乔 肿瘤学杂志 1687 - 8469 1687 - 8450 Hindawi出版公司 265487年 10.1155 / 2012/265487 265487年 研究文章 在活的有机体内时间进程成像在结直肠肝转移肿瘤血管生成相同的生活老鼠使用双光子激光扫描显微镜 田中 Koji 1 森本晃司 Yuhki 1 Toiyama Yuji 1 松下 浩平表示 1 河村建夫 Mikio 1 小池百合子 Yuhki 1 Okugawa Yoshinaga 1 井上 Yasuhiro 1 田 Keiichi 1 荒木 Toshimitsu 1 沟口健二 阿基拉 2 Kusunoki Masato 1 Ramakrishnan 他 1 胃肠道和儿科手术 三重大学医学院毕业 2 - 174 Edobashi, Tsu 米氏514 - 8507 日本 mie-u.ac.jp 2 神经再生和细胞通讯 三重大学医学院毕业 2 - 174 Edobashi, Tsu 米氏514 - 8507 日本 mie-u.ac.jp 2012年 3 11 2011年 2012年 27 05年 2011年 19 08年 2011年 30. 08年 2011年 2012年 版权©2012 Koji田中et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

在活的有机体内实时可视化二次肿瘤的血管生成的过程相同的动物生活在转移研究中提出了一个重大的挑战。我们开发了一种技术,活体成像结直肠肝转移发展的活老鼠使用双光子激光扫描显微镜(TPLSM)。我们还开发了时序TPLSM活体的TPLSM程序进行多次几天到几个月。红色荧光蛋白表达结直肠癌细胞接种到绿色荧光蛋白表达小鼠的脾脏。第一和第二轮活体的TPLSM允许可视化的可行的癌细胞(红色)在肝血窦或Disse的空间。第三轮活体的TPLSM证明肝转移殖民地组成的可行的肿瘤细胞和肿瘤血管周围间质(绿色)。 在活的有机体内时间进程成像肿瘤的血管生成在同一生活老鼠使用时间序列TPLSM可以抗血管新生药物评价的理想工具,减少个人间变异的影响。

 1。介绍

血管生成是一个基本的过程生产的新血管在繁殖期间,胚胎发育、伤口愈合( 1]。这也是一个肿瘤的生长和转移的标志,和高水平的肿瘤血管生成与先进的肿瘤生长,远处转移,在人类癌症和不良预后,包括结直肠癌(CRC) ( 2]。

CRC是第二个全世界癌症相关死亡的最常见原因。尽管重大进展治疗转移性CRC增加了中位总生存期(OS)在24个月( 3, 4),5年操作系统四期CRC患者肝转移仍低于10%,尽管密集的多学科治疗( 5]。因此迫切需要了解结直肠肝转移和肿瘤血管生成的机制。

多光子显微镜,包括双光子激光扫描显微镜(TPLSM),介绍了在过去的十年中,已成为肿瘤生物学在生物实验室常用仪器( 6- - - - - - 8]。我们已经建立了一个新方法 在活的有机体内腹腔胃肠道疾病的实时TPLSM成像使用绿色荧光蛋白(GFP)表达小鼠( 9]。

在活的有机体内实时TPLSM成像大肠癌肝转移的形成是通过接种red-fluorescent-protein——(RFP)表达细胞株GFP小鼠的脾脏。肝脏这涉及固定使用一个organ-stabilizing系统最小化观察区域的微小振动引起的心跳和呼吸运动,因此允许可视化肝脏在更高的放大生活的老鼠。

我们还建立了一个时间序列TPLSM技术组成的几个活体的TPLSM观察在不同时间点在长时间的实验时间内允许肝转移形成的动力学遵循同样的老鼠生活在时间的月。

在这项研究中, 在活的有机体内实时结直肠肝转移形成的既成像与肿瘤血管生成使用活体的执行时序TPLSM。

 2。材料和方法 2.1。动物

GFP-expressing裸体小鼠(C57BL / 6-BALB / c-nu / nu-EGFP)从抗癌购买日本(日本大阪)。GFP裸体小鼠(20 g)繁殖,每笼住在六组小鼠,用颗粒状基底的饮食(CE-7克丽日本公司,东京,日本)。小鼠自由获取饮用水。他们在动物房设施三重大学医学院的湿度在标准条件下( 50 ± 10 % )、温度( 23 ± 2 °C),光(12/12 h光/暗周期),根据制度动物保健指南。综述了实验协议和批准的动物保健和使用委员会三重大学医学院毕业。

