JPATH 杂志的病原体 2090 - 3065 2090 - 3057 Hindawi 10.1155 / 2017/7628175 7628175 研究文章 一个实验室评估的两个本地菌株 白僵菌(巴尔斯)。Vuill。对 测定了(壁虱:叶螨科)及其Mycopesticide的潜力 http://orcid.org/0000 - 0002 - 3180 - 0444 Ortucu Serkan 1 Algur 俄梅珥法兰克 2 Vanittanakom Nongnuch 1 分子生物学和遗传学 埃尔祖鲁姆技术大学 埃尔祖鲁姆 土耳其 erzurum.edu.tr 2 生物学系 理学院 阿塔土尔克大学 埃尔祖鲁姆 土耳其 atauni.edu.tr 2017年 8 11 2017年 2017年 05年 08年 2017年 09年 10 2017年 8 11 2017年 2017年 版权©2017 Serkan Ortucu和俄梅珥Faruk Algur。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

这项研究进行了评估高致病性 白僵菌分离中使用生物防除和mycopesticide决定他们的潜力。为此,两个 单独使用隔离,本地隔绝 t .测定了选择。首先,三名进行65度湿度±5%和100% RH。其次,这些菌株选择根据他们的大规模生产的倾向,耐紫外线辐射,产生孢子的能力在不同的温度。最后,确定所选隔离是由使用其rDNA分析。真菌隔离测试都是致病的 t .测定了。菌丝的生长的隔离AT076 20°C和30°C大于隔离AT007被发现。这是观察到隔离AT076孢子产量为1.61×107孢子发芽/盘30°C和44.33%紫外线辐射后15分钟。孢子的数量每5毫米的磁盘区域隔离AT076和AT007被发现是1.2×106和1.0×106。这些结果表明,隔离AT076 UV-tolerant和本身的毒性更强更高的倾向比孤立AT007反对大规模生产 t .测定了。作为本研究的结果,隔离AT076可用于生物防除mycopesticide。

 凯末尔Universitesi 软面包卷:2009/96 1。介绍

t .测定了通常是一个农业地区害虫,也经济损失( 1]。化学杀虫剂中使用的控制 t .测定了已报告( 2, 3];然而,这些应用程序并不是首选,因为对环境的负面影响。昆虫病原真菌可以被视为一个重要的替代的管理各种节肢动物物种和他们对环境可以说是最好的 4]。的使用 白僵菌种虫害已经越来越倾向于控制螨( 5- - - - - - 7]。 单独使用(巴尔斯)。Vuill。是一个著名的mycopesticide和被认为是一个有前途的昆虫病原真菌( 8]。 白僵菌属表现的情感对成员的鞘翅目昆虫订单,鳞翅目、膜翅目昆虫( 9, 10]。此外,该研究揭示了 单独使用成为一个优秀的壁虱病原体,特别是两元蜘蛛螨, t .测定了科赫( 10- - - - - - 12]。成功的商业mycopesticides包括昆虫病原真菌在环境中与传统杀虫剂相比是有限的,因为他们是敏感的紫外线辐射( 13, 14]。紫外线辐射引起的分生孢子失活预计将减少mycopesticides[的效率 15]。然而,这些真菌在环境的永久的增加可能通过选择隔离,具有耐紫外线的 16]。Mycopesticides倾向于大规模生产是限制他们的商业用途的一个因素 17]。在这种情况下,配方包含所选mycopesticides隔离可能是重要的发展,可能有一个商业优势相比其他[ 18]。此外,选择生物控制隔离可能有潜力用于不同的生物技术的应用程序( 19]。

的第一步选择候选人的生物控制剂实验室评估的有效性。最致命的隔离病虫害隔绝相同或相关的物种( 20.]。在目前的研究中,我们选择了两个地方 单独使用隔离来自 t .测定了和评估他们的致病性潜力 t .测定了。此外,菌丝的生长和孢子形成的隔离在不同温度下,对紫外线辐射宽容,大规模生产的趋势比较,以选择最合适的隔离mycopesticide。

 2。材料和方法 2.1。生物材料

的股票文化 t .测定了饲养在豆植物25±1°C和60±5%相对湿度(RH) 12: 12 h (L: D)光周期。个人,分离获得固定年龄叶系统准备的史和冯 5]。然后,螨卵被允许成长和发展为15天。AT007和AT076隔离 单独使用被用于这项研究。这些隔离以前隔绝 t .测定了( 21, 22)的存储和维护偏琼脂培养基含有Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)在4°C。

