JPATH 杂志的病原体 2090 - 3065 2090 - 3057 Hindawi 10.1155 / 2018/1068758 1068758 研究文章 传播和分子特性的生物反应器改编非常致命的传染性法氏囊病病毒分离株的马来西亚 Lawal 纳菲'u 1 2 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6052 - 3290 Hair-Bejo 穆罕默德 1 3 http://orcid.org/0000 - 0001 - 8357 - 4701 艾尔沙德 西蒂苏瑞 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 7379 - 0507 奥马尔 阿卜杜勒·拉赫曼 1 3 http://orcid.org/0000 - 0001 - 8640 - 517 x Ideris 爱伲人 3 4 梅西 Patrizia 1 兽医病理学和微生物学 兽医学院 马来西亚Putra大学(其) 43400年Serdang 雪兰莪州 马来西亚 upm.edu.my 2 美国兽医微生物学 兽医学院 Usmanu Danfodiyo大学 索科托市(UDUS) 索科托州2346 尼日利亚 udusok.edu.ng 3 实验室疫苗和免疫治疗 生物科学学院 马来西亚Putra大学(其) 43400年Serdang 雪兰莪州 马来西亚 upm.edu.my 4 兽医临床研究 兽医学院 马来西亚Putra大学(其) 43400年Serdang 雪兰莪州 马来西亚 upm.edu.my 2018年 2 9 2018年 2018年 11 01 2018年 01 07年 2018年 01 08年 2018年 2 9 2018年 2018年 版权©2018纳'u Lawal et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

两个马来西亚非常致命的传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)菌株UPM0081(也称为B00/81)和UPM190(也称为UPM04/190)与当地IBD爆发在2000年和2004年,分别分别通过连续12次11-day-old特定病原体免费(SPF)鸡肉受孕的鸡蛋(CEE)通过绒毛膜尿囊的膜(CAM)的路线。中东欧8通道(EP8)隔离通道一旦在bgm - 70细胞株产生UPM0081EP8BGMP1 UPM190EP8BGMP1,虽然EP12隔离通道15倍bgm - 70细胞株产生UPM0081EP12BGMP15和UPM190EP12BGMP15使用T25组织培养瓶。这些隔离都是传播一次生物反应器使用cytodex 1微载体在3 g / L (3 g / L)收益率UPM0081EP8BGMP1BP1 UPM190EP8BGMP1BP1 UPM0081EP12BGMP15BP1, UPM190EP12BGMP15BP1隔离。病毒在接种后3天,收获后出现细胞病变效应(CPE)以超然的微载体使用标准协议和过滤使用0.2 μm注射器过滤器。IBDV的滤液是积极的rt - pcr和免疫荧光。序列和系统发育树分析表明,隔离是vvIBDV菌株和不是不同于烧瓶父母传播病毒。

