JPATH 杂志的病原体 2090 - 3065 2090 - 3057 Hindawi出版公司 424808年 10.1155 / 2012/424808 424808年 研究文章 单筒的设计和施工,LATE-PCR多元端点检测灯/关灯探测器检测的病原体与脓毒症有关 Carver-Brown 雷切尔·K。 1 里斯 阿瑟·H。 Jr。 1 大米 丽莎·M。 1 Czajka 约翰W。 2 Wangh Lawrence J。 1 Gahan 科马克•g . M。 1 生物学系 布兰代斯大学 沃尔瑟姆,02453 - 2728 美国 brandeis.edu 2 史密斯探测诊断 埃奇伍德博士21040 美国 2012年 26 12 2012年 2012年 26 07年 2012年 02 10 2012年 12 10 2012年 2012年 版权©2012雷切尔·k·Carver-Brown et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

的目标是。本研究的目的是构建一个管分子诊断多路检测微生物病原体的检测通常与败血症,有关使用LATE-PCR和灯/关灯探针技术。 方法和结果。这里描述的分析识别病原体与脓毒症相关的扩增和分析16 s核糖体DNA基因序列的细菌和真菌的基因序列。从一个身份不明的基因序列 Lactococcus lactis无性系种群。 cremoris作为一个积极的控制分析功能。LATE-PCR被用于生成单链扩增子,然后分析了在特定的端点在宽温度范围内荧光颜色。每个细菌目标被确定由其杂交模式灯/关灯探测来自分子信标。复杂混合物的目标也被检测到。 结论。所有微生物目标被确定样本中含有低起始拷贝数的病原体基因组DNA,既是个人目标和复杂的混合物。 这项研究的意义和影响。本试验使用新技术来实现一个领域的进步分子诊断:一般的单管多路检测病原体的识别与脓毒症有关。

 1。介绍

在全球范围内,脓毒症影响数以百万计的人们,造成至少1 4 [ 1, 2]。Nucleic-acid-testing——基于(NAT)的病原体识别方法有一段时间被认为是一个理想的替代传统文化诊断败血症标本的分析方法( 3- - - - - - 23]。前3小时内早期目标指导治疗严重脓毒症和脓毒性休克的临床表现有显著提高的结果( 1, 24- - - - - - 31日]。分子诊断方法的使用是合理的,因为他们是快速、敏感的,具体的和可再生的 32]。

我们已经优化linear-after-the-exponential PCR (LATE-PCR)克服固有的挑战建筑的高度信息单管多路检测败血症,无限的可能的病原体必须检测。LATE-PCR是一种非对称PCR生成单链DNA从而能够探测并量化这些线端点( 33- - - - - - 41]。利用扩展温度和荧光的空间现在可用于检测目标端点,LATE-PCR化验可以多路复用( 40]。

两个概念上不同的脓毒症单管多路复用分析设计和测试在我们的实验室。设计使用探针和引物特定的组合来选择感兴趣的基因为每个目标区分17病原体以及内部控制( 42]。第二个设计,这里描述,放大三个目标,一个细菌16 s rDNA序列,序列 假丝酵母P450L1A1基因,和一个序列 Lactococcus lactis无性系种群。 cremoris作为一个内部控制。这个概念上简单分析区分不同的细菌种类的事实,分析了目标端点使用单一颜色的灯/关灯探针。灯/关灯探针是最近描述技术,可以轻易区分序列变异的单链产品由LATE-PCR生成多路复用反应( 43]。的 假丝酵母物种,以及 l . lactis控制是杰出的通过使用基因特定探测器还分析了在不同颜色的端点。

 2。材料和方法 2.1。16 s败血症试验配置和参数

16 s败血症多路复用实验设计如表所示 1。在这个设计16 s细菌基因组DNA检测灯/关灯探针在类星体670荧光染料的频道 Lactococcus lactis无性系种群。 cremoris控制DNA和 假丝酵母感兴趣的物种被发现在560年加州Org和加州红610个频道,分别。图 1显示引物的位置和灯/关灯探针16 s地区的选择。关灯探头位置突出显示在灰色灯探头位置用红色突出显示。整个地区的157个碱基引物之间的完全覆盖着灯/关灯探针。预测的熔化温度,经颅磁刺激,灯/关灯探测器如表所示 2。

16 s败血症多路复用分析配置。

温度 加州橙 加州红 类星体
高 ↓ 低 l . lactis 白念珠菌 16 s细菌目标
c . glabratta
c . parapsilosis
c . tropicalis