 2.2。分生孢子悬浮液和生存能力

分离培养在SDA含有2%酵母提取物,保持两周为分生孢子的生产在25°C。分生孢子悬浮在无菌蒸馏水,一个表面活性剂(0.2毫升/ l渐变80)被添加到减少分生孢子的聚集,最后,悬浮体涡同质的状态( 23]。准备的悬浮液通过三层薄纱被过滤消除菌丝和unsuspended分生孢子。孢子浓度测定用血球计和悬浮液准备在1×10的对数级数61×108( 24]。

分生孢子的生存能力测试在SDA盘子。0.1毫升来自悬浮液在无菌条件下,分布在SDA媒介。24小时后,萌发率确定从100年孢子计数每个板上( 25]。只有分生孢子萌发管只要分生孢子的宽度被认为是发芽。孢子悬浮液用封口膜密封保存在4°C在冰箱里,直到使用[ 26]。

 2.3。分生孢子的浓度和RH的效果

一个dose-mortality生物测定的 单独使用AT007和AT076隔离进行了选择最致命的隔离( 27]。对于每个隔离,1毫升的三种不同的水悬浮液(1×1061×107和1×10880年)提供0.02%补间下行喷bean叶光盘(30毫米直径)通过使用手动喷雾器。叶圆盘干燥的空气中,放置在培养皿中。蒸馏水包含0.02%渐变80作为控制。25固定年龄螨任意从股票文化转移到每个盘的软笔刷。曝光后,所有培养皿用封口膜密封和6毫米直径的孔被打开的盖子适当的通风。培养皿都孵化 25 ± 1 °C, 65%和100% RH。死亡率记录每天的7天。死螨surface-sterilized在70%的乙醇,干,转移到培养皿内衬湿润滤纸10天观察霉菌病。由真菌引起的死亡率是显微镜检查确认( 28, 29日]。

 2.4。测定菌丝体的生长和孢子形成在不同的温度

撕开文化SDA媒体被用于准备菌丝体的光盘。5毫米琼脂盘与菌丝检索的帮助下软木钻孔机,然后放置在中间的新鲜SDA盘子最后孵化20°C, 25°C, 30°C。径向测量每天增长一段8天( 7]被Cagan计算描述和Svercel [ 30.]。确定孢子形成,5毫米琼脂光盘被随机的帮助下一个软木钻孔机。这些光盘放置在10毫升的0.02%补间80解决方案和涡暂停孢子。孢子浓度测定用纽鲍尔血球计( 31日]。

 2.5。决心的大规模生产的趋势

200克大米在600毫升蒸馏水煮45分钟,过滤,以及由此产生的粥被混合均质。然后,米粥传播在玻璃培养皿(12厘米直径)和热压处理过的。5毫升悬架(1×106分生孢子/毫升)是一剂喷撒在米饭媒体使用手动喷雾器和接种板块在孵化25°C 14天。年底这段时间,5毫米琼脂光盘被随机的帮助下一个软木钻孔机。硬盘被放置在10毫升的0.02%补间80解决方案和涡暂停孢子。孢子浓度决心如前所述。

 2.6。确定自然宽容的<斜体>单独使用< /斜体>隔离紫外线辐射

紫外线比较宽容,1毫升的分生孢子悬浮液在SDA介质表面传播,所有板块都暴露于紫外线辐照度提供的荧光灯(飞利浦35 W)为0,15日,30和60分钟30厘米的距离。控制盘满是铝箔。辐照后,盘子被孵化 25 ± 1 °C下24小时的黑暗。然后,一滴乳酚蓝和盖玻片放置在盘子和分生孢子的萌发是计算被李et al。 13]。

 2.7。识别候选隔离

的识别 单独使用隔离AT076是由基因组测序的一个片段。的ITS1和ITS4用于引物聚合酶链反应(PCR) ( 32]。PCR产品水平在1%琼脂糖凝胶凝胶电泳分析。产品被净化后商业PCR净化设备的协议。净化后,其rDNA基因测序在两个方向RefGen有限公司,有限公司,土耳其。色谱是装配序列和序列与所有已知序列的基因银行利用BLASTN 2.2.26 +项目( 33)和沉积与基因库数据库加入下号码 MF593119。

 2.8。数据分析

实验设计是随机完成块三个复制,并且每个复制由25螨虫。方差分析是使用单向方差分析测试使用SPSS 15.0进行。LT50和肝移植90年测定值与EPA Probit分析程序(版本1.5)。