 TechnoFund项目 6364002 科学、技术和创新,马来西亚 HiCoE项目 6369101 高等教育、马来西亚 1。介绍

传统上,传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性法氏囊病(IBD)的病原体,通过接种隔离疑似样本到9 11-day-old中东欧通过凸轮路线( 1]。然而,这种技术并不总是有效的,因为一些病毒的变异菌株不诱导胚胎死亡率( 2),感染指数,凸轮接种方法主要取决于显示富有成效的感染。炎症性肠病诊断的发展使许多炎症性肠病病毒(IBDV)隔离在初级禽细胞培养适应来自鸡胚胎组织从器官如肾脏(CEK),囊(CEB)和肌肉(CEF) [ 3, 4]。然而,这些细胞被发现产生病毒效价低,有限的细胞生长,可能是污染源与无关的禽流感病毒( 5, 6]。解决这些问题研究在细胞培养技术导致的发现的哺乳动物细胞系起源易于处理和操作,有无限的寿命,从无关的禽流感病毒是免费的。许多哺乳动物细胞来源于现在广泛使用的生产重组蛋白如酶、激素、趋化因子、细胞因子、抗体和疫苗用于治疗人类和动物,引发巨大的投资在研究和开发的努力的动物细胞生产汽车商业化的产品( 7]。因为安全需求飙升的细胞培养产品尤其是疫苗,目前迫切需要提高细胞的生产率以最少的投资资源/设备和减少微生物污染和绝对控制的生产参数,需要满足的生物反应器技术的介绍( 7, 8]。传染性法氏囊病疫苗主要是使用特定病原体产生自由(SPF)中东欧是昂贵的,需要大型设施,难以扩大,费力,阻碍了SPF鸡蛋的供应有限 6]。对于vvIBDV,局限性更由于这些菌株适应细胞培养的困难( 6, 9]。一种范式转移细胞培养IBD疫苗使用生物反应器技术将有助于减少全球家禽业带来的威胁IBD通过疫苗的发展,在快速反应的灵活性将大大降低的时间框架开发和批准疫苗,从而有效地减少了从实验室到市场(Meuwly时间 等,2006)( 10]。桌面生物反应器的发展缩小从实验室和工业规模以适应有效运转,同时占用最小板凳的空间彻底改变了人类和动物疫苗学的领域( 11]。在使用几种细胞系细胞培养疫苗的开发维罗(其中有 12, 13),赵 12, 14),RK-13(里纳尔蒂 等,1972),和bgm - 70细胞( 12, 14, 15]。几个细胞系细胞培养系统中用于生产IBD疫苗( 16, 17]。细胞系bgm - 70来自婴儿grivet猴子据报道,支持快速增长和减弱古典,变体,非常致命的IBDV毒株和病毒效价高 6, 15, 18]。这个连续细胞系的能力创造更高的病毒滴度是一个有价值的特性,使得越来越多的病毒在他们有利的原代细胞培养除了方便。尽管有这些优点,病毒滴度获得连续细胞系使用烧瓶传统文化方法往往不足以满足家禽疫苗所需的过度需求和生产速度生产减少生产损失归因于疾病。这个缺点是进一步复杂化时遇到的常见细菌和真菌污染处理的细胞在培养技术( 19]。bgm - 70细胞系被选为当地马来西亚的传播IBDV隔离在生物反应器来评估的能力支持病毒在生物反应器的发展。这是由于获得的高效价细胞系时用于传统的瓶文化传播病毒,证实了早些时候的报道,其潜力( 14, 18, 20.];Abdel-Alim et al ., 2003;( 15]。

虽然使用生物反应器来传播病毒已经建立,vvIBDV使用生物反应器系统的传播是不报道。本研究的假说,bgm - 70改编和传播IBDV可能适合在微载体和传播使用生物反应器系统。因此,本研究的目标是马来西亚的传播vvIBDV隔离,UPM0081和UPM190 bgm使用生物反应器- 70细胞,分离和分子特征。

 2。材料和方法 2.1。IBDV隔离和bgm - 70细胞

vvIBDV隔离保持凸轮匀浆是孤立的从当地IBD的爆发在2000年和2004年在马来西亚,并指定UPM0081(也称为B00/81 AY520910)和UPM190(也称为UPM04/190 AY791998),分别。这些分离株分别通过连续12次11-day-old特定病原体免费(SPF)鸡肉受孕的鸡蛋(CEE)通过绒毛膜尿囊的膜(CAM)的路线。中东欧8通道(UPM0081EP8加入KY411643数量,和UPM190EP8加入KY411645)隔离的通道在bgm - 70细胞系(EP8BGMP1)引起UPM0081EP8BGMP1 UPM190EP8BGMP1,而中东欧通道12 (UPM0081EP12-KY411641和UPM190EP12)分离的连续通道在bgm - 70细胞系(BGMP1-15)引起UPM0081BGMP15 15倍(加入KY418012)和UPM190EP12BGMP15(加入KY418010)使用T25组织培养瓶。病毒滴度获得bgm - 70瓶传播EP8隔离通道1 1.0×103所示。8TCID50/毫升和1.0×104.4TCID50/毫升UPM0081EP8BGMP1 UPM190EP8BGMP1,分别,而浓度获得bgm - 70瓶传播EP12隔离在一段15 109.2TCID50/毫升和1.0×109.5TCID50/毫升UPM0081BGMP15 UPM190BGMP15,分别确定先前描述使用标准技术(Reed, & Muench, 1938)。这些各自的分离是利用生物反应器(BP1)的一次传播。

