乔 肿瘤学杂志 1687 - 8469 1687 - 8450 Hindawi出版公司 291898年 10.1155 / 2012/291898 291898年 研究文章 快速Stereomicroscopic成像的HER2过度 体外使用局部应用硅基金Nanoshells乳房组织 比克福德 Lissett R。 1、2、3 Langsner 罗伯特J。 1 常 约瑟夫 4 肯尼迪 劳拉·C。 1、5 Agollah 杰曼D。 6 Drezek 利百加 1、7 Benlloch 何塞玛丽亚 1 生物工程学系 莱斯大学 142年6100大街,女士 休斯顿 TX 77005 美国 rice.edu 2 生物医学工程与科学学院 弗吉尼亚理工学院和州立大学 布莱克斯堡 弗吉尼亚州24061 美国 vt.edu 3 机械工程系 弗吉尼亚理工学院和州立大学 布莱克斯堡 弗吉尼亚州24061 美国 vt.edu 4 医学院的 加州大学旧金山 旧金山 CA 94143 美国 ucsf.edu 5 医学院的 贝勒大学医学院 休斯顿 TX 77030 美国 bcm.edu 6 化学和过程开发、Nanospectra生物科学有限公司 休斯顿 TX 77054 美国 7 电子与计算机工程系 莱斯大学 休斯顿 TX 77005 美国 rice.edu 2012年 22 10 2012年 2012年 05年 04 2012年 11 09年 2012年 2012年 版权©2012 Lissett r·比克福德et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

肿瘤边缘检测主要发生术后患者乳房保留手术。以前,我们证明了黄金nanoshells迅速提高HER2过度的对比 体外组织部分。然而,我们的最终目的是辨别HER2 overexpressing组织从正常组织整体,nonsectioned,标本,以促进快速诊断。在这里,我们使用目标nanoshells迅速和有效地可视化HER2受体表达完整 体外人类乳腺组织标本。穿孔人类乳腺组织切片分析了短暂5分钟后孵化有或没有HER2-targeted silica-gold nanoshells使用双光子显微镜和立体显微镜。标签使用反射共焦显微镜随后证实,暗视野高光谱成像,和免疫组织化学证实的HER2的表达水平。我们的研究结果表明,anti-HER2 nanoshells配合使用近红外反射率共焦显微镜和一个标准的立体显微镜可能被用来辨别HER2-overexpressing癌组织和正常组织接近实时和提供一个快速补充目前的诊断技术。

 1。介绍

目前,乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大原因,它占了大约三分之一的癌症诊断的女性在美国( 1]。减少癌症复发和进展,癌组织必须完全消除,不管等级( 2]。乳腺癌外科治疗集中在切除原发肿瘤和识别的可能性评价前哨淋巴结转移性疾病。虽然有些病人可能需要改良根治性乳房切除术,许多欠发达乳腺癌患者选择手术。这些手术期间积极手术边缘的存在有关病人生存的低利率( 3]。由于残余癌细胞被抛在接受乳房保留治疗很多病人中,多达40%的病人经历过当地附近乳腺癌复发的原发肿瘤 4]。因此,术中治疗决策是至关重要的。

目前,术中肿瘤边缘检测主要发生在专业三级中心,比如德克萨斯大学安德森癌症中心(MDACC)。在这些中心,切除组织收到一个病理学家的初步评估,病人仍在手术室;如果有必要,可以删除,直到其他组织病理学家确定肿瘤的利润是负的。然而,在社区医院,切除组织的病理分析只发生术后( 5]。肿瘤患者因此有积极的利润必须换取外科reexcision和接收增加辅助放射治疗的剂量( 6, 7]。因此,积极的存在肿瘤病人利润率预示着更多的风险和成本。由于现有的限制目前的术中肿瘤边缘检测,有机会开发高级诊断工具协助减少不足导致癌症的复发和进展主要手术期间组织切除。