 3所示。结果与讨论

选择隔离mycopesticides商业化之前是第一步。为此,候选生物防治剂的有效性在实验室评估。 单独使用隔离用于这项研究以前从埃尔祖鲁姆获得、东安纳托利亚。这个地区,因为它是一个明显相对高海拔寒冷地区,是土耳其最重要的领域之一。因此,本研究以确定这些地方进行隔离mycopesticide生物防治的潜力。

3.1。分生孢子的浓度和RH的效果

单独使用表明致病性与很多害虫,是商用mycoinsectiside [ 4]。评估新的候选人隔离,最优条件,如分生孢子的浓度和RH需要确定( 34]。在生存能力的测试中,95 - 100%的孢子发芽,发现真菌隔离测试都是致病的 t .测定了之间的死亡率 90.7 ± 5.6 %和100%,7天从应用程序。微观调查确认所有螨死于霉菌病,和 单独使用被分离从所有死螨。死亡率的结果 单独使用隔离与 t .测定了与LT50和肝移植90年值表中描述 1。

死亡率 单独使用隔离与 t .测定了与LT50和肝移植90年值 ∗ 。

剂量 第三天 第五天 7天 LT50 置信区间95年(%) LT90年 置信区间95年(%)
65±5% RH AT007 1×106 24±2.3 b 62.7±6.4 b 90.7±5.6 一个 4.80 一个 3.62 - -4.57 7.71 一个 6.53 - -10.14
1×107 30.7±4.3 一个 b 68±4.0 一个 b 92±6.3 一个 3.73 b 3.25 - -4.24 7.82 一个 6.49 - -10.61
1×108 37.3±5.3 一个 76±8.2 一个 96±0.0 一个 3.34 c 2.90 - -3.77 6.58 b 5.61 - -8.42
AT076 1×106 49.3±4.3 b 76±6.4 b 100±0.0 一个 2.86 一个 2.42 - -3.29 6.36 一个 5.32 - -8.36
1×107 53.3±4.7 b 85.3±5.0 一个 100±0.0 一个 2.71 一个 2.30 - -3.11 5.75 b 4.88 - -7.34
1×108 60±7.3 一个 88±8.2 一个 100±0.0 一个 2.50 b 2.11 - -2.87 5.20 b 4.44 - -6.54
控制 1.33±1.3 c 1.33±1.3 c 4±2.3 b
100% RH AT007 1×106 34.7±3.3 b 73.3±7.4 b 100±0.0 一个 3.33 一个 2.90 - -3.74 6.45 一个 5.53 - -8.17
1×107 36±5.3 一个 b 78.7±6.0 一个 b 100±0.0 一个 3.16 一个 b 2.24 - -4.00 6.08 b 4.68 - -7.61
1×108 44±4.3 一个 89.3±7.2 一个 100±0.0 一个 2.89 b 2.50 - -3.24 5.19 c 4.54 - -6.30
AT076 1×106 48±5.3 b 89.3±8.4 c 100±0.0 一个 2.77 一个 2.37 - -3.16 5.61 一个 4.80 - -7.05
1×107 65.3±5.7 一个 93.3±6.0 b 100±0.0 一个 2.26 b 1.90 - -2.60 4.53 b 3.89 - -5.61
1×108 68±6.3 一个 100±0.0 一个 100±0.0 一个 2.17 b 1.83 - -2.47 4.04 c 3.50 - -4.93
控制 1.33±1.3 c 2.67±1.3 d 5±2.3 b

∗ 所有的值代表平均值±标准误差三个决定( n = 3 )。相同的字母字母相同的列不明显不同 p < 0.05 。

在65% RH生物,死亡率三分生孢子的浓度之间的差异被发现是重要的( p < 0.05 除了7天。增加死亡率随时间被发现和孢子浓度。LT的50和肝移植90年值两个隔离不同-7.82 2.50 -4.80天,5.20天,分别。另一方面,致病性的百分比 t .测定了在生物100% RH是其中最高的。死亡率造成的孤立AT076被发现明显不同( p < 0.05 第五天)。隔离,最低分生孢子的浓度至少给控制( 89.3 ± 8.4 螨虫的%)。死亡率被发现 93年 ± 6 %的中间浓度和最佳的死亡率均获得100%(1×10分生孢子的浓度最高8分生孢子/毫升)。第七天,这毒性孤立隔离显示相似AT007 ( p < 0.05 分生孢子的准备)。隔离AT076导致最短的LT50值为2.17天。这个值是显著( p < 0.05 )短于LT之一50与AT007获得的值。因此, 单独使用隔离AT076一直比AT007反对更致命 t .测定了。同样,先前的研究表明 单独使用是致病的反对 t .测定了中,但死亡率的水平是不同的隔离( 35, 36]。 单独使用隔离AT076被发现高致病性 t .测定了即使是在暴露于低RH无性孢子的浓度较低。众所周知,低浓度使最成本有效的方法用于生物防治( 37]。真菌要求很高的湿度孢子生殖和发芽。因此,低湿度导致显著减少昆虫病原真菌的传染性 4]。在我们的研究中,死亡率低湿度条件下普遍下降。增加35%的湿度水平8 - 12%增加死亡率造成的孤立AT076第3和第5天,分别。同样,先前的研究表明,一个衰减引起的湿度水平下降的死亡率在实验中不同级别( 34, 38]。例如,Albayrak Iskender et al。 37)报道,35%的湿度水平下降导致的死亡率降低50.9% Pristiphora abietina幼虫。