16 s开/关预测调查Tms°C。

目标 类星体1号探测器 类星体2号探测器 类星体3探测器 类星体4探针 类星体1从探针 类星体2从调查 类星体3了调查 类星体4了调查
AB 50.2 64.9 18.1 59.5 50.8 42.4 18.3 40.3
EA 69.5 58.6 11.6 69.7 61.5 54.5 18.3 42.1
电子商务 69.5 58.6 11.6 69.7 61.5 54.5 33 56.4
EFS 24.1 59.7 −2.8 70.6 7.8 34.6 20.6 −3.2
EFM 24.1 59.7 −2.8 70.6 7.8 34.6 20.6 −3.2
KP 70.6 66年 13.8 70.6 62.6 64.5 35 57.7
KO 69.5 58.6 11.6 69.7 61.5 54.5 33 56.4
巴勒斯坦权力机构 68.9 66年 −2.8 58 52 60 35 39.6
SA 54.5 53.8 63.9 34.7 36.8 39.3 20.6 30.3
SE 54.5 53.8 53.9 34.7 36.8 39.3 20.6 30.3
上海 54.5 53.8 50.1 34.7 36.8 38 20.6 30.3
党卫军 54.5 53.8 58.2 34.7 36.8 0.9 20.6 30.3
单孔位微吹气扰动 54.5 53.8 56.7 34.7 36.8 38 20.6 30.3

开/关探头放置在321 - 524个基点地区的16 s rDNA基因 答:baumannii(NC_010400)。在探针在红色斜体文本和探针以灰色突出显示。引物在蓝色文本。两个相邻探针在大胆的之间的区别。

表 3列出了序列和所使用的引物和探针的经颅磁刺激在16 s败血症多路检测。的 假丝酵母sp.和控制引物和探针中使用的相同基因的特定版本的分析( 42]。表 4列出了细菌和真菌基因组DNA的目标病原体测试面板。

LATE-PCR 16 s败血症多路复用引物和探针序列。

底漆 序列5′ → 3′ 基地
16 s限制底漆 CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 25
16 s多余的底漆 GTATTACCGCGGCTGTGGCA 20.
假丝酵母限制底漆贴切 ACCATTACCTCATTATTGGAGACGTGATGCTGC 33
假丝酵母多余的底漆贴切 GCAATTTCTTGATCAGTCATTTTTACACCATCTT 34
假丝酵母限制底漆G ATGCCCAACAAGCTATCTCTGGTACTTACATGT 33
假丝酵母多余的底漆G CGGATGTTGCAGGGGAAGTATGTTGACCACCCA 33
l . lactis(控制)限制底漆 CTAAAATCAGGAACTTCGTTATCTTTAGTAGTCACAACCA 40
l . lactis(控制)多余的底漆 TAATCATTATTCCTCAAGAAGAGATACAATCGGTCA 36
控制探针 卡尔Org 560 - ataaacctttcttaaaat bhq1 18
假丝酵母恰当的调查 加州红610 - atgtgatattgatccaaatcgtgatttaatat bhq2 32
假丝酵母G探针 类星体670 - aaacaaggatggtactaggatgaccgtt bhq - 2 28
16 s类星体1 670 - aagcgaaagcctgatgcagccatt bhq2类星体 24
16 s类星体2 BHQ2-TAGCCGCGTGTGTGAAGAATA-Quasar 670 21
16 s类星体3 670 - ttatatgtgtaagtaactgtgcacatcaa bhq2类星体 29日
16 s类星体4 670 - ttgaagaagcaccggctaactccgaa bhq2类星体 27
16 s类星体1 AAGGGGAATATTGCACAATGGTT-BHQ2 23
16 s类星体2 BHQ2-TTGGCCTTCGGATTGTAAAGCACTTAA-C3碳链接器 27
16 s类星体3 TATTAGTAGGGAGGAAGTA-BHQ2 19
16 s类星体4 TTGACGTTACCCGCAA-BHQ2 16