虽然组织学分析仍然是肿瘤边缘的黄金标准评估,整体的宏观评价,nonsectioned组织标本也可以用来提供一个术中估计后续处理前肿瘤的边缘地位。这将是一个宝贵的工具在医院没有现场病理学套件。宏观的可视化问题组织吸引力增强敏感性和特异性的肿瘤边缘描述:如果可疑区域的数量需要进一步微观处理可以减少,外科医生和病理学家可以集中他们的注意力和资源领域仍然是不确定的。目前,宏观评价只发生乳腺癌标本,涉及微钙化物质或nonpalpable群众和群众不发生明显的乳房 8]。nonpalpable群众已经切除,射线图像是用来确定乳房疾病的程度和接近切除利润率。虽然标本摄影似乎增加肿瘤边缘检测的准确性,限制已经指出。例如,微钙化物质,作为肿瘤影像学图像可能会出现淋巴细胞领域积累( 9]。造影剂的使用针对特定的与疾病相关的生物标记物可能出现的机会增加宏观评价的敏感性和特异性。

在之前的研究中,我们证实了硅基金nanoshells针对人类表皮生长因子受体2 (HER2)可以用于快速对比度增强的细胞( 10)和组织部分( 11HER2过表达生物标记)。而黄金nanoshells可以结合多种生物标志物( 12, 13),我们选择HER2由于其与增加癌症协会侵略,复发和进展当放大 14, 15]。扩增的细胞表面结合酪氨酸激酶受体发生在多达四分之一的人类乳腺癌病例( 16]。重要的是,使用生物标志物用于肿瘤边缘检测在最近的研究里它又显示出更好地识别高危病人的癌症复发在标准组织学分析( 17]。

促进提示肿瘤边缘检测处理,评估肿瘤边缘没有物理分割的能力是非常理想的切片可能招致重大时间的外科手术 5]。因此,在这项研究中,我们发展我们之前发现通过检查的能力迅速针对HER2受体完好无损 体外人类乳腺组织标本切片。我们首先确认优势所需的表面目标识别her2阳性的肿瘤边缘和优惠标签组织使用两个光子和高光谱成像。然后,我们表明,anti-HER2-targeted黄金nanoshells可以作为快速诊断显像剂在完整的乳房组织HER2过度使用标准的立体显微镜标本并确认这些结果通过反射共焦显微镜和免疫组织化学。

 2。材料和方法 2.1。Nanoshell制造和抗体结合

Nanoshells捏造和以前的描述( 18- - - - - - 20.,这里只提供一个简短的总结。硅芯是由使用长铁楔方法( 21],原硅酸四乙酯降低200年氢氧化铵的存在溶解在乙醇的证据。核的表面被反应然后修改与aminopropyltriethoxysilane (apt)用表面活性胺组。最后的粒子被测量动态光散射(DLS)平均直径为276纳米。接下来,胶体金( ~1 - 3 nm直径)捏造并吸附到表面的硅芯通过胺组形成黄金成核网站( 22]。完全覆盖的表面硅芯,额外的黄金是添加到这些成核站点通过还原反应中氢tetrachloroaurate三水(HAuCl43 h2O)溶解在碳酸钾然后添加甲醛帮助减少黄金。之后,金层硅芯形成,最后nanoshell解决方案的频谱是可视化使用紫外可见分光光度计(瓦里安卡里300)(图 1)。

测量消光光谱nanoshells平均内径276 nm和平均壳厚度19 nm。插入描述了相应的扫描电镜图像。比例尺表示500海里。

确定nanoshells浓度的溶液,吸收、散射和消光系数是决定利用米氏理论。nanoshell平均直径,验证通过扫描电子显微镜(SEM),与表面等离子体共振峰值314 nm 840海里。工作nanoshell溶液的浓度大约是2.0×109粒子/毫升。