 2.2。人类CRC细胞系

RFP-expressing人类CRC细胞系(RFP-HT29)从抗癌购买日本。RFP-HT29细胞生长在单层文化RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Inc .,圣路易斯,密苏里州,美国)补充了胎牛血清(10% (v / v), GIBCO BRL,东京,日本),谷氨酰胺(2毫米),青霉素(100000单位/ L),链霉素(100 mg / L),和庆大霉素(40 mg / L) 37°C的5%的股份有限公司2环境。对常规通道,文化被泼1:10当他们到达90%融合,一般每3天。细胞在第五第九段用于肝转移实验。

 2.3。实验性肝转移模型

RFP-HT29细胞接种到GFP裸体小鼠的脾脏,作为异种的肿瘤模型。RFP-HT29细胞在第五第九段是收获与血清胰蛋白酶/ EDTA清洗RPMI 1640中剩余的胰蛋白酶的灭活。这些细胞被离心机和resuspended磷酸盐(PBS)。最后,这些细胞被调整到1×107细胞/毫升单细胞悬浮体。GFP裸体小鼠腹腔内注射麻醉的水合氯醛(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。在直视下,1×106细胞被注入脾脏使用30-gauge针通过一个小切口在左边侧腹部的麻醉GFP裸体小鼠。

 2.4。手术对活体的TPLSM(图< xref ref-type =“无花果”掉= "应该" > < / xref > 1)

概述和示意图liver-lobe固定和活体的TPLSM设置。(一)形象化的左外侧叶上中线剖腹手术后,紧随其后的是固定的左外侧叶焊料凸耳终端使用即时粘合剂。(b)麻醉的鼠标放置在舞台上和设置organ-stabilizing系统。(c)焊接接头终端是防水的方式坚持左侧侧肝脏叶表面使用一个即时的粘合剂。(d) PBS是应用于观测区,和一个水密薄盖玻片放置在该地区。焊料凸耳终端系统由organ-stabilizing举行。焊接接头终端,B:即时粘合剂,C:观察区、D:客观、E:水浸,F:盖玻片,G: organ-stabilizing系统。

接种后,GFP裸体小鼠腹腔内注射的水合氯醛麻醉。体温保持在37°C在整个实验使用加热垫。上中线剖腹手术是尽可能短(< 15毫米)。肝脏的左外侧叶是识别和形象化的剖腹手术。肝脏叶被放在一个organ-stabilizing系统(日本专利申请号;p2007 - 129723)使用焊料凸耳终端与瞬间粘合剂(KO-10-p20、DAISO、日本)。器官稳定器最小化观察区域的微小振动引起的心跳和呼吸运动。稳定和固定肝脏叶代表一个关键但技术上困难的部分活体的TPLSM过程。PBS的应用后观察到的区域,一层薄薄的盖玻片被轻轻地对肝脏表面。在活体的TPLSM,形象化的肝脏叶轻轻地从organ-stabilizing系统使用脱模剂(KO-10-p8、Daiso、日本),以防止肝损伤。 A sodium hyaluronate and carboxymethylcellulose membrane (Seprafilm Adhesion Barrier, Genzyme Corporation, Cambridge, Mass) was placed between the liver and the abdominal wall to prevent postoperative dense adhesion.

 2.5。时间序列TPLSM时间进程成像

肿瘤血管生成的过程中观察结直肠肝转移在同一住老鼠的肝脏在多个时间点重复TPLSM使用上述手术直到nondissecting肝脏和腹壁之间形成粘连。在初步实验,活体的TPLSM图像四个或更多的时间点太不清楚观察结直肠肝转移。如果没有致密纤维粘附在肝脏和腹壁,活体的TPLSM清除图像可以进行四次以上的间隔从几天到几个月不等。在现实中,时间序列TPLSM由三次活体的TPLSM程序上执行相同的鼠标(见下文;部分 2。8)。三个时间点的间隔(2小时,24小时,8周后接种)也由本研究之前初步实验。预防术后腹腔内感染的预防措施被在整个时间序列TPLSM的外科手术。