bgm - 70细胞株是一个epithelial-like细胞来自婴儿grivet猴肾(ECACC猫没有。90092601)来自欧洲的身份验证细胞培养(ECACC, Porton下来,索尔兹伯里,SP4 0詹,英国),并保持在最低基本培养基(MEM)补充10%胎牛血清和5%股份有限公司2在37°C。15汇合的25厘米2水瓶是用于种子细胞无菌cytodex 1微载体。

 2.2。Prebioreactor文化

T-25烧瓶(康宁)被播种大约2.5 x104细胞/厘米2在prewarmed MEM补充10%胎牛血清的边后卫。播种的玻璃瓶是在孵化器孵化37°C公司为5%2条件。日常的观察每一个烧瓶进行至少两次使用一个倒置显微镜(日本奥林巴斯®)完成单层的形成。融合后,prewarmed Ca的细胞被洗2 +/毫克2 +免费的杜尔贝科的PBS ( D1408σ)和脱离的烧瓶StemPro®Accutase®(A11105-01 Gibco,美国)的分裂活动并没有停止,直到所有的细胞成为脱离烧瓶。分离细胞生物反应器用于种子。

 2.3。微载体的制备

Cytodex 1微载体(# 17-0448-01,通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)使用3 g / L的最终浓度根据制造商的指示。微载体水分在硅化玻璃容器使用Ca2 +/毫克2 +免费的杜尔贝科的PBS ( D1408σ)(pH值7.4)4到6个小时。水化后,微载体与Ca冲洗三次2 +/毫克2 +免费的PBS,紧随其后的是高压灭菌法在121°C(15分钟 21]在生物反应器(生物系统Fermetec资源,雪兰莪州,马来西亚)和微载体冲洗之前和200毫升的无血清MEM细胞播种。

 2.4。bgm - 70细胞培养在生物系统Fermetec生物反应器系统

bgm - 70细胞培养的生物反应器系统,2 L搅拌釜反应器(生物系统Fermetec生物反应器系统)使用。MEM补充10%的200毫升的边后卫被添加到微载体,并允许站30分钟。随后又添加bgm - 70细胞悬浮在800毫升的生长媒体1.5 X 10的细胞密度4微载体/毫升。文化条件37°C, pH值7.2(有限公司2和NaHCO3控制),50%空气饱和溶解氧(做) 22, 23]。甚至获得附件微载体,Gouzgeng的方法 等。( 1114岁)是适应与最初的连续搅拌转速/ 5分钟紧随其后的增加速度25转/ 5分钟24小时后被用作搅拌条件( 11]。的文化进行了一式三份。病毒文化没有进行媒体改变感染复数(MOI) 1和文化收获在72小时后接种100%细胞病变效应(CPE)。收获,生物反应器螺旋桨转向全速激动的微载体和促进细胞移动。微载体允许定居之前已筛无菌70 μ病毒m细胞过滤器和滤液悬挂于500年三次冻融和离心机 x在4°C g 20分钟。上层清液过滤使用0.22 μm注射器过滤器(Millex®,默克密理博,德国)和整除,储存在−直到需要80°C。

