JPATH 杂志的病原体 2090 - 3065 2090 - 3057 Hindawi出版公司 627036年 10.1155 / 2012/627036 627036年 研究文章 新一代芯片同时探测和识别 鼠疫杆菌和 炭疽杆菌在食品 枸杞子 Noriko 1 麦克米伦 特雷弗 2 Amoako 金斯利Kwaku 1 黄 Hin-Chung 1 加拿大食品检验署 国家动物疾病中心 莱斯布里奇实验室 邮政信箱640 莱斯布里奇 AB 加拿大 T1J 3 z4 gc.ca 2 生物科学学院 D872大学大厅 4401年大学开 莱斯布里奇大学 莱斯布里奇 AB 加拿大 T1K 3 m4 uleth.ca 2012年 18 10 2012年 2012年 23 06 2012年 02 08年 2012年 05年 08年 2012年 2012年 版权©2012顶。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

使用微阵列的多个分析系统生成增加兴趣和提供了一个强有力的分析工具,同时检测病原体的一个实验。广泛的应用这一技术已被报道。低密度寡核苷酸微阵列基因序列的生成 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌用于制作微阵列芯片。新一代芯片组成的2240点4象限的能力剥离/ rehybridization,被指定为“Y-PESTIS / B-ANTHRACIS 4 x2k数组。“特异性的芯片测试使用一组细菌的DNA可能存在于食物。总之,37独特 鼠疫耶尔森氏菌属特殊技能和83 炭疽杆菌特殊探头被确定。微阵列分析杰出 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌从其他细菌物种测试和正确地确定了 鼠疫耶尔森氏菌属特殊技能寡核苷酸探针使用DNA提取实验接种牛奶样品。使用全基因组扩增方法,检测能够检测低至1 ng基因组DNA样本。结果表明,寡核苷酸微阵列可以专门检测和识别 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌,可能是一个潜在的有用的诊断工具在食品检测和确认生物生物恐怖主义事件。

 1。介绍

微阵列技术有很大潜力用于诊断和DNA微数组技术已经得到广泛的重视,由于能够同时分析大量的核酸序列的目标和检测多个基因目标或来自多个病原体的基因组在一个幻灯片( 1]。技术方面发挥了越来越重要的作用在基因组学和生成的兴趣在过去十年增加。

DNA微阵列由几个寡核苷酸探针固定在一个坚实的玻璃的支持,和使用的技术有很大潜力的歧视密切相关的菌株采用寡核苷酸具体为每个目标生物。因此,设计一套合适的探针微阵列的发展是关键,因为所有的探针在芯片应该是非常具体的目标基因。探测器应该能够有效地绑定到目标序列允许检测低丰度的目标在复杂混合物与高灵敏度( 2]。DNA微阵列的使用已被证明是有效的高通量检测在临床病原微生物,环境,食物,和水样本( 3- - - - - - 8]。然而,申请biothreat制剂的检测食品中没有记录。食物被认为是脆弱的恐怖主义袭击的目标,和事件相关的故意污染的食物利用传统食源性病原体等 沙门氏菌( 9)使食源性生物恐怖主义有关 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌一种可能性。食源性防范涉及生物恐怖主义反应 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌需要处理任何涉及食品供应的潜在威胁。发展的一种特异的方法同时检测biothreat代理从食物是至关重要的。

在这项研究中,我们描述一个方法涉及使用新一代的微阵列允许同时探测和识别 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌从食物。我们设计和测试探针基于毒性基因的两个biothreat代理和证明这种微阵列方法有可能被用于特定的检测 炭疽杆菌和 鼠疫耶尔森氏菌属在食源性应用程序。