细菌和真菌基因组DNA 16 s败血症多路检测的目标。

目标 缩写 加入ID 写明ATCC收购
细菌
一个。baumannii AB NC_010400 17978 d-5
E。aerogenes EA HM480361 15038 d-5
E。下水道 电子商务 GU979185.1 13047 d-5
E。粪 EFS NC_004668 700802 d-5
E。都有效 EFM AJ301830 baa - 472 d - 5
K。肺炎 KP NC_011283 baa - 1706 d - 5
K。oxytoca KO NR_041749.1 来自加州大学戴维斯分校
P。绿脓杆菌 巴勒斯坦权力机构 NC_009656 17933 d
年代。葡萄球菌 SA NC_002745 巴里Kreiswirth PHRI
年代。epidermidis SE NC_002976 12228 d-5
年代。haemolyticus 上海 X66100 29970 d-5
年代。saprophyticus 党卫军 EF522127.1 来自加州大学戴维斯分校
年代。hominis 单孔位微吹气扰动 X66101 来自加州大学戴维斯分校
L。lactis(控制) 细胞毒性t淋巴细胞 NC_008527 收到史密斯
真菌
C。白色的 CA AF153846 14053 d-5
C。parapsilosis CP GQ302972 来自加州大学戴维斯分校
C。tropicalis CT AY942643 来自加州大学戴维斯分校
C。glabratta CG AY942647 来自加州大学戴维斯分校

2.2。16 s分析引物和探针设计

提供的16 s败血症多路复用分析另一种原型基因特定目标的方法( 42]。交替守恒和高度可变区域的16 s rDNA细菌放大成为可能的基因在许多不同种类的细菌,同时区分它们。这些高度保守的区域作为模板为引物设计,确保所有感兴趣的细菌会被放大。张成的可变区域之间的序列引物被用于识别和区分物种使用灯/ 670年类星体关灯探针荧光染料通道。

灯/关灯探测器被设计成共识探针绑定到尽可能多的目标有四个开/关双完全涂层引物之间的地区。绑定Tm探测目标的差异让13细菌物种之间的区别,包括在我们的测试面板。所有探测器的输出荧光复合材料随温度的上升与下降,产生荧光等高线特定病原体。

其他特定的引物和探针集所需的 假丝酵母和内部控制检测。这四个 假丝酵母病原体与单独分析了我们的测试面板的加州红610染料通道使用特定的引物和探针。P450L1A1基因的一个区域被用来创建特定的引物的两双灵活通过放大四位人士 假丝酵母物种。两个探测器被设计以类似的方式只捡的 假丝酵母感兴趣的物种。除了致病性目标在测试面板中,特定的引物和探针设计放大的一个未指明的基因 Lactococcus lactis无性系种群。 cremoris作为内部控制在560年加州橙检测。引物和探针序列是为以前描述的LATE-PCR分析基于标准( 36]。

引物和探针序列是通过一系列的生物信息学分析。序列是通过一个基本的局部比对搜索工具(爆炸)搜索相比,所有其他序列在NCBI基因库,以确保有足够的核苷酸差异目标生物及相关,非目标生物(附近的邻居)。一旦有针对性的引物和探针通过爆炸搜索评价monoplex化验是优化对病原体基因组DNA的目标。验证后monoplex化验,他们组合成一个单管多路检测,测试所有病原体基因组DNA的目标和引物和探针集。

表 5列表中使用的试剂及其浓度16 s败血症多路检测。温控技术用于生物Rad IQ5系统的放大和检测分析如下:95°C 3分钟,随后,95°C / s, 65°C / 15秒,72°C / 45 s 45周期后跟一个融化从25°C和1°C / 30多岁增加到80°C,紧随其后,退火开始在80°C 1°C / 30多岁降低到25°C。560年卡尔橙色荧光测定,加州红610年和类星体在每个退火步骤670个频道。分析中使用的数据都是来自最终退火曲线。

LATE-PCR 16 s败血症多路复用试剂。

起始浓度 试剂 最终浓度 Amt / 25 uL反应 制造商
10倍 PCR缓冲 10更易−1 在珠 通用电气医疗集团
10更易−1 核苷酸 200年umol−1 在珠 通用电气医疗集团
50更易−1 毫克+ + 1.63更易−1 1.13 uL +珠子 表达载体
10 umol−1 限制底漆(4) 50 nmol−1 0.125 uL σ
100年umol−1 多余的底漆(4) 1 umol−1 0.250 uL σ
10更易−1 在探针(7) 100 nmol−1 0.250 uL Biosearch
10更易−1 从探测器(4) 300 nmol−1 0.750 uL Biosearch
2.5 U /珠 纯Taq准备珠子 1.25 U 0.5珠 通用电气医疗集团
106基因组拷贝 gDNA 105基因组拷贝 1 uL 写明ATCC