Nanoshells被链接目标生物HER2抗原的表面Nanoshells anti-HER2抗体使用先前描述的方法( 18]。实验研究开始之前,nanoshells孵化了一个anti-HER2-linker鸡尾酒 182小时4°C。以确保稳定纳米颗粒在生物媒体,nanoshells下孵化一个1毫米聚乙烯glycolthiol解决方案(MW = 5 kD, PEG-SH内克塔)12 - 16个小时在4°C。接下来,游离抗体和过剩PEG-SH被离心从nanoshells中删除。实验研究之前,nanoshells resuspended在抗体稀释剂(包含IHC世界,pH值7.4)温柔的吸量最终成交量为165 μl

 2.2。<斜体>体外< /斜体>人体乳腺组织标本

正常和癌变(her2阴性和her2阳性)乳腺组织标本合作提供的人体组织网络(CHTN)通过一个协议批准的机构审查委员会(IRB)。被指定为正常或癌组织病理学家在医疗中心组织样本。此外,HER2状态以前由病理学家在各自的医疗中心前病人接受任何形式的治疗。

使用前,样本解冻简要37°C水浴和减少对一次性使用5毫米打孔砧板活检保持大小一致。至少两个穿孔从每个标本活检被控制和实验条件。每个削减标本使用5毫米直径平均厚度1毫米。组织样本随后被孵化prewarmed抗体稀释剂在室温下1分钟24-well板与温柔的风潮。预清洗后,样品被孵化抗体稀释剂或上述targeted-nanoshell鸡尾酒在聚乙烯样品瓶(西格玛奥德里奇)。瓶放在章动器在孵化器在37°C 5分钟。孵化后,组织样本从瓶中取出,冲洗3次1 x PBS短暂24-well板。样品被转移到一个干净的成像之前1 x PBS。

 2.3。双光子成像人类乳腺组织标本

her2阳性和her2阴性癌细胞表面标记的样本评估HER2-targeted nanoshells采用双光子成像完整的乳房组织标本。样本直接放置于一个玻璃盖玻片(费舍尔科学),和一个额外的盖玻片上的组织为了促进温和组织压缩。图像采集,蔡司多光子共焦显微镜(LSM 510元NLO)与一个连贯的变色龙femtosecond-pulsed串联使用,锁模钛蓝宝石激光器。该系统将操作和以前描述( 23]。具体地说,一个激发波长780 nm和10%的功率设定最大励磁功率。收集到的发射波长范围是451 - 697 nm。收集图片的放大20 x和 z 堆栈(深度)增加5 μm。为了计算覆盖面积的百分比由nanoshells ImageJ成像软件图像采集后实施。最近的研究表明,ImageJ可以用来分析信号强度silica-gold nanoshells在不同成像系统( 11, 24]。图像中的每个像素强度值在0 - 255的范围。确定nanoshell水平在每一个形象,一个30强度阈值用于单独的领域,没有nanoshells(≤30)从那些有nanoshells (> 30)。30的值被选中,是因为负面的图像控件有30的最大强度。像素数量高于阈值被用来计算每个图像的面积,包含nanoshells。

 2.4。暗视野人类乳腺组织切片的高光谱成像

确认存在nanoshells表面的组织her2阳性癌细胞,her2阴性癌细胞和正常组织样本孵化nanoshells如前所述。一层薄薄的病理墨水放在组织表面的取向。组织是嵌入在10月媒体(BBC化学)和冷冻迅速在干冰。标本被削减的截面厚度8 μ使用徕卡m CM1850 UV低温恒温器。癌标本切片在−−20°C和正常标本30°C。不同的温度被用来维持最佳的组织形态由徕卡推荐。此外,Magalhaes等人报道了使用不同温度下正常和癌组织切片( 25]。的部分就放在superfrost幻灯片(费舍尔科学)和允许干燥过夜。第二天,组织切片10 x目标成像在奥林巴斯暗视野显微镜配有Cytoviva高分辨率照明器。组织切片的高光谱图像被使用高光谱相机,为每个图像提供了空间和光谱数据。

光谱数据的每个字段的视图(FOV)被用来确定nanoshells在场每片组织。表面组织和组织之间的比较是超越表面来确定nanoshells的存在;光谱数据组织与nanoshells还没有孵化作为消极的控制。

