真菌和卵菌纲负责许多最毁灭性的植物疾病导致的全球农业非常重大的损失。描述了大约100000种真菌和卵菌纲,但只有一个非常小的比例的这些致病( 1]。然而,系统发育研究表明,致病病原体不一定是彼此密切相关。事实上,它们遍布所有的真菌分类群,经常显示不致病的物种进化关系( 2]。因此它似乎phytopathogenicity多次进化作为一个特征在真菌和oomycete进化( 2]。重大的努力已经取得了病原性因素如单个基因的识别是至关重要的病原体入侵寄主植物成功但腐生的增长是可有可无的 3]。

尽管不同来源和不同网站真正的真菌和卵菌的系统发育树 4],它已经表明,一系列的分泌蛋白质被称为感受器对建立感染的寄主植物很重要 2]。这些分泌蛋白可以抑制植物防御和破坏细胞过程以适应入侵病原体的需要。它们包括许多分泌蛋白酶,转录因子,和组件的信号转导途径。在真菌中,蛋白酶发挥一般营养作用或特定的角色在细胞代谢或致病性或毒性的因素。真菌天冬氨酸、半胱氨酸、金属丝氨酸,苏氨酸蛋白酶,蛋白酶以及无特征类,已确定( 5]。

共有282061个预测蛋白质分为23724集群,只有16个集群包含蛋白质被发现在所有34种真菌,但缺席一些物种的卵菌( 6]。fungal-specific集群的这个数字是惊人的低考虑系统发育卵菌和真菌之间的距离。病原性因素被定义为基因致病的成功完成生命周期至关重要但可有可无的腐生的增长 6]。

真菌的生活方式和环境决定的一系列酶表达。真菌与不同组的生物有许多营养的关系。由真菌分泌的蛋白酶(特别是病原体)允许他们适应不同的生活环境。真菌有扩大的肽酶在进化过程中利用不同的蛋白质来源。半胱氨酸蛋白酶分为6个主要classes-serine,苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、和metallopeptidases官能团的性质在酶分子的活性中心。胞外蛋白水解酶的真菌是在很大程度上代表了丝氨酸蛋白酶。有两个主要的家庭存在于真菌的丝氨酸蛋白酶:枯草杆菌蛋白酶(S8)和胰凝乳蛋白酶(S1)家庭 5]。胰凝乳蛋白酶家族包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶和大多数这些酶的真菌是胰蛋白酶。根据初步观察,生产trypsin-like酶是植物病原体的特征而细胞外endoproteolytic腐生生物活性提供主要与subtilisin-like酶( 7- - - - - - 9]。

发病机制最重要的酶可以是那些允许真菌穿透防护植物表皮的角质层和破坏植物细胞壁的果胶矩阵嵌入的纤维素纤维。似乎有一种更常见的蛋白酶和肽酶域的数量在植物病原体的基因组 6, 10]。蛋白水解作用是一个重要的组成部分,在所有生物体许多生理过程。蛋白酶也涉及许多动物和植物病理条件和被认为是重要的毒力因子许多病原体,包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。从微生物蛋白酶显示许多独特特征的催化机理、底物特异性,激活机制、热稳定性、pH值最优( 11]。小说特色真菌可以代表另一个来源的蛋白酶,蛋白酶发挥主要作用的生理、形态发生和真菌代谢。针对这些功能,蛋白酶的催化类已确认为从菌丝分泌。它们包括丝氨酸蛋白酶,其中大部分被分类为枯草杆菌蛋白酶( 12]。

本研究的目的是比较分析蛋白酶分泌的 5种(蒙脱石)。对于, 辣椒,和 镰刀菌素culmorum因果代理几个土豆的疾病。病原微生物属于不同的真菌和pseudofungi家庭。我们认为这项研究获得的数据可以帮助澄清质疑他们组成的系统发育地位取决于病原体。

文化过滤 p . 5(蒙脱石)。对于, r .以上, f . culmorum测试exoproteinases的活动。一些环境因素的影响,这些微生物的胞外蛋白酶的生产控制中系统地研究了批文化。不是所有的定义媒体测试研究了研究了酶的生产,尽管他们都支持良好的增长(见图 1)。所以我们没有观察到一些变化产生的蛋白酶分泌到培养基接种时这些隔离成包含KH的半合成培养基₂阿宝₄,MgSO₄,FeSO₄、硫胺素和核黄素。