 2.6。TPLSM设置

TPLSM设置程序进行(如前所述)( 9]。实验用立式显微镜(BX61WI;奥林巴斯、东京、日本)和FV1000-2P激光扫描显微镜系统(Fluoview FV1000MPE,奥林巴斯,东京,日本)。升管采用特殊阶段启用单元异常广泛的工作距离。这允许stereotactically固定化,麻醉老鼠被放在显微镜下阶段。显微镜是装有高数值孔径镜头提供所需的工作距离 在活的有机体内工作和水浸光学。TPLSM模式的激励源美态Ti:蓝宝石激光(光谱物理、加州山景城),调优,锁模910海里。美态产生光脉冲宽度约100 fs(重复频率80 MHz)。激光达到通过显微镜目标样本,连接到一个正直的显微镜(BX61WI;奥林匹斯山,日本东京)。的意思是激光功率样本10至40兆瓦,根据图像的深度。显微镜物镜镜头用于本研究4 x UPlanSApo(数值孔径为0.16),10 x UPlanSApo(数值孔径为0.4),和60 x LUMPlanFI / IR(水浸,数值孔径为0.9,工作距离2毫米),分别。数据分析使用FV10-ASW(奥林巴斯、东京、日本)。TPLSM图像获得的 512年 × 512年 从210像素的空间分辨率 μ米的视野维度,使用像素居住时间4 μ年代。双光子荧光信号采集,由一个内部探测器(nondescanned检测方法)激发波长,使EGFP信号的同步采集和RFP (DsRed2)信号。事实上,的最佳激发波长1050 nm DsRed2报道【et al。 10),尽管激发波长910 nm EGFP的最佳对策。因此,很难激发DsRed2 910 nm充分。为了克服这个困难,我们选择和使用DsRed2的肿瘤细胞中表达水平是如此之高,以至于我们甚至可以清楚地识别DsRed2-labeled肿瘤细胞910海里激发。颜色绿色和红色图像成像的同时,随后合并生产单一的图像。

 2.7。使用间隔TPLSM成像结直肠肝转移

肝脏叶表面的最初筛选较低的放大的 X / Y飞机和调整 Z轴手动检测最优观测区域包含RFP-expressing癌细胞(至少五个领域)。每一个感兴趣的领域随后扫描在更高的放大(水浸客观60倍有或没有2 x变焦)通过手动设置 X / Y飞机和调整 Z轴(自动或手动)获得高分辨率,明确TPLSM图像。扫描区域 200年 × 200年 μ米(600 x)或 One hundred. × One hundred. μ米(600 x 2 x变焦),分别。成像深度和成像堆栈确定任意允许实时三维可视化结直肠肝转移 在活的有机体内。激光功率是根据成像深度调整。当成像在更大的深度,我们增加激光功率水平(100%)手动使用激光功率控制器。图像最优同步成像EGFP和RFP (DsRed2),检测灵敏度(由高压亮度)是手动调整EGFP(450 - 500)或RFP(550 - 600),分别。

 2.8。实验安排时间序列TPLSM

RFP-HT29细胞接种到GFP裸体小鼠的脾脏。8周观察结直肠肝转移形成的这个异基因的肿瘤模型(数据没有显示)。如图 2,第一轮活体的TPLSM进行观察结直肠肝转移的早期阶段(肿瘤细胞逮捕/粘附和tumor-cell-induced血小板聚集)在接种后2小时。第二轮活体的TPLSM也执行观察结直肠肝转移的早期阶段(由枯氏细胞和外渗的癌症细胞吞噬作用)在接种后24小时在同一个鼠标。建立肝转移在第三轮观察活体的TPLSM,接种后进行8周RFP-HT29细胞GFP裸体小鼠。关于这些时间点(2小时,24小时,8周后接种),我们也进行了初步的试验确定的最佳时间点。活体TPLSM图像四个或更多的时间点太不清楚观察结直肠肝转移,因为腹部纤维粘连。因此,所有老鼠成像在三个时间点。最后的实验接种)(8周后,整个肝脏是收获,进行组织病理学分析。

实验协议和活体TPLSM的时机。第一轮活体的TPLSM在接种后2小时。第二轮活体的TPLSM在接种后24小时在同一个鼠标,成像大肠癌肝转移的早期事件。第三轮活体的TPLSM 8周后接种在同一个鼠标,imaging-established肝转移和肿瘤血管生成。

 2.9。免疫组织化学分析,细胞角蛋白20

缺乏与其他细胞角蛋白免疫大意味着CK 20已成为一个重要工具描述转移人类起源的腺癌起源于一个未知的主要来源。小鼠肝脏和固定在4%甲醛在PBS (pH值7.4)24小时,处理,根据标准程序嵌入到石蜡。Formalin-fixed,石蜡包埋组织切片的厚度是3 μ米,和部分放在silane-coated幻灯片。deparaffinization和脱水后,部分是热压处理过的10分钟10毫米柠檬酸钠缓冲对抗原检索。他们在一夜之间被封锁和孵化主要抗体在4°C。主要抗体单克隆反人类细胞角蛋白20(克隆KBsB20.8;DakoCytomation、丹麦)使用的稀释1:50 streptavidin-biotin标记方法的实施(LASB2工具包/合,DakoCytomation)。细胞角蛋白20检测使用想象试剂(想象kit /合,DakoCytomation)。部分是用苏木精复染色。消极的控制与preimmune免疫球蛋白同时运行。