 2.5。宏观人类乳腺组织标本的成像

正常和her2阳性恶性乳腺组织标本(从患者和没有收到新辅助化疗)是使用蔡司发现成像。V8立体显微镜配有VisiLED MC1000光源。宏观成像乳腺组织标本,一层薄薄的塑料黑色舞台是放置在一个玻璃盖玻片,使易于组织布置,并提供一个一致的黑色背景在所有样本。标本(控制和各自的nanoshell-labeled同行)被放置在彼此顶部的盖玻片。图片是在1和2 x放大在同样的照明条件。

 2.6。反射共焦显微镜成像人类乳腺组织标本

宽视野成像后,上述样本准备反射共焦显微镜下微观分析。这个组件的研究中,清醒VivaScope 2500反向使用共焦显微镜。样本直接放置于玻璃幻灯片添加修改过的胶1毫米深,直径20毫米硅隔离器(表达载体)。压缩组织,始终在样本中,一种组织的粘合剂磁带(清醒,Inc .)是直接放置在上方的硅光电隔离器组织标本。多个图像被0.4 mW的力量,在同一距离玻璃表面样本和控制。反射成像后,样本准备组织处理。此外,反射强度测量记录使用[描述ImageJ处理软件和以前 11]。

 2.7。免疫组织化学和组织学

一旦收集图像立体显微镜和RCM成像系统下,正常和her2阳性癌症样本(有或没有以前的新辅助化疗)是嵌入在10月媒体和切割的厚度5 μm。从每个标本准备多个部分免疫组织化学(包含IHC)或苏木精和伊红染色())。包含IHC HER2抗原被执行死刑的使用Histostain +原子能委员会广泛装备按照制造商的说明(表达载体)。)染色也按照制造商的说明执行(西格玛奥德里奇)酒精曙红Y的解决方案。图像采集,标准brightfield显微镜(蔡司Axioskop 2配备了蔡司Axiocam MRc5颜色相机)20 x的放大。

 3所示。结果 3.1。分布和黄金Nanoshells完整的人类乳房组织的渗透

本研究的目的是评估的分布anti-HER2-conjugated黄金nanoshells切除完整的组织标本。相比较而言,nanoshell标签her2阳性和her2阴性组织样本之间评估使用双光子成像系统。之前报道,这种成像系统能够提高和捕获的发光特征的黄金nanoshells [ 23),同时通过收集一堆图像感兴趣的组织的深度。图 2代表这些图片her2阳性和her2阴性肿瘤组织样本孵化HER2-targeted nanoshells。每个序列的增量 z 方向代表5 μ米到组织。定性,第一个图像(在表面或0 μ米)在图 2表明nanoshells优先标签HER2受体表面的组织。此外,图 2显示减少信号的焦斑的共焦显微镜进一步渗透到组织中。这被认为是由于最小数量的nanoshells能够穿透组织培养时间的有限,从而减少信号收集超出了表面。定量nanoshell信号的不同表面的her2阳性和her2阴性组织计算。使用ImageJ成像软件,它是确定,大约66%的视场her2阳性组织了nanoshells只有2%的视场her2阴性组织。这证实了优惠的标签和可视化的her2阳性组织使用anti-HER2 nanoshells。

Z 堆栈的双光子荧光图像her2阳性和her2阴性组织孵化HER2-targeted nanoshells 5分钟37°C。每个进步形象代表的渗透深度增加5 μm。放大x = 20。比例尺= 50 μm。

为了进一步验证nanoshells表面绑定,也获得了高光谱图像不同的组织部分。图 3(一个)显示了一个代表表面her2阳性组织切片与anti-HER2孵化后nanoshells。图 3 (b)说明了组织24 μ米之外的表面相同的组织。从多光谱( n = 3 )标本被孵化anti-HER2 nanoshells收购,和分析表明,组织没有nanoshells有非常相似的光谱在不同的患者。图 3 (c)显示每个视场目标各自的光谱信息如图 3(一个)和 3 (b)。此外,her2阳性组织的光谱没有nanoshells包括控制。在这张图表中可以看出,her2阳性的表面组织的光谱与孵化anti-HER2 nanoshells独特的相同组织24 μ米以外的表面。事实上,组织之外的光谱nanoshell-labeled标本的表面非常相似的光谱的表面控制。这些结果支持我们的研究结果,有针对性的nanoshells主要局部表面的组织。

