验动物是无害的,没有死亡指出最初的24小时内,连续14天用量在1500 - 5000毫克/公斤。重要的是,动物活着呆了整个四天的实验表明安全所显示Satayavivad et al。
33 在他们的工作。
我们的研究结果一致与Deharo et al。
17 antiplasmodial)进行评价和抗疟大豆脂肪乳剂的属性。他们记录下antiplasmodial IC的活动50 13.02±2.35 mg·毫升−1 在使用指示Ivelip测试样品的快速抑制寄生虫。在这项研究中,
在体外 肽和甲醇提取物的化验显示活动与IC50 19.97±2.57
μ g / ml和10.14±9.04
μ g / ml D6应变和28.61±1.32
μ g / ml和14.87±3.43
μ 分别对W2 g / ml应变。然而,我们的不同
在活的有机体内 试验,他们报道降低疟原虫抑制百分比在使用Ivelip测试样本,即。在3.2 g·公斤−1 ,减少35±26日被记录。可能结果的差异可能是由于不同的样品使用。然而,他们的发现和我们提供一个清晰的图片对疟疾这种植物的潜在使用管理。在我们的研究中,
在活的有机体内 化验显示,好活动的显著减少寄生虫血症比例相比,测试组的负对照组(
P
<
0.001
)。
在活的有机体内 抗疟活动分为三个类别的分类:温和,好,很好,如果提取显示寄生虫血症抑制比例等于或大于50%
34 ]。在目前的研究中,很好的结果在治疗测试甲醇和chemosuppresion肽提取物表现出超过50%。甲醇和肽提取物表现出高抑制活性的使用剂量800毫克/公斤,72.9%和71.9%。值得注意的是,有明显降低(
P
<
0.001
)活动与低剂量400毫克/公斤64.7%和64.9%,53.4%和54.4%在200毫克/公斤,分别在治疗试验。最多是由疟原虫抑制72.9%和71.9%甲醇和肽的最高剂量800毫克/公斤,最长存活时间比其他剂量。这可能是由于这样的事实,负责抗疟活性化合物活动主要发生在低水平的自然产品和活动可能无法发现低剂量(
35 ]。同样,在预防性试验、肽提取物表现出抑制活性的64.7%在800毫克/公斤,57.1%在400毫克/公斤,43.1%在200毫克/公斤。符合上述表现出结果,Bonkian et al。
36 )使用两个萨赫勒地区的植物提取物显示剂量依赖性活动。他们记录了寄生虫减少57.5%、35.9%、和44.9%剂量的100,250和500毫克提取/体重
Guiera senegalensis 分别提取。相反,
紫荆花rufescens 提取了寄生虫的镇压活动50.6%、22.2%和25.7%。在其他地方,Menard et al。
37 )从事青蒿素耐药性的感应。他们能够隔离后的耐药表型连续32药物压力通过周期。Blasco说明等。
38 表明氯喹是根除疟疾的主要停留后发现直到抗寄生虫破坏了其使用在短期内呼吁立即撤军。这生动地解释说,使用的原油提取有机会推迟耐药性与单一化合物。此外,原油提取作为孤立的初步步骤的纯有效的抗疟药物。研究先前在
大豆 确实成立,其具有抗氧化作用
11 ]。据报道,抗氧化活性可以抑制血红素聚合血红素氧化聚合之前,unpolymerized血红素是非常有毒的疟疾
39 ]。因此,这也可以认为是一个因素,导致存在抗疟活性
大豆 。chemosuppresion数据显示,寄生虫间隙在第四天更明显。这可能归因于高血液中的药物浓度由于重复给药。有趣的是,这种寄生虫减少活动表现出第四日表明,化学成分的生物利用度存在于原油提取不可能受到生物转化和生理因素的影响。的作用机制
大豆 目前还不清楚。然而,现有文献的研究表明,一些植物和种子展览antiplasmodial活动通过引起红细胞氧化(
40 )或抑制蛋白质合成(
40 根据植物化学的成分。黄酮类化合物已知发挥antiplasmodial活动通过螯合核酸碱基配对的寄生虫
36 ]。因此,它是可能的,antiplasmodial活动展出
大豆 可能是由于上述方法或不同的未知的机制。这项研究的局限是识别特定化合物的抗疟负责活动没有完成因为这是超出了本研究的范围。因此,我们建议,应该进行进一步的分析
大豆 种子来识别特定的抗疟化合物存在。