 2.5。细胞培养的抽样和分析

常规细胞取样,5 - 10毫升细胞取样使用取样瓶安装采样端口。10毫升注射器配备了一个0.22 μm注射器过滤器(Millex®,默克公司)被用来创建一个负压的另一面抽样样本来自港取样瓶的生物反应器。采集标本在6 - 24小时后播种(ps)。采样细胞数与血细胞计数器利用台盼蓝排斥决定细胞生存能力。计算细胞,800 μL的上层清液被删除,取而代之的是同等体积的0.4%台盼蓝。暂停是轻轻地混合细胞在血细胞计数器计数室用倒置显微镜(日本奥林巴斯)10 x放大。细胞生存能力计算根据以下方程: C = 一个 V x 2 x 10 4 ,在那里 C 细胞浓度, AV是指细胞的数量在4室,然后呢 2稀释系数。样本观测来确定附件的细胞微载体使用倒置显微镜(日本奥林巴斯)20 x放大( 21]。生物反应器滤液滴定在SPF鸡胚通过串行稀释10倍的滤液和接种到所述凸轮里纳尔蒂 等。( 24]和Hitchner [ 1]。滴度获得被表示为50%胚胎感染剂量(宰牲节50每毫升),计算使用的方法,里德和Muench (1938)。

 2.6。rt - pcr的生物反应器vvIBDV传播

滤液的IBDV基因组RNA提取使用试剂盒工具包(试剂盒®LS)为rt - pcr分析推荐的制造商。所有的反应进行设置冰,除非另有说明。RNA被添加9变性 μL的RNA, 1 μL二甲亚砜(DMSO), 1 μL(反向和正向引物,和4 μL DEPC水和混合物在加热块加热5分钟在65°C之前立即放在冰5分钟。反转录在42°C进行了1小时20的总量 μL包含9个 μL变性RNA, 4 μL MgCl25单位lamv 4 μL反应缓冲区,2 μ0.5 L的核苷酸, μL Rnasin。反转录后,停止了反应混合物加热到99°C 1分钟;此后,5 μL (cDNA了PCR反应。这混合物包含1 μL 10毫米的核苷酸,4 μL (MgCl26 μL (PCR缓冲,1 μL(反向和正向引物,5 μL cDNA、31.5 μL的水,和0.5 μL聚合酶。PCR反应中执行thermocycler (SensoQuest、德国)使用以下温度剖面图35周期:1分钟95°C, 52°C 1分钟,72°C 2分钟,最后,最后扩展在72°C 10分钟。PCR产物进行了分析通过使用1%的琼脂糖凝胶产品细胞GT凝胶电泳仪(美国Bio-Rad)。美国一个Kb DNA梯(发酵)被混合5作为标记 μL的梯子,2 μL (6 x凝胶加载染料(R0611 ThermoFisher)。其他井装满5 μL的rt - pcr产品也混合了2 μL装货染料。凝胶电泳是运行在75 V为40分钟。的电泳,凝胶是沾RedSafe核酸染色方案(21141年,基因内区生物技术)30分钟。凝胶放置到紫外线照明器核酸形象化乐队使用凝胶文档系统(美国BioRad)。

 2.7。序列分析

PCR产品排序(一垒有限公司实验室Sdn)和序列的身份被确认使用基本爆炸(基本局部比对搜索工具)搜索项目的国家生物技术信息中心(NCBI) ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。序列编辑多个比对,分析了使用大型版本7.0.4 [ 25, 26与父bgm) - 70和SPF鸡蛋UPM0081传播和UPM190隔离与其他下载参考序列确定的核苷酸和氨基酸序列的变化可能是由于不同的传播系统。