作为研究病原体分离造成马铃薯的最具破坏性的疾病,我们添加到培养基热稳定马铃薯块茎蛋白质。这开始分泌蛋白酶的真菌 r .以上和 f . culmorum(数据 1 (b)和 1 (c))。在的情况下 p . 5exoproteinase活动期间仍低,几乎不变的发展文化,虽然我们观察到生物量增加(图 1 (d))。结果表明,增加了解₃到介质导致exoproteolytic活动显著减少,表明抑制分泌胞外酶的合成。当exoproteinase分泌抑制的硝酸盐,有理由相信,矿质氮调节适应环境病原体的一种机制,根据作者的 18),可以归因于异化的镇压。研究有机氮的影响exoproteinase分泌的病原体,酵母提取物是额外添加到培养基中。当酵母提取物添加到培养基观察exoproteinase分泌明显增加,这是伴随着加速增长的菌丝体(数字 1 (b), 1 (c), 1 (d))。酵母提取物作为额外的营养来源基质的微生物作为一个诱导物( 19]。重要的是要指出,oomycete能够秘密exoproteinases只有在酵母提取物的存在。因此,我们得出结论 P。 5种更严格的酶生产的营养比增长。有趣的是,有一个观察相互依存的几个因素进行了研究。在别人,结果显示明确的氮源和氮浓度之间的相互作用。基于观察到的相互作用,环境因素的选择来提高蛋白酶活动不是简单的,可能发生意想不到的拮抗或协同效应。有一些差异在各种环境参数的影响proteinase-related表型。

不是所有的定义的媒体进行本研究给了酶的生产,尽管他们都支持相当不错的增长。总蛋白酶活动增加的进化程度隔离的“发展”,这是来自遥远过去的真菌属于真菌的子囊菌(王国如此 f . culmorum)和担子菌( r .以上),而 p . 5属于门卵菌门(图 1(一))。传统上,由于他们的丝状增长习惯,卵菌纲真菌分类的王国。然而,现代分子和生化分析表明,卵菌和丝状真菌分类学亲和力但更密切相关褐藻(长短鞭毛体)stramenopiles,几个主要的真核王国之一( 20.- - - - - - 22]。在一系列的初步筛选实验的因素调查,只有介质pH值和氮浓度特别强烈影响细胞外蛋白酶活动。发现介质pH值范围在微酸性至中性,达成一个常数7.2 - -7.4(图12天之后的价值 1在隔离的增长)。致病真菌的能力来支持介质pH值不依赖于培养基的成分。合成和分泌的依赖exoproteinases介质pH值也被发现在某些微生物( 23]。因此,pH值可以归结为控制这些过程的因素之一。真菌是已知修改环境酸度调节( 24]。然而,真菌通常避免与不合适的pH值自然栖息地,可能是因为这种类型的调整代谢成本的竞争更具体pH-adapted微生物。最后,蛋白水解酶活性是强烈依赖于pH值,为了有效的蛋白质降解蛋白水解酶的最佳pH值应该匹配它们的栖息地的pH值。我们观察到的pH值中分离株的生长(图的影响 1曲线3)。

结果表明,蛋白酶的分泌取决于培养温度。文化在28°C时观察蛋白水解酰胺酶活性下降。21°C的温度是最优的生产exoproteinases隔离,显然与温度政权的栖息地的自然环境。这个温度的最佳研究病原体及其无法生长在气温升高可能反映其分布缓冲高温的自然栖息地。研究Allain-Boule et al。 25]报道温度20 - 25°C的最佳好几株 腐霉属attrantheridium隔离腔现货病变胡萝卜和苹果和樱桃苗。同样的, 在体外的增长 腐霉属splendens一个物种,杨桃根病害产生的原因在佛罗里达州南部,减少在温度超过30°C ( 26]。

由真菌分泌的胞外酶是最有效的在中性和微碱性pH值。所以,exoproteinases f . culmorum的最大特点是蛋白水解活性在pH值为8.0,和 r .以上在pH值8.5。exoproteinase活动的最高水平 p . 5观察中性pH值和最大的特点是在pH值7.0。第二个酶活性的增加 p . 5展出略碱性pH值表明蛋白酶的存在与pH值最优的行动在该地区从8到9。

由sds - page表示,所有研究隔离三个或更多的蛋白质分泌蛋白水解活性(图 2)。他们有分子质量从12到65 kDa。 镰刀菌素culmorum和 p . 5主要生产29 - - - 49-kDa蛋白酶 r .以上67 -和22-kDa分泌蛋白酶(图 2)。Exoproteinases所有三种病原体的显示低活性对酪蛋白和血红蛋白,而活动azocasein试验(表高出了很多 1)。