 3.2。测定菌丝体的生长和孢子形成在不同的温度

都隔离了菌丝体的生长在所有的测试温度和最高的菌丝体生长的隔离了25°C。在这个温度,隔离显示类似的菌丝体的生长( p < 0.05 )和菌丝体生长在高或低的温度降低。同样,在一项由Nussenbaum et al。 39),结果表明,菌丝体生长 单独使用和 绿僵菌属anisopliae减少与温度的变化。此外,另一项研究表明,菌丝体生长 白僵菌隔离与降低温度的增加( 40]。

隔离了孢子生产所有的测试温度和产量随温度增加。最高的孢子生产隔离AT007注册25°C和30°C;然而,对于孤立AT076,孢子产量最高的被发现只在30°C。在温度30°C,隔离显示类似孢子产量( p < 0.05 ),但隔离对温度的反应是重要的在较低的温度( p < 0.05 )。这几乎是符合Uzma和Gurvinder [ 31日]。

 3.3。决心的大规模生产的趋势

米饭是最好的衬底的大规模生产 单独使用分生孢子,因此广泛应用于工业生产的固体基质( 41]。因此, 单独使用隔离测试最大的孢子在水稻生产。在两个隔离,更多的分生孢子(1.2×106孢子/ 5毫米琼脂盘)被孤立ATA076获得。

 3.4。确定自然宽容的<斜体>单独使用< /斜体>隔离紫外线辐射

天然紫外线隔离和宽容是高度变量 单独使用AT007更敏感的紫外线辐射曝光时间。从表可以看到 2、隔离AT076暴露于紫外线辐射15分钟显示,44.33%发芽和隔离AT007显示,16.58%发芽后24小时。然而,控制分生孢子100%发芽后24 h。分生孢子的可行性两个隔离的减少和增加曝光时间。同样,研究表明 单独使用有不同公差对紫外线和他们的反应是影响曝光时间( 16, 42]。

菌丝的生长和孢子形成的隔离在不同温度下,对紫外线辐射宽容,大规模生产的倾向 ∗ ∗ 。

隔离 菌丝体生长(毫米) 孢子产量(×107) 紫外线耐受(%)可行性 大规模生产(×106)
20°C 25°C 30°C 20°C 25°C 30°C 控制 15分钟。 30分钟。 60分钟。
AT007 1.81 b B 2.87 一个 一个 1.49 c B 1.20 b 一个 1.50 一个 一个 1.52 一个 一个 One hundred. 一个 一个 16.58 b B 3.33 c B 2.16 c B 1。0 b
AT076 2.35 c 一个 2.87 一个 一个 2.61 b 一个 1.03 c B 1.32 b B 1.61 一个 一个 One hundred. 一个 一个 44.33 b 一个 13.4 c 一个 12.0 c 一个 1。2 一个

∗ ∗ 所有的值代表平均值±标准误差三个决定( n = 3 )。不同的同一行中的小写字母和大写字母在同一列显示显著差异( p < 0.05 )。

 4所示。结论

使用mycopesticides作为害虫综合治理的一部分(IPM)策略可以减少依赖化学防治。在目前的研究中,我们选择了两个地方 单独使用隔离和评估他们的致病性潜力 测定了。本研究的结论, 单独使用隔离AT076一直比AT007反对更致命 t .测定了。此外,这种隔离发现更UV-tolerant,有更高的大规模生产的趋势。目前的结果表明,隔离AT076具有良好的潜力mycopesticide IPM中的程序。

 信息披露

本文是一个博士论文的一部分Serkan Ortucu。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作是支持的阿塔土尔克大学研究基金会(BAP: 2009/96)。

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