 2。材料和方法 2.1。微阵列探针设计和芯片制造

全基因组序列 炭疽杆菌艾姆斯( 10), 鼠疫耶尔森氏菌属CO92 [ 11选择从基因库35-mer探针和定制设计的用于制造低密度定义数组。毒力质粒产生的寡核苷酸探针,和一个4 x2k芯片阵列(2000 +斑点)四个相同的数组,指定为“Y-PESTIS / B-ANTHRACIS 4 x2k数组,”是专门设计的(CustomArray Inc .)美国、前CombiMatrix)。在533年和1707年,调查是生成的 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌,分别。用这4 x2k芯片设计,八个相同的实验可以在单个芯片上运行。直接电化学合成的寡核苷酸探针在芯片和不需要需要订单分开再悬浮和发现使用一个机器人。上面描述的特性是缺乏老微阵列芯片的设计,使这新一代微阵列。新一代芯片的另一个独特的特性是,它可以被剥夺和重用的三倍。每个CustomArray 4 x2k微阵列可以存储在阴凉干燥的地方长达4个月。

 2.2。菌株和DNA提取

的 炭疽杆菌菌株用于本研究提供的请伊丽莎白Golsteyn托马斯博士(加拿大食品检验署)和道格·巴德先生(国防研究开发加拿大)。使用的所有其他菌株的来源提供了以前文献[ 12),表中列出 1。细菌生长在胰蛋白酶的大豆琼脂(Becton, Dickinson和公司、美国)补充5%的羊血,和单一的殖民地随后被转移到大豆胰蛋白酶的汤在一夜之间37°C。基因组DNA提取如前所述[ 12]。

菌株用于这项研究。

物种 应变 讲话
食源性病原体混合
变形杆菌属寻常的 写明ATCC 8427
肺炎克雷伯菌 写明ATCC 13883
痢疾 写明ATCC 11835
大肠杆菌O157H7 EDL933
Mannheimia haemolytica Z13
创伤弧菌 Z86
枸橼酸杆菌属braakii 写明ATCC 12012
鼠伤寒沙门氏菌 71 - 471
气单胞菌属hydrophila Z22
铜绿假单胞菌 写明ATCC 27853
单核细胞增多性李斯特氏菌 写明ATCC 15313
酿脓链球菌 写明ATCC 19615
粪肠球菌 写明ATCC 29212
微球菌lysodeikticus Z9
金黄色葡萄球菌 Z13
空肠弯曲杆菌 写明ATCC 11168
鼠疫种虫害混合
鼠疫的伪 写明ATCC 29833
鼠疫的伪 图尔库
鼠疫enterocolitica 写明ATCC 23715
鼠疫kristensenii 写明ATCC 33638
鼠疫frederiksenii 写明ATCC 33641
鼠疫的媒介物 写明ATCC 29909
芽孢杆菌种虫害混合
蜡样芽胞杆菌 写明ATCC 14579
枯草芽孢杆菌 NWBL 0060
苏云金杆菌 写明ATCC 10792
芽孢杆菌coagulans 写明ATCC 7050
鼠疫杆菌菌株
鼠疫杆菌 页1967 野生型隔离
鼠疫杆菌 195 / P 野生型隔离
鼠疫杆菌 6/69H + 野生型隔离
鼠疫杆菌 M23 野生型隔离
鼠疫杆菌 横滨 野生型隔离
鼠疫杆菌 CO92 NCBI基因组Ref Seq: NC_003143.1 ( 11]
炭疽杆菌菌株
炭疽杆菌 埃姆斯 NCBI基因组Ref Seq: NC_003997.3 ( 10]
炭疽杆菌 英航44 隔离从麋鹿,NWT加拿大在1993年8月
炭疽杆菌 英航56 在1996年8月从牛隔离,在加拿大
炭疽杆菌 英航79 孤立的熊,NWT加拿大在2000年7月
炭疽杆菌 英航127 从山羊的隔离,公元前2001年12月加拿大
炭疽杆菌 英航131 隔离从土壤、加拿大、日期N / A
炭疽杆菌 英航252 在2006年7月从牛隔离,SK加拿大
炭疽杆菌 英航59 孤立的野牛,MB加拿大在1998年7月 - - - - - -
炭疽杆菌 英航158 写明ATCC 4229托克斯 - - - - - -(pXO1)
炭疽杆菌 Sterne NCBI基因组Ref Seq: NC_005945.1(pXO2)