2.3。16 s脓毒症分析:数据分析和临床的电话

最终退火荧光数据出口BioRad IQ5 2.1软件为Microsoft Excel。退火数据归一化到75°C到地方上的所有放大井相同级别的背景荧光,然后没有减去背景模板控制(NTC)归一化荧光轮廓。随后,最高的荧光峰被规范化为1.0,进一步把所有荧光轮廓相同的规模。我们已经考虑了一些数据分析的方法,将允许一个积极或消极的调用,为一个特定的病原体检测的误差范围内。这里我们概述一个软件程序的最好方法临床呼叫。未知样本将被放大16 s败血症多路复用分析和固定数量的端点退火读数将放大后的完成和探针绑定已经达到平衡,例如读每5°C。按上述数据将被规范化。

荧光值的温度点可以被编译成一个表,通过该软件可以扫描。第一扫描通过温度的软件决定样本的值为1.0。这个温度将对应于一个或多个目标特征库。一旦确定温度和可能的目标缩小,在温度点荧光水平高于或低于可能的目标进行比较。第二个比较允许确定正确的目标,因为细菌荧光等高线的具体性质。

 3所示。结果

LATE-PCR 16 s败血症多路复用分析成功地识别所有13个细菌和四个真菌目标在我们的病原体测试小组除了内部细菌控制在不到三个小时。试验还检测到一个革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌 假丝酵母物种。这是很重要的,因为脓毒症可因各种病原体。因为我们的灯/关灯探针的设计,这个分析也将识别细菌物种不包括在我们的测试面板。

3.1。LATE-PCR 16 s多元分析

试验配置表 1细菌和真菌病原体的分布显示表中列出的测试面板 4。所有13个细菌目标检测在一个单一的颜色使用灯/关灯探针技术。剩下两个通道用于真菌和内部控制检测。由于细菌的控制也做了一个荧光等高线在类星体通道和其他细菌的目标。

引物被放置在两个高度保守的区域的16 s rDNA侧面高度可变区域(V3)。这些引物,从理论上讲,放大的98% > 900000 16 s核糖体DNA序列在密歇根州立大学的核糖体数据库( 44]。多个细菌病原体的检测没有野生型序列,设计荧光探针,因此共识探针是理想的选择。变量地区涂有4双灯/关灯共识探针。每个探测器的目标DNA序列的差异导致每个探针/ Tm目标不同,反过来,结果在一个独特的轮廓组探测每个细菌病原体的目标。

图 2显示了13个细菌的荧光轮廓目标(指根据表中列出的缩写 4)。每一个荧光等高线图 2平均三个复制样品。我们曾表明,所有三个复制本质上是相同的实验范围内( 43]。EFM不显示,因为它给了相同的轮廓EFS。这是真实的,尽管两个序列的扩增子相差6个基地。但是,这些序列差异并不是发现因为没有共识的目标探测这些部分的两个扩增子有一个Tm超过25°C。事实上,只有三个八共识灯/关灯探针集杂化这两个 肠球菌目标,和序列下这三个调查得出了相同的荧光轮廓。下面讨论了几种可能的补救措施模棱两可。

归一化退火曲线显示所有16 s目标在类星体通道的最高峰值归一化到1.0。

如数据所示 3和 4,我们的测试面板的细菌目标温度隔离空间的基础上是否革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。的相对高GC含量最高的革兰氏阴性物种造成了Tm规范化荧光轮廓是高于50°C。革兰氏阳性细菌的荧光轮廓,相比之下,低于50°C。图 3显示了荧光革兰氏阳性目标的轮廓。虽然几个轮廓看起来相似的曲线有重要的细微差别,允许他们区别于另一个。16 s败血症多路高重现性的测定和灯/关灯探针不管基因组DNA的起始浓度意味着这些轻微的细微差别是一致的,可以可靠地用于物种鉴定。SA和EFS最不同于大多数其他的目标,尽管EFS和CTL相似的轮廓。

归一化退火曲线显示所有革兰氏阳性16 s目标在类星体通道的最高峰值归一化到1.0。

归一化退火曲线显示所有革兰氏阴性16 s目标在类星体通道的最高峰值归一化到1.0。

一些在革兰氏阳性葡萄球菌物种种类测试,图 5。单孔位微吹气扰动和SS的荧光轮廓区分从彼此和SE和SH 45°C和50°C之间的轮廓,尽管SE和SH并不区分彼此的温度。但互相SE和SH清晰可辨25°C和30°C之间。这些结果说明多个双灯/关灯探测器生成一个高水平的信息,因为他们测试探针/目标交互在宽温度空间。