 2.8。间接免疫荧光试验

间接免疫荧光法(IIF)进行了测试演示IBDV的存在抗原感染bgm - 70细胞的细胞质内接种生物反应器和组织培养瓶传播UPM0081 UPM190隔离(如前所述 15]。简单,干净的盖会被放置在6组织培养板,允许在紫外线照射下站在一夜之间。盘子被播种bgm - 70细胞后标准建立协议( 27]。融合后,与prewarmed PBS盘子都洗了两次,个别井接种200 μL的收获生物反应器和组织培养瓶的上层清液UPM0081 UPM190隔离和孵化120分钟吸附在37°C和5%的公司2条件,然后1.8毫升的维护中添加到每个好而未感染控制井满心2毫升的媒介。盘子被37°C和5%孵化有限公司2条件3天。板块与4%多聚甲醛固定30分钟在室温和洗了三次5分钟使用冰冷PBST (PBS含有0.5%渐变20)。之后,板块中孵化PBST Triton x - 100 0.5% (PBS 1 l pH值7.2 + 0.5毫升渐变20)15分钟与PBST permeabilize细胞随后冲洗5分钟的三倍。不具体的绑定使用阻断缓冲区阻塞(PBST 5% BSA)在室温下1小时。板块与PBST冲洗三次5分钟然后40 μL鸡单克隆anti-VP2-IBDV特定主要抗体(美国查尔斯河实验室)在1:200无菌蒸馏水稀释掉了在4°C细胞随后孵化在一个黑暗的调湿室过夜。盘子都洗了三次5分钟PBST和40 μL的多克隆兔anti-chicken-FITC-conjugated二级抗体对鸡IgY-Fc(σ - - - - - -奥尔德里奇、德国)和稀释在1:1000无菌蒸馏水是掉在每个幻灯片包含井和孵化在黑暗中在室温1小时。板块与PBST冲洗5分钟和20的三倍 μL (4′, 6-Diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI)(德国SIGMA-ALDRICH)添加到盘子和孵化10分钟在室温和PBST简要清洗盘子。封面都干,放在一个标签干净玻璃幻灯片使用mountant (DPX)荧光显微镜检查(瑞士徕卡微系统有限公司,Heerbrugg) VP2抗原阳性细胞( 28]。

 3所示。结果 3.1。bgm - 70细胞培养在生物系统Fermetec生物反应器系统

bgm - 70细胞开始将在6小时后微载体播种(ps)(图 1(一)24小时),成为支流ps细胞密度为2.1 X 106细胞/毫升(图 1 (b))。

bgm - 70细胞粘附cytodex微载体1生物反应器。(一)bgm - 70细胞粘附cytodex ps 6小时。(b)融合性的细胞在cytodex 24小时= 100 ps。酒吧 μm。

中东欧适应UPM0081EP8BGMP1通道一旦在bgm - 70细胞和生物反应器的传播也发达CPE 48和72小时之间,表现为细胞微载体的超然。传播IBDV收获在72小时π的效价106.29TCID50/ 1毫升,指定UPM0081EP8BGMP1BP1(图 2(一个))。

从cytodex vvIBDV感染bgm - 70细胞分离。(a)超然bgm - 70细胞微载体与UPM0081EP8BGMP1BP1π72小时。(b)超然bgm - 70细胞微载体与UPM190EP8BGMP1BP1π72小时。(c)超然bgm - 70细胞微载体与UPM0081EP12BGMP15BP1π72小时。(d)超然bgm - 70细胞微载体与UPM190EP12BGMP15BP1π72小时。酒吧= 100 μm。

同样,中东欧改编UPM190EP8BGMP1通道一旦在bgm - 70细胞和传播生物反应器开发CPE在48小时内,以超然的cytodex微载体。在72小时π,病毒效价的收获106.4TCID50/ 1毫升,指定UPM190EP8BGMP1BP1(图 2 (b))。

的支流bgm - 70细胞生长在微载体感染了vvIBDV UPM0081BGMP15与CPE开发72小时π的时候,病毒是收获。CPE的特征是细胞微载体的超然。收获病毒设计UPM0081EP12BGMP15BP1(图 2 (c))和病毒效价是108.23TCID50/ 1毫升。

的支流bgm - 70细胞生长在微载体感染了vvIBDV UPM190BGMP15与CPE开发72小时π的时候,病毒收获和指定为UPM190EP12BGMP15BP1。CPE的特征是细胞微载体的超然。10岁获得的病毒效价8.24TCID50/ 1毫升UPM190EP12BGMP15BP1(图 2 (d))。

 3.2。rt - pcr的生物反应器vvIBDV传播

PCR产品在电泳显示643个基点(图碎片 3)和测序结果分析了使用大型version 7 [ 26)和Bioedit version 7生物信息学软件( 29日如下所示(图 4和 5)。