表 2提出了数据的胞外酶活性依赖所使用的基质。有明显的催化枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶之间的差异,在他们的底物特异性可以允许他们的区别。很明显,p . 5种exoproteinases最有效地水解BAPNA (trypsin-like生长的基质蛋白酶)和(在较小程度上的Z-AALPNA (subtilisin-like生长的基质蛋白酶)。同时,基板上的exoproteinases不采取行动为胰凝乳蛋白酶和elastase-like蛋白酶(Suc-GGFPNA Ac-AAAPNA, resp),以及氨基肽酶(LPNA)。酶分泌的 f . culmorum水解Z-AALPNA非常有效,在较小程度上BAPNA。他们显示低活性基质为胰凝乳蛋白酶和elastase-like蛋白酶,对氨肽酶。胞外酶的分泌 r .以上这个概要文件依赖于培养基成分(表 3)。BAPNA水解最有效,如果酵母提取物是缺席,但Z-AALPNA更有效地水解。特定的底物为胰凝乳蛋白酶和elastase-like蛋白酶和对氨基肽酶水解不佳。添加酵母提取物导致蛋白酶频谱的变化:Z-AALPNA水解最有效,但BAPNA更糟糕水解(超过五次,见下表 3)。分析的数据合成基质的影响针对特定群体的胞外酶活性的蛋白酶oomycete和真菌表示 p . 5主要分泌丝氨酸和金属蛋白酶,酶的丝氨酸类胰蛋白酶和subtilisin-like蛋白酶。在的情况下 f . culmorumexoproteinases主要由枯草杆菌蛋白酶表示,trypsin-like酶。exoproteinase概要文件的 p . 5和 f . culmorum不依赖于介质组成。

胞外酶的真菌 r .以上是由serine-type蛋白酶。当 r .以上种植过程中没有使用酵母提取物,trypsin-like丝氨酸蛋白酶分泌主要包括SH-dependent丝氨酸酶。subtilisin-like蛋白酶活性明显降低(表 3)。在酵母提取物的成分的存在 r .以上胞外酶浓缩在subtilisin-like蛋白酶而trypsin-like酶的含量显著下降(表 3)。还原剂的存在(l - EDTA)并不影响的蛋白水解活性的真菌exoproteinases azocasein化验,这表明没有半胱氨酸exoproteinases生长介质。

之间的相互作用不同的合成抑制剂exoproteinases三微生物分泌的研究(表 4)。EDTA,经常被用作金属蛋白酶的指标,有一些效果只在总蛋白水解活性的胞外酶 5页。的蛋白水解活性 p . 5exoproteinases降低了近两个半胱氨酸与EDTA的存在。这表明存在exometalloproteases被EDTA抑制(表的活动 4)。这证实了增加 p . 5exoproteinase活动50%在1毫米CaCl面前₂在pH值7.0。众所周知,金属蛋白酶的微生物被激活钙离子的存在( 27]。PMSF有效抑制;这表明所有的胞外酶的丝氨酸蛋白酶。chloromethylketone治疗分析表明,丝氨酸蛋白酶trypsin-like(表 4)。所以在实验中获得的数据合成抑制剂oomycete证实 p . 5主要分泌丝氨酸和金属蛋白酶,serine-type酶胰蛋白酶,subtilisin-like蛋白酶。的 f . culmorumexoproteinases主要是枯草杆菌蛋白酶,trypsin-like酶。用氯化汞治疗显著降低酰胺酶蛋白水解活性的胞外酶(表 4)。作为再次确认存在的丝氨酸蛋白酶的培养基 f . culmorum。azocasein化验的结果(表 4)表明,禁忌的天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶小或缺席。