归一化退火曲线显示凝固酶阴性16 s目标在类星体通道的最高峰值归一化到1.0。

图 4显示的荧光轮廓革兰氏阴性测试小组的目标。与革兰氏阳性目标这些轮廓高度可再生的,无论从基因组DNA的浓度。KO和KP物种是不同的从一个另一个因为KO额外的肩膀表示灯的绑定探针在更高的温度下,60°C,绑定的配对关灯探针在55°C。这两个 肠杆菌属物种也可以区分,因为灯信号由EA仍然荧光温度低于EC信号。成对关灯探针结合EA约53°C和欧共体在63°C。

为了测试每个菌种的检测极限,基因组DNA是从100000个细菌基因组稀释10基因组在十倍的步骤。图 8描绘了一个代表稀释系列。所有样品都是通过共有45个热循环放大。因为16 s rDNA存在在一些细菌基因组(从1到15册 45),我们认为检测10份层面象征一个细菌基因组的最初出现在25 μL样本。不管有多少个基因组最初样品表现出相同的荧光轮廓后,在场的最高峰45周期用于正常样本在整个检测温度范围。这个结果再一次证实荧光LATE-PCR轮廓和荧光签名是高度可再生的特性分析与灯/点火探测( 43]。

这里描述的完成多路检测也用卡尔红610探针(图 6)检测10的存在5基因组DNA的拷贝 假丝酵母sp 。和加州橙560探针(图 710)测试5控制基因组DNA的拷贝 Lactococcus lactis。

退火曲线显示荧光等高线的四个测试 假丝酵母物种卡尔红色通道。

退火曲线显示荧光等高线的控制 l . lactis在加州橙通道。

荧光等高线的SE系列稀释105基因组拷贝到10基因组拷贝来自黑暗的梯度(10所示5)(10)。减去NTC的背景是由虚线所示的强调,10复制稀释高于背景。

16 s脓毒症的多路复用分析四种不同的解决 假丝酵母物种使用两对引物扩增区域P450L1A1基因和两套调查分析单链产品。第一组引物扩增三四个物种, 白念珠菌,c . parapsilosis, c . tropicalis。第二组引物扩增 c . glabratta和 c . krusei尽管后者物种实际上并不是测试实验报告。探针集设计生成惟一的信号的四种可能的物种。这些探针分子信标探针,因此表现出独特的融化温度而不是荧光轮廓。

内部控制序列 l . lactis被用来确保样品制备协议没有妥协的完整性从任何细菌的基因组DNA测试。这个序列是放大使用自己的一套引物,检测到使用卡尔橙色探针。但 l . lactis基因组DNA也生成一个16 s荧光等高线类星体670频道,因为它是一种细菌物种。为了避免这种歧义在未来指出我们正在调查其他无菌控制,不具备16 s基因的目标,但仍然准确评估样品制备协议。

 3.2。混合的细菌的目标

16 s败血症化验必须检测多个细菌病原体的存在。因此,我们测试了16 s败血症多路复用分析混合物的目标,特别专注于败血症和SE小组目标。图 9显示了10%的混合物KP实验数据:90%,50%,KP和SE和10% SE: 90%纯KP和SE也显示。图 10显示了10% SE的标准化实验数据:90%,50% SA和SE,山:10%和90% SE混合物以及纯SA和纯SE。

混合物的荧光轮廓 肺炎k和s epidermidis类星体的通道。

混合物的荧光轮廓 金黄色葡萄球菌和 美国epidermidis类星体的通道。

所有目标总基因组DNA的混合物有10000册。50的混合物:50岁,10:90年,和99年1:评估。但是,1:99混合物没有不同于利比亚全国过渡委员会控制超过三个标准差和没有显示。这里显示的两组混合物说明几个有趣的特性的分析方法。KP的荧光轮廓和SE温度不重叠的空间。因此混合这两种生物演示最大可能的灵敏度微量组分,人物 9。这种生物的结合也代表着一种革兰氏阳性和革兰氏阴性的混合物。图中的数据 9表明,至少10%的病原体的存在90%的另一个区别于纯粹的样本。

相比之下,SA和SE荧光轮廓非常相似。图中的数据 10显示50:50混合这两种革兰氏阳性物种可以很容易地区别于纯样品。10:90和90:10混合物也可解决的,但是荧光等高线轮廓类似于100%。