凝胶电泳的生物反应器通过病毒。rt - pcr产品展示643个基点片段的生物反应器通过vvIBDV UPM0081EP12BGMP15BP1(巷2),UPM0081EP8BGMP1BP1(巷3),UPM190EP12BGMP15BP1(巷4),UMP190EP8BGMP1BP1(巷5),和原始bgm - 70和鸡蛋通道隔离UPM0081BGMP15(巷6),UPM190BGMP15(巷7),UPM0081EP8(巷8),UPM190EP8(巷9),UPM0081EP12(车道10和11),UPM190EP12(车道12和13),积极控制(车道14、15、16),和消极的控制(巷17)。1000个基点DNA梯(通道1和15)(MBI Fermentas,立陶宛)是用于侧面PCR产品。

核苷酸序列的生物反应器相比,传统的瓶,凸轮UPM0081和UPM190传播。核苷酸的生物反应器、bgm - 70和SPF鸡蛋UPM190和UPM0081隔离30参考序列显示原来的父母和生物反应器之间没有核苷酸变化通过隔离。

的氨基酸序列比较生物反应器和bgm - 70 UPM0081和UPM190传播。蛋白质生物反应器、bgm - 70和SPF鸡蛋通过UPM190 UPM0081隔离和30参考序列没有氨基酸变化原来父母的分离和生物反应器之间的通道隔离。

在高变区VP2残从213年到292年,在249年的位置,只有UPM190EP8及其生物反应器通过隔离以及UPM190EP12 E249, UPM190BGMP15,其生物反应器通过隔离和UPM0081 bgm - 70,鸡蛋,和生物反应器通过隔离Q249。同样,UPM190EP8及其生物反应器通过隔离UPM190EP8BGMP1BP1和UPM190EP12 M264兑I264被其他病毒相比。270残留、生物反应器通道和其他病毒E270除了UPM190EP8BGMP1, UPM190EP8, UPM190EP12隔离,A270指示稳定性的这种突变在bgm - 70年无论通过病毒传播的媒介。系统发育分析显示,UPM190EP8父母隔离聚集在一起的生物反应器作为有别于UPM190BGMP15及其后代UPM190EP8BGMP1BP1传播UPM190EP12BGMP15BP1后代,UPM0081EP8及其UPM0081EP8BGMP1BP1 UPM0081BGMP15及其UPM0081BGMP15BP1后代(图 6)。

系统发育分析生物反应器、凸轮改编和传统瓶UPM0081和UPM190传播。生物反应器之间的类群的系统发育关系,bgm - 70,中东欧通道UPM190 UPM0081隔离与参考序列来确定他们的系统发育关系。进化历史与引导使用Neighbor-Joining方法推断(1000复制)。进化距离计算使用泊松校正方法。分析涉及30个氨基酸序列共有80个职位。MEGA7进行了分析。注意,芬欧蓝菌株形成2不同的集群vvIBDV分支内参考序列来显示他们的亲密关系。

 3.3。间接免疫荧光试验

IBDV传播病毒生物反应器中生长良好,由于预期的积极信号的存在视为一个绿色荧光感染细胞的细胞质内,高数量的病毒抗原(图 7)相比,隔离种植在组织培养瓶(图 8)。

间接免疫荧光试验生物反应器UPM0081EP12BGMP15BP1传播和UPM190EP12BGMP15BP1显示高数量的IBDV bgm - 70细胞的细胞质内抗原接种后在72小时。((a) (c)) bgm - 70细胞生物反应器UPM0081EP12BGMP15BP1传播感染和((d) (f)) UPM190EP12BGMP15BP1显示积极的信号对VP2抗原(绿色)当沾FITC-conjugated anti-chicken鸡anti-VP2抗体引起的抗体。((我)(g))未经变质处理的控制。酒吧= 50 μm。

间接免疫荧光试验瓶UPM0081BGMP15传播和UPM190BGMP15显示低数量的IBDV抗原感染bgm - 70细胞的细胞质内接种后72小时。((a) (c)) bgm - 70细胞瓶UPM0081BGMP15传播感染和((d) (f)) UPM190BGMP15显示积极的信号对VP2抗原(绿色)当沾FITC-conjugated anti-chicken鸡anti-VP2抗体引起的抗体。酒吧= 50 μm。