暗视野的her2阳性组织切片的图像与anti-HER2-targeted孵化后silica-gold nanoshells。her2阳性组织,表面(a) (b) 24 μ米之外的表面相同的组织。(c)散射光谱领域的视图中描述(a)和(b)。此外,表面的光谱her2阳性组织不孵化silica-gold nanoshells显示为负的控制。比例尺= 50 μm。

 3.2。增强的光学成像完整的<斜体> <斜体>体外< /斜体> < /斜体>使用黄金Nanoshells人类乳腺癌组织

基于以前的结果展示的优惠标签HER2-targeted nanoshells表面完好无损 体外her2阳性组织标本,我们使用标准的立体显微镜评估潜在的可视化增强对比度。这个组件的研究中,人类乳腺组织标本中HER2受体病人诊断时进行评估和比较正常乳房组织。由于利用黄金的终极目标nanoshells快速标签肿瘤边缘处理在不同的患者群体,我们检查了组织从患者和没有接受新辅助化疗。所有组织样本与抗体稀释缓冲或孵化anti-HER2-targeted nanoshells 5分钟37°C。如图 4代表原始立体显微镜,拍摄的图像完整的组织标本孵化与抗体稀释剂单独显示没有标记或nanoshells独有的特征。然而,组织标本孵化与anti-HER2-targeted nanoshells展示大量粒子的表面组织。定性,her2阳性组织的病人没有接受化疗前显示了伟大与目标nanoshells标签。组织her2阳性的病人接受了新辅助化疗并展示丰富nanoshell标签与正常组织相比,虽然不是相同的程度上没有之前的化疗病人。相比之下,正常组织显示最少的nanoshell标签,和只有少数地区nanoshells可以直观地感知。

原始立体显微镜的图像(a)和(b) HER2-overexpressing癌变和(c)正常组织孵化与缓冲或HER2-targeted nanoshells 5分钟37°c。癌组织取自病人没有化疗和(a) (b)后新辅助化疗。箭头表示nanoshells。拍摄的图像在2 x。规模酒吧= 2.5毫米。

虽然nanoshell标签可以可视化的程度没有图像调整标准立体显微镜下,可以看到这个标签的优越程度更清楚简单的对比度增强后使用成像软件(ImageJ)。见图 5(一个),nanoshells更加明显的在组织背景下不管固有的组织成分。

(一)Stereomicroscopic HER2-overexpressing乳房组织的图片(有或没有新辅助化疗)和正常乳腺组织孵化与HER2-targeted nanoshells对比度增强后5分钟在37°C。放大2倍;比例尺= 2.5毫米。箭头表示nanoshells。(b)各自反射共焦显微镜图像的组织样本(a)。酒吧= 75 = 0.4 mW和规模 μm。各自(c) HER2免疫组织化学和(d))的结果在brightfield显微镜下20 x放大。比例尺= 0.35毫米。

验证增强nanoshell标签被宏观成像,表面相同的组织样本也使用反射共焦显微镜(图成像 5 (b))。并存的stereomicroscopic图片,我们看到戏剧性nanoshell表面标签在使用目标nanoshells与之前治疗her2阳性组织。以前接受过化疗的her2阳性样品,我们也看到增强nanoshell标签,虽然从一个较小的程度上比未经处理的样品立体显微镜所显示的结果。正常乳腺组织显示最少的表面标记与成像系统只有最小nanoshells明显。反射强度测量(数据未显示) ~2.5到3倍的her2阳性组织样本接受化疗和her2阳性组织不接受化疗相比,正常组织样本。