2.3。DNA扩增和标签

基因组DNA是放大使用REPLI-g迷你包(试剂盒GmBH是一家现代化、希尔登,德国)(图 1),并提供一致的放大DNA杂交结果(数据未显示)。标签,2 μ克放大DNA消化了 RsaI(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA) 37°C的4个小时,随后贴上Alexa萤石555和/或647荧光染料使用BioPrime +全息阵列基因标签工具包(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)后,制造商的指示。浓度和DNA标记效率决定使用NanoDrop nd - 1000荧光计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。标记的DNA是储存在−20°C琥珀微型离心机管,除非立即用于杂交。基因组DNA的特异性研究 鼠疫耶尔森氏菌属CO92或野生型 炭疽杆菌隔离数字179是混合细菌的基因组dna提取的小组中列出的表 1在不同的比率(1:1、1:3,1:9日和1:19重量)。DNA扩增和标签都是如上所述。

1%的琼脂糖凝胶含有 炭疽杆菌DNA之前和之后使用REPLI-g基因组DNA扩增装备和放大 RsaI消化。车道1和6日:1 kb分子量标记,巷2:第三后分子量标记(23130、9416、6557、4361、2322、2027和546个基点),雷恩3:5 μ20 ng / L μl 炭疽杆菌英航179基因组DNA,雷恩4:5 μREPLI-g放大DNA (355 ng / L μL)和巷5: RsaI消化的DNA。

 2.4。DNA杂交芯片和芯片剥离

标记基因组DNA的杂交CustomArray 4 x2k幻灯片格式执行根据制造商的协议(CustomArray Inc .十分佤邦,美国)。每个微阵列组成的4相同的数组部门单独装载不同的DNA样本。通过使用两种荧光染料,同时在一个芯片上八个样本测试。简单地说,30 μL杂交的解决方案包含100 ng两fluorochrom-labeled (Alexa萤石555或647)DNA用移液器吸取到的四个室和铝箔胶带覆盖,避免光。覆盖幻灯片孵化在潮湿的杂交烤肉店烤箱(UVP LLC,旱地、钙、美国)16小时50°C和温和的旋转。所有标记的DNA样本中杂化与Alexa萤石555或者647重复,确保结果的一致性。

杂交和成像后,微阵列被淹没在0.5 M氢氧化钠在室温下15分钟,剥夺了使用CombiMatrix CustomArray剥离工具包(CustomArray Inc .)。剥夺了幻灯片rehybridization之前进行扫描,以确保没有更多的信号并存储在包含PBS的滑座在4°C。Rehybridization单个幻灯片是最多重复两次。

 2.5。微阵列数据分析

杂化微阵列使用轴突4000 b微阵列成像扫描仪(轴突仪器、分子器件、LLC桑尼维尔,美国)。每个样本都是在重复做杂交,扫描是一式三份完成的。使用GenePix Pro的TIFF图像分析软件5.0版本(轴突工具),并进一步分析的数据中提取各点的总强度。所有数据被转移到Microsoft Excel为集群和TreeView分析(美国斯坦福大学,CA),然后热地图生成后软件的指令( 13]。

 2.6。应用微阵列的食品样品的分析

调查食源性的微阵列的使用应用程序, 鼠疫杆菌应变Pp1967一夜之间被培养在TSB 28°C,和大约106CFU / mL被接种到25毫升的1%脱脂奶从当地的杂货店购买。225毫升容量的缓冲蛋白胨水是补充道,和牛奶样本早出晚归2分钟使用三角胸衣(西沃德有限公司,西萨塞克斯郡,英国)。样本能整除的为10毫升卷15毫升的猎鹰管,煮10分钟杀死细胞,离心。颗粒收集和DNA提取使用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒GmBH,德国)。提取的DNA标记、放大、消化和杂化芯片如上所述。