 3所示。结果 3.1。发展活体的TPLSM体内为<斜体> < /斜体>实时成像的结直肠肝转移

图 1显示了一个概述和示意图liver-lobe固定和活体的TPLSM设置。

关键步骤是:(1)最优纵向剖腹手术;(2)选择肝脏的左外侧叶固定使用一个organ-stabilizing系统;(3)肝脏固定使用一个焊接接头终端和瞬间胶剂;(4)调整探测器获得的同时既成像RFP-expressing细胞GFP小鼠的肝脏;(5)发布的肝脏叶焊料凸耳终端使用脱模剂和放置Seprafilm粘附屏障为间隔TPLSM腹部。

活体的成功率接近100%,区间TPLSM后可以实现实践时期。

 3.2。成像早期大肠癌肝转移的活体的TPLSM

活体的TPLSM成像可以表示成一个二维电影和延时也作为一个 z堆栈的三维电影从肝脏表面约100 - 200 μ米深度。成像深度的三维可视化 在活的有机体内实时确定转移事件和肿瘤血管生成任意的定位在一定程度上取决于肝脏叶使用organ-stabilizing系统或激光功率。

观察结直肠肝转移的早期事件在更高的分辨率和双重色彩,至少五个领域包含RFP-expressing癌细胞最初发现在较低的放大。每一个感兴趣的领域后来观察到更高的放大倍数。扫描区域 200年 × 200年 μ米或 One hundred. × One hundred. μm,分别。如果有必要,额外的五个领域观察通过手动设置 X / Y飞机,自动或手动调整 Z轴。

表 1表明大肠癌肝转移的早期事件的发生率使用这个模型。肿瘤细胞被捕的现象/粘附和tumor-cell-induced血小板聚集( 11, 12)经常被观察到在接种后2小时(图 3(b), 3(c))。枯氏细胞和外渗的癌症细胞吞噬作用的观察接种后24小时内(图 3(d), 3(e), 3(f)),但都是罕见的事件。

门户中早期大肠癌肝转移的事件路由模型。

早期的事件 RFP-HT29细胞GFP裸体小鼠
肿瘤细胞逮捕/粘附 * 20/20 (100%)#
Tumor-cell-induced血小板聚集 15/20 (75%)
从肝血窦外渗 1/20 (5%)
由枯氏细胞吞噬作用 2/20 (10%)

*老鼠的数量表示现象/小鼠接种表示细胞的数量。

#百分比。

成像的活体TPLSM大肠癌肝转移的早期事件。(一)正常肝。(b)逮捕肝肿瘤细胞的正弦信号(接种后2小时)。(c) Tumor-cell-induced血小板聚集(白色箭头,接种后2小时)。(d)吞噬作用的枯氏细胞接种后(24小时)。由枯氏细胞(e)吞噬作用在不同的深度。(f)外渗的肿瘤细胞接种后(24小时)(酒吧,50 μ米)。

 3.3。成像肝转移由活体TPLSM殖民和肿瘤血管生成

一个老鼠死于不明原因在24小时内接种。成功执行第二轮活体的TPLSM其余19 GFP裸体小鼠(19/19;100%)。两个老鼠死于结直肠肝转移,接种后8周,之前预定的第三轮活体的TPLSM。剩下的17个GFP裸体小鼠成功地捕捉到第三轮活体的TPLSM (17/17;100%)。

其中17 GFP裸小鼠,12例(70%)肝转移了本地化的增长模式在接种后8周。肝脏的左外侧叶可以使用我们的成像实验协议,和四个观察小鼠肝外转移区域。因此,只有8个(67%)的12个老鼠成功地捕捉到第三轮活体的TPLSM(表 2)。

肝转移的生成速率和观察活体的TPLSM。

RFP-HT29细胞GFP裸体小鼠
intrasplenic接种后肝脏转移 70%一个(12/17)b在8周
观察活体TPLSM的转移 67%c(8/12)d在8周

一个的百分比intrasplenic接种后肝脏转移。

b小鼠肝脏转移的数量/老鼠的数量、在指定的时间点。

c成功的比例由活体TPLSM转移细胞的观察。

d老鼠的数量是否成功转移细胞观察活体TPLSM /小鼠肝脏转移的数量。

几位转移性结节被RFP-HT29形成细胞大约8周后(图 4(一), 4(b), 4(c))。反人类细胞角蛋白20抗体被用于的构象RFP-HT29细胞异种的肝转移模型。RFP-HT29 micrometastatic殖民地(棕色色细胞)细胞免疫组织化学显示(图 4(d))。