 4所示。讨论

vvIBDV种子生产的主要传统意味着病毒的疫苗生产用中东欧SPF鸡群( 24]。这种方法很麻烦,需要昂贵的大型设施和有限的可伸缩性比动物细胞培养可以在大型生物反应器大规模传播的疫苗生产( 23]。许多连续细胞系进行评估的能力成长在不同的生物反应器平台作为锚固依赖或悬挂文化有不同程度的成功( 8, 23, 30., 31日]。然而,有限的信息增长vvIBDV使用哺乳动物细胞系生物反应器,包括bgm - 70。婴儿grivet猴子70细胞研究和特点对其能力支持许多病毒的隔离和增长包括IBDV [ 14),但到目前为止,没有工作进行评估的能力的细胞系vvIBDV传播在生物反应器系统的支持。

本研究证明了成功的增长在bgm - 70细胞系vvIBDV cytodex 1微载体使用搅拌参数的12转/ 5分钟前24小时后跟14 rpm / 5分钟直到收获文化时期的余生。在37°C, C0 pH值7.2和5%2至关重要的文化条件在这项研究中,细胞开始将最早在6小时ps微载体,成为汇合的在24小时内p细胞密度为2.1×106细胞/毫升。这是密切相似Hundt的报告 等。( 32)获得的细胞密度为1.2×106细胞/毫升在他们的研究中使用附着猫科动物胚胎肺成纤维细胞细胞搅拌釜反应器。bgm的同质增长- 70细胞cytodex表示,目前的研究中使用的培养条件优化细胞使用这种传播系统。这证明了microcarrier-stirred坦克使用生物反应器系统导致了细胞体积增加产量由于其增强的表面体积比( 32]。

获得的病毒产量在72小时π108.5TCID50/毫升和108.7TCID50/毫升UPM0081EP12BGMP15BP1 UPM190EP12BGMP15BP1,分别。相比于烧瓶文化(109.2TCID50/ UPM0081和10毫升9.5TCID50/毫升UPM190隔离),获得的收益在生物反应器低但传染性病毒的大量获得每批2 L生物反应器通过远远大于5毫升获得在一个需要400烧瓶的瓶体积得到相同的2 L。这是与病毒产量每获得1批10 L波生物反应器,估计取代1250滚瓶0.25升容量需要给出同样的体积( 32)或107.7TCID50获得了流感病毒在20小时内π( 33]。这是一种传染性病毒产量和改善biofactory技术。似乎有一个更好的virus-cell生物反应器系统中交互感染的时候,因为搅拌速度的增加是由连续摇摆运动允许更好的病毒吸附到适当的受体成功进入细胞。这类似于周期性的温柔的摇瓶做在一个静态瓶文化在病毒吸附时间的维护媒体( 14]。它已经表明,细胞生存能力和生存能力可能增强的生物反应器系统中由于有效控制的最优培养条件可能会导致增加在感染细胞内的病毒复制阶段 32]。

这项研究的局限是数据详细说明细胞培养代谢乳酸和葡萄糖吸收等,谷氨酰胺,铵,谷氨酸,丙酮酸,和其他抑制代谢物及其积累没有研究;然而,生物反应器系统的传播方式的优势IBDV相比静态瓶文化被高亮显示。这包括低成本(cytodex 1微载体可以多次热压处理过的和重用),缓解的可伸缩性,简单易用,优化培养条件,得到足够的控制和减少微生物污染。因此,这种生物工艺系统被证明是一个有利的候选人所需的可伸缩性病毒疫苗的制造工业应用。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

 确认

作者感谢Arbakariya博士和教授是默罕默德先生黎刹Kapri清真的研究所,其提供的培训为生物反应器在生物反应器操作和实验室工作区设施。本研究赞助下TechnoFund项目(6364002),科学,技术和创新,马来西亚,和HiCoE项目(6369101)、高等教育、马来西亚。

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