 3所示。结果 3.1。鼠疫杆菌的基因组DNA杂交<斜体> < /斜体>和<斜体>炭疽杆菌< /斜体>菌株

六个 鼠疫耶尔森氏菌属菌株和两个 y伪菌株进行评估的积极点。所有DNA样本进行重复测试,和总荧光强度(TFI)数据对所有2240个探针组装后的平均强度减去10 -点。由于杂交斑点微阵列幻灯片上显示异常故障被过滤掉。TFI值高于20000年被选为积极的信号。这个数字是确定基于归一化的结果数据 鼠疫耶尔森氏菌属CO92或 炭疽杆菌艾姆斯,显示0(中位数)的对数转换(日志2)的值。为 炭疽杆菌,艾姆斯菌株和7野生型隔离从动物从1996年到2006年在加拿大和4 芽孢杆菌物种( 仙人掌,B基因B。coagulans ,和 枯草芽孢杆菌(表)也被检查 1)。获得的数据从基因组DNA的鸡尾酒 鼠疫种虫害或 芽孢杆菌种虫害和食源性病原体对积极调查分析的两个细菌代理。大约300调查被认为是积极的 鼠疫耶尔森氏菌属应变的,其中72给了积极的价值观三个或更多压力。随后,积极探讨 y伪写明ATCC 29833和土压力,基因组DNA的鸡尾酒 鼠疫的。或食源性病原体与72年的调查相比,最后被选为37 鼠疫耶尔森氏菌属您调查。为 炭疽杆菌,约800目标进行了分析,在分析的积极从DNA探针鸡尾酒4 芽孢杆菌物种和食源性病原体,83年被选为 B。 炭疽特殊技能。

37的序列 鼠疫耶尔森氏菌属特殊技能调查如表2所示,83探针序列 炭疽杆菌表2 b中(见补充材料网上doi: 10.1155 / 2012/627036)。

 3.2。特异性和敏感性的具体探讨<斜体> Y。耶< /斜体>和<斜体> B。杆菌< /斜体>

检查37具体探针的特异性 鼠疫耶尔森氏菌属和83年 炭疽杆菌,两种生物基因组DNA的混合与一个小组的食源性致病菌,随后在装货前与REPLI-g放大到微阵列幻灯片。这是模仿的检测 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌从食物样本,如果与其他病原体的污染。结果表明,所有的探针有很强的积极信号(数据没有显示)。

数据 2(一个)和 2 (b)显示热图和聚类结果 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌。热量地图显示每个细菌物种和独特的模式很容易区别生物密切相关。此外,为 鼠疫耶尔森氏菌属35岁,另一个调查显示地图上的热量与积极的强度水平 y伪可能会认为是 鼠疫耶尔森氏菌属,具体调查以来明显高于的信号 y伪。

独特模式的热图和聚类图像数据的生成 鼠疫耶尔森氏菌属(一)和 炭疽杆菌(b)具体调查。的总强度的积极点 鼠疫耶尔森氏菌属或 炭疽杆菌使用微阵列数据分析软件(集群和规范化Treeview [ 5)后转换成日志2规模。探针强度显著粉红色所示。的37个探测器 鼠疫耶尔森氏菌属和83年 炭疽杆菌有调查ID数字下面热地图。

 3.3。牛奶中掺入<斜体> Y。< /斜体> <大胆> <斜体> < /斜体> < /大胆> <斜体>耶< /斜体>

证明的直接应用CustomArray DNA杂交技术检测食品中,我们从牛奶中提取DNA样本飙升106CFU /毫升 鼠疫耶尔森氏菌属Pp1967。强烈的信号强度是37个探测点(图所示 3)。这些景点没有任何信号强度负控制牛奶样品表明特定的探测 鼠疫耶尔森氏菌属。

总荧光强度(TFI) 37 鼠疫耶尔森氏菌属特殊探针为放大从牛奶中提取的基因组DNA样本。的 X 设在数字代表 鼠疫耶尔森氏菌属调查ID号。的 Y 设在显示平均为每个探针TFI。

 4所示。讨论

检测和确认biothreat代理等 鼠疫杆菌和 炭疽杆菌食物是非常重要的有效保护公众免受任何潜在的食源性生物恐怖主义的威胁。迄今为止,同时检测这两个biothreat代理等食品中使用微阵列中描述这项研究尚未报道。传统方法用于确认病原体如富集培养、显微镜、血清学和生化分析有一些局限性,在它们费力而耗时,因此效率在处理潜在的食源性生物恐怖主义的担忧。