肝脏转移性殖民的RFP-expressing HT29细胞。(一)宏观的发现。(b)活体的TPLSM形象(酒吧,300 μ米)。(c)微观hematoxylin-eosin染色(酒吧,500 μ20米)。(d)显微细胞角蛋白免疫染色(酒吧,500 μ米)。

每个结节肿瘤细胞组成的集群和扩张/曲折的肿瘤血管(数字 5, 6)。血小板聚合流经常被观察到肿瘤内血管,暗示hypercoagulable的存在状态在肿瘤微环境(数据没有显示)。

成像通过活体TPLSM肝转移和肿瘤血管生成。(a)肝脏转移性结节与扩张和曲折的肿瘤血管(×40,酒吧,750 μ米);(b)(×100酒吧,300 μ米)。

高分辨率光学成像通过活体TPLSM肝转移性结节。(一)肝脏转移性结节肿瘤细胞组成的集群和扩张/曲折的船只(50×600、酒吧 μ米)。(b)扩张而曲折的肿瘤血管的集群中观察几种肿瘤细胞。血小板聚合流经常被观察到在肿瘤血管(50×600、酒吧 μ米)。

 4所示。讨论和结论

我们已经建立了一个新的方法,使用活体TPLSM调查肿瘤转移和血管生成。使用我们的模型,实时结直肠肝转移可以成像的发展 在活的有机体内在双光学分辨率高、颜色(红色:癌细胞,绿色:宿主细胞)使用活体的TPLSM。还可以执行时间进程成像肝脏的转移和血管生成相同的使用时间序列TPLSM住老鼠,包括三次活体的TPLSM程序执行在不同的时间点在几天到几个月。

这些技术使我们观察包含可行的癌细胞转移性结节(红色)和肿瘤血管周围间质(绿色)在同一个老鼠生活在不同的时间点。

在这项研究中,红色的癌细胞中实时可视化才GFP小鼠肝脏结构 在活的有机体内。肿瘤细胞逮捕/粘附,tumor-cell-induced血小板聚集,肿瘤细胞外渗,由枯氏细胞吞噬作用可以使用延时和观察 z堆栈成像技术(数据没有显示)。肝脏转移性结节肿瘤细胞组成的集群和扩张/曲折的船只也可以观察到在同一个老鼠大约8周后。

先前的肿瘤血管生成的研究利用多光子显微镜成像肿瘤血管注射荧光对比剂( 6- - - - - - 8, 13, 14)和血液细胞包括白细胞、红细胞和血小板,或内皮细胞可能因此无法可视化。然而,血细胞,除了红细胞与内皮细胞,可以在更高的可视化光学分辨率和更高的放大使用我们TPSLM技术。血管内癌症细胞和内皮细胞之间的相互作用或血液细胞在肝转移的早期阶段,以及转移性肿瘤的生长和肿瘤血管生成在肝脏转移的晚期,因此都可以观察到在同一个活老鼠。

然而,这种方法也有一些局限性,需要克服。高放大意味着只有一条狭窄的野外观测可以查看,只代表总数的一小部分肿瘤体积。观察,可以用时间序列的频率TPLSM也是有限的。此外,肝脏的外化和发展之间形成纤维性粘连腹壁和肝脏表面可能会影响生活肝脏的生理条件。

Tumor-host交互发挥重要作用在肿瘤转移和血管生成( 1, 15),因此在人类癌症治疗目标 2, 16]。 在活的有机体内可视化的实时tumor-host相互作用在细胞或亚细胞水平与高空间分辨率,因此代表了一种有价值的手段,研究肿瘤血管生成在肿瘤临床前模型。

像TPLSM,二次谐波发生(宋惠乔)成像也是一个非线性显微镜技术直接可视化胶原蛋白组装。因此,宋惠乔显微镜也成为一个有趣的应用程序来研究肿瘤基质的相互作用通过成像基质胶原蛋白。在未来的研究中,我们需要使用宋惠乔成像以及TPLSM分析tumor-host交互包括肿瘤转移和血管生成。

高分辨率,既 在活的有机体内使用活体的实时可视化的肿瘤转移和血管生成和时序TLPSM有助于提高我们对时空的理解tumor-host交互转移过程中生活器官的动物。它也可能提供了一个理想的抗血管新生药物评价的方法,减少个人间变异的影响。

 确认

这项工作是支持由教育部、日本文化、体育、科学和技术(KAKENHI 22591484 k .田中,22591484 y .井上,和21390377 m . Kusunoki)。k .田中被武田科学基金支持。

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