 3.3。16 s败血症化验:背景人类DNA

人类基因组DNA的存在是另一个可能的挑战任何化验检测的鲁棒性细菌16 s基因组DNA。图 11显示的混合物的荧光等高线105SE基因组DNA的副本+ 35000份Promega人类基因组DNA,比纯粹的SE,单独或纯人类基因组DNA。很明显,人类的DNA没有影响细菌的DNA荧光等高线。

虚线显示荧光等高线为美国epidermidis + 35000人类基因组DNA的拷贝。如图所示,SE轮廓不影响的人类gDNA它匹配的轮廓SE (-°)。显示了人类gDNA轮廓的坚实的黑线。

 4所示。讨论

大多数分子诊断化验利用对称PCR目标放大和sequence-specific双链DNA的荧光探针用于实时检测产品。这些基于NAT的技术到目前为止没有辜负他们的承诺,因为他们缺乏能力提供所有所需的信息在一个单闭管反应。因此,败血症样本必须有大量的病原体,可以分割和并行运行在几个管。此问题的解决方案在于使用单管反应,收益率准确、可靠、相关的信息从一个样本有病原体的浓度较低。这里描述的LATE-PCR脓毒症试验开始解决一些这些目标。

一种替代方法,基因特定版本LATE-PCR分析描述其他地方也具有高度的信息和非常敏感的 42]。寻求识别特定病原体时,特定的基因检测能够检测到一个单一基因的基因组复制甚至在其他细菌的存在目标。合并感染的基因具体分析被测试场景在一个人类DNA背景可靠的检测比例为99:1。基因的特异性和灵敏度水平具体分析使它非常有用可靠的病原体检测在临床设置。基因具体分析的局限性是它不能检测病原体,这不是设计。因为这个原因的16 s rDNA LATE-PCR这里描述分析提供更大的覆盖范围比基因特定的试验。

16 s rDNA败血症多路复用分析达到广泛覆盖利用共识一起探讨我们的小说灯/关灯探针技术。这两个组件协同,每个可以扩展进一步取得更广泛的病原体检测和识别。引物是守恒的序列,因此几乎普遍放大任何细菌16 s基因的潜在目标。事实上,高灵敏度的引物实际上引入了一个潜在的独特分析的局限性,因为它检测到 大肠杆菌基因组DNA存在于许多商业Taq聚合酶。因此,聚合酶必须是高纯度的痕迹 大肠杆菌在后台rDNA。

16 s化验也容易扩展。额外的充分利用荧光染料通道可用于包括更多的额外的病原体检测探针集。这些探针集提供进一步的目标数量的增加之间的区别。例如,我们已经能够完全区分EFS和EFM荧光轮廓通过添加额外的组灯/关灯探测器在610年加州红通道(数据没有显示)。

其他脓毒症的分子诊断试剂使用16 s rDNA目标放大多种病原体。SepsiTest,例如,使用16 s基因放大任何目标样本中细菌,但病原体并不容易区分,直到放大产品排序( 46, 47]。测序诊断增加了成本和时间,并可能导致实验室污染释放扩增子。相比之下,这里描述的LATE-PCR 16 s败血症多路检测放大并识别许多病原体在同一管关闭。只有识别病原体需要测序,一旦他们独特的荧光测序轮廓在未来的测试也可以立即识别出来。

SeptiFast光周期计检测能够检测和识别25常见败血症病原菌在短时间内不使用排序( 48]。但是,SeptiFast光周期计测定取决于将50 μL样本分成三个平行管识别革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌。LATE-PCR 16年代测定,相比之下,是一个三层分析,使得相同的调用在一个单筒有反应总额仅25岁 μl

 5。结论

这里描述的LATE-PCR 16 s败血症多路复用分析可靠地检测到13细菌种类和四个 假丝酵母物种和给了一致的荧光感染我们的测试小组的目标轮廓。我们展示了分析检测到10基因组拷贝,以及分化时仅为10%的混合温度空间最大化。这个试验技术用来构造是小说和高度灵活。

 确认

作者感谢巴里医生Kreiswirth PHRI,纽瓦克n . j .基因组DNA的12株细菌培养 金黄色葡萄球菌。他们也感谢加州大学戴维斯分校POC写明ATCC基因组DNA技术中心提供。这项研究是由美国国立卫生研究院拨款1 rc1eb010543-01和5 rc1eb010643-02和史密斯探测诊断,Inc .,英国沃特福德。

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