食源性病原体的快速和特定的识别和biothreat代理是早期发现和快速反应的关键事件的食源性疾病暴发。实时PCR最近作为一种快速开发和具体方法检测biothreat代理食品( 12, 14, 15]。即使多路实时PCR试验可以放大不同目标区域的基因组DNA在一个单一的反应,有有限的信息可以从这种技术;因此,结合不同的方法应该被视为一种选择。

DNA微阵列技术已应用于食源性病原体检测( 16, 17]。这种方法不仅有很强的潜在识别多个病原体特异性非常高在一个实验中,也能够证明菌株间遗传差异与相似( 18, 19对细菌的分离),提供进一步的表征。排除使用PCR需要特定的引物的设计和优化的反应条件,我们放大基因组DNA使用试剂盒REPLI-g全基因组扩增体系。REPLI-g技术已经成功用于扩增基因组DNA ( 20.),根据该报告,REPLI-g放大DNA的强度值可以提供相关信息复制数字放大的基因组中基因的目标是统一的。该报告显示,强度值越高,越高的基因拷贝数的目标。观察到的高强度与目标质粒pPCP1在目前工作确认这个质粒拷贝数高。DNA微阵列的灵敏度通常是贫穷当总基因组DNA用于杂交( 21];然而,这可以增强允许低水平的浓度检测病原体放大产品的使用标签和杂交( 2, 5, 22, 23]。随机的应用全基因组扩增步骤之前启用标签在当前的研究中使用低至1 ng的DNA微阵列分析材料。这导致了成功的同时探测和识别 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌在一个试验。这个不需要PCR引物的设计生成材料标签和杂交。此外,剥离和重用的微阵列芯片的高通量功能包括在单个芯片上同时运行4个独立的实验提供了一个独特的新一代微阵列和允许复制实验在相同条件下,从而确保高重现性的结果。情况不是这样使用传统的微阵列芯片在哪里使用一次,使用不同的芯片和复制的实验完成。

一些报告展示了使用DNA微阵列检测食品中病原体( 24- - - - - - 27]。这项技术还被应用于涉及biodefence应用程序 炭疽杆菌和 鼠疫耶尔森氏菌属( 28- - - - - - 30.]。然而,据我们所知,使用同步探测和识别的技术biothreat代理食品没有被记录。这里,我们展示了第一个成功应用在食品biodefence涉及的检测 鼠疫耶尔森氏菌属牛奶样品。

特有的高特异性探针都缺乏大的面板和远亲压力密切相关,可能存在于食物。37、83种特异的探针生成的 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌分别应该支持使用微阵列的直接探测和识别受污染的食物而不需要隔离biothreat代理。然而,这个数字可以扩展到300年和800年的调查 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌分别用于细菌的确认,如果孤立在纯文化从受污染的食物。基因序列信息的仔细分析和选择的调查导致了这个问题。特别是,毒性基因的目标从独特的毒力质粒两种生物导致观察到的高特异性。先前的研究,涉及使用毒性基因微阵列设计中致病菌的检测报告( 31日- - - - - - 33]。使用几种毒性基因检测标记提供了菌株的毒力潜力牵连的更多信息并添加更多的价值使用微阵列作为一个平台的检测和确认biothreat代理。

总之,新一代芯片开发的这项研究是小说的同时探测和识别 鼠疫耶尔森氏菌属和 炭疽杆菌食品中,展示了微阵列的有效性biodefence应用程序作为一个潜在的诊断工具。

 确认

作者感谢伊丽莎白Golsteyn托马斯博士,世界动物卫生组织参考实验室对炭疽,加拿大食品检验机构和道格•巴德先生提供加拿大国防研究发展 炭疽杆菌菌株用于这项研究。作者感谢Drs。Soren Alexandersen和阿鲁娜Ambagala和马修·托马斯先生审核。这项工作是由公安和反恐国防部(PSAT)项目,加拿大政府。

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