随后的组织学分析如图 5 (c)显示,HER2受体的分布与nanoshell-enabled对比对应对HER2与包含IHC看到。HER2表达被包含IHC是以前大治疗HER2阳性组织样本的样本比经历了新辅助化疗。这被认为是由于化疗的效果。Rasbridge等人先前表明病人对化疗高度变量,与先前为HER2阴性患者过度偶尔成为积极的治疗后,患者以前HER2阳性过度随后成为负( 26]。虽然患者化疗反应不同,组织之前确认为overexpressing HER2受体在初始诊断,无论化疗曝光,证明加强nanoshell标签在正常组织。此外,H&E-stained部分已包括所有组织样本(图 5 (d))说明了微观特征和差异与癌与非癌性条件。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们论证了能够使用有针对性的黄金nanoshells迅速改善可视化与疾病相关的特定的生物标志物侵略和进展(HER2)完好无损 体外人类乳腺组织和确认绑定位置通过共焦和暗视野显微镜高光谱。利用silica-gold nanoshells设计为快速诊断显像剂,外科医生和病理学家可以实现肿瘤边缘地位直接在手术室后宏观和微观评估。当多个方法术中肿瘤边缘检测是目前正在接受调查的 27- - - - - - 31日),我们正在开发一个便宜的和便携式系统的快速分析 体外标本及时根据渴望提高当前的方法在临床翻译由于监管与担忧 在活的有机体内系统。

恶性肿瘤的能力增强对比使用局部应用代理证明,已经口头和乳房组织使用荧光标记deoxy-glucose和表皮生长因子(EGF)配合 32- - - - - - 34)以及宫颈组织使用荧光标记金纳米粒子靶向表皮生长因子受体( 35]。然而,这些研究采用孵化时间从20-45分钟,超过的时间目前需要使用冰冻切片组织学获得肿瘤边缘地位。另外,上述研究利用光学结算代理,这可能是必要的对于粒子目标细胞内生物标记( 36, 37]。然而,黄金nanoshells针对细胞外生物标志物可能提供更有利的机会 体外术中肿瘤边缘检测不需要孵化时间太长或使用光学清算代理。

最近,我们证实为黄金nanoshells可以用来增强对比HER2-overexpressing细胞和组织的部分在5分钟的孵化时间( 10, 11]。然而,翻译这种技术对临床相关性要求能够评估整体,unsectioned标本。这里,我们确认黄金nanoshells,当针对HER2受体,可以用来区分完整HER2-overexpressing 体外组织从正常组织在同一培养时间,我们证明这种差异可以宏观上观察到。这些结果支持显微成像和对HER2免疫组织化学。

采用宏观成像术,医生或许能更好地分辨癌细胞和正常乳腺组织之前进一步微观分析和随后的组织学处理。最终,这个系统也可以用于其他诊断应用程序,其他解剖位置和其他生物标记与疾病有关。通过促进快速、准确的肿瘤边缘结果术作为一种补充目前的诊断方法,我们希望减少手术的时间不足导致组织切除。

翻译这些发现更容易的诊所,我们目前正在开发一种低成本的宽视野成像系统,可以用来检测HER2过度(和其他细胞外生物标志物)通过对比度增强nanoshells提供的黄金。此外,我们计划从不同患者群体收集数据和评估结果与新鲜组织样本。这样,使用黄金nanoshells只能展现广泛的功效和是有限的特定病人的子集。

 作者的贡献

比克福德和Langsner同样这项工作。

 确认

作者感谢合作人体组织网络提供新鲜冷冻组织样本。作者感谢格伦·p·古德里奇和Nanospectra生物科学公司提供nanoshells用于研究。作者还要感谢Nadhi Thekkek求助ImageJ数据采集。这项工作是由国防部国会支持指导乳腺癌研究项目希望学者奖利百加Drezek的时代,生物和环境纳米技术中心(eec - 0118007和eec - 0647452)。l·比克福德感谢国防部(DoD)培训支持通过国防科学与工程研究生奖学金(NDSEG)项目。

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