exoproteinases分泌的作用 r .以上和 f . culmorum天然蛋白质的丝氨酸蛋白酶抑制剂与马铃薯块茎和豆类种子也是研究(图 3)。的活动 r .以上exoproteinases被特定的胰蛋白酶抑制剂抑制最有效地从马铃薯块茎和皂荚树种子以及大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(SKTI)(图 3(a),曲线1,3,4)。土豆胰凝乳蛋白酶抑制剂的互动我exoproteinases(图中的弱 3(一),曲线2)。提到trypsin-like活动的假设 r .以上没有酵母提取物被确认exoproteinases种植。SKTI和大豆Bowman-Birk抑制剂(SBBI) exoproteinases的行动 f . culmorum更弱(图 3(b),曲线3和6)。然而,马铃薯块茎的特定的枯草杆菌蛋白酶抑制剂有效抑制他们的活动,减少超过60%(图 3(b),曲线5)。这表明subtilisin-like酶构成的重要组成部分 f . culmorumexoproteinases。蛋白质抑制剂的研究也获得了类似的调查结果行动酶分泌的 p . 5(数据没有提交)。在实验中获得的数据证实属于真菌和oomycete exoproteinases的胰凝乳蛋白酶家族的蛋白水解酶 6]。应该注意的是,土豆枯草杆菌蛋白酶抑制剂抑制 在体外的生长和发育 f . culmorummacroconidia和 p . 5延长( 27]。我们可以假定分泌exoproteinases植物病原微生物的致病性的一个因素。

因此,主要的致病真菌胞外蛋白酶的抑制剂分析 r .以上和 f . culmorum和oomycete p . 5表明它们属于丝氨酸蛋白酶主要的集团。蛋白酶的底物特异性和敏感性合成和天然抑制剂的酶 f . culmorum和 p . 5trypsin-like和subtilisin-like蛋白酶。的胞外酶 r .以上依赖于培养基成分,尤其是氮营养的形式。当 r .以上随着污水生物胞外酶是由subtilisin-like蛋白酶。虽然 r .以上被孤立的只从马铃薯组织,它可以被认为是腐生生物,生活在持续植物碎片,就是明证subtilisin-like活动的增加。trypsin-like分泌的蛋白酶在文化由于其参与组织退化或援助感染通过破坏pathogenesis-related蛋白质或其他类型的分子。它是有趣的推测exoproteolytic子囊菌的能力 r .以上生命和非生命物质允许增长更多种类的蛋白质的基质。在回顾蛋白酶数据是很重要的认识到,只有那些保留活动后的酶样品电泳显示SDS-substrate-PAGE,而azocasein化验报告活动的总和所有在场的蛋白酶的样本。这就解释了电泳分离条件下的差异(图 2),对总蛋白酶抑制剂活性的影响见表 4。这可能是一个组件允许利基子囊菌和担子菌之间的分化,将前者适应致病性动物或可能来自适应致病性。在任何事件中,两个家庭的枯草杆菌蛋白酶在子囊菌早期辐射表明这些真菌的生活方式选择多种蛋白酶活动。

营养来源的范围利用某种真菌被认为是由于不同的分子,细胞和生态因子。许多酶的分泌由病原真菌与植物和动物宿主可以影响他们的关系。这表明酶的属性上的差异提供了选择性优势在不同的栖息地。丝氨酸蛋白酶是非常普遍的在自然界和参与多种生物学过程。属于这个类的酶在底物特异性显著不同,可对应于真菌生态位的要求( 7]。根据胡锦涛的意见和Leger r . j . [ 28),真菌中胰蛋白酶的断断续续的分布表明,他们的系统发育分布可能是更早期的比在现代的真菌。

我们的数据表明,不同的营养来源可以重要的微分丝氨酸蛋白酶的生产。致病真菌的多个枯草杆菌蛋白酶可能发病机理中起着不同的作用,提高适应性和宿主范围,或有不同的功能在各生态栖息地生存以外的主机。像枯草杆菌蛋白酶,胰蛋白酶是由环境因素诱导( 9, 29日]。因此,有几种机制用于适应不同菌株酶活动他们的具体需要特定的主机。这些类的微分生产表明,底物特异性蛋白水解酶可能是重要的,权衡可能防止同时upregulation两类的酶。似乎总蛋白酶活动增加与真菌进化的“进步”的程度。这些特殊的发展史可以反映趋同进化系统通过不同的酶进化分享重要的相似之处,也许通过定位类似的基质。

尽管一些形态相似、系统发育分析表明,有更多的相似之处exoproteinase oomycete之间的成分 p . 5和子囊菌 f . culmorum虽然他们比之间的距离更遥远的相对子囊菌和担子菌类 r .以上。我们的研究也表明, 在体外这些物种的行为不能直接相关的生态位分离。这种区别蛋白酶可以反映生理区别他们的营养环境(腐生生物和植物病原体)( 9]。

真菌通常产生一个广泛的蛋白水解酶降解蛋白质基质。然而,蛋白酶的性质差异研究生物体中发现不太可能是由于食品基质成分的变化只有当我们所有的实验涉及相同的培养基。因此,似乎,我们观察到的蛋白酶成分有显著的遗传因素。