JNT 纳米技术杂志》 1687 - 9511 1687 - 9503 Hindawi 10.1155 / 2019/7686597 7686597 研究文章 敌对的亚致死浓度的影响某些金属氧化物纳米粒子的混合物和散装(Al2O3措,SiO2)鳃的组织学 claria gariepinus http://orcid.org/0000 - 0003 - 4588 - 7066 Nnamdi Amaeze亨利 布里格斯 Tam-Miette Dawarri Togunde Oluwaseun Olusola http://orcid.org/0000 - 0002 - 2611 - 5418 Obanya 亨利Ebele 雷 Paresh钱德拉 生态毒理学单位 生态学系 拉各斯大学 拉各斯 尼日利亚 unilag.edu.ng 2019年 12 6 2019年 2019年 28 11 2018年 06 02 2019年 20. 05年 2019年 12 6 2019年 2019年 版权©2019 Amaeze亨利Nnamdi et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。在水生环境中纳米颗粒(NPs)的影响研究甚少。 目的。本研究评估这些不同的金属纳米粒子的联合毒性效应及其混合物(Al2O3措,SiO2用组织学生物标志物)鱼。 材料和方法。大部分和纳米大小的三个盐(Al2O3措,SiO2)使用。纳米尺度范围从25到100 nm。少年的鱼 claria gariepinus(平均长度:12.3±3.5厘米;平均重量:18.52±6.41 g)被用于急性和慢性毒性测试。他们暴露于7毫克/ L的批量和纳米大小的三个金属氧化物单独或混合了28天。亚致死浓度的基础是96小时的急性毒性大小变化的三个金属氧化物是无毒的浓度100 mg / L与死亡率没有明显的暴露浓度最高。组织病理学的腮收集。 结果。这三种金属氧化物纳米颗粒SiO是最有毒的,组织病理学改变指数(HAI)为20.0,其次是nano-CuO(海,10.0)和nano-Al2O3(海,2.0)。在单一曝光,吉尔改变包括高频侵蚀的鳃瓣(EGL),肥大(HPT)、水肿(OD)和坏死(N)更少的损害是观察到的金属氧化物纳米粒子的组合SiO +2O3,SiO +错和SiO +2O3+措相等(1:1-HAI, 2和6;1:1:1-HAI, 6)和不平等的比率(1:2-HAI, 16 - 6;2:1-HAI, 8和6)。同样的,所有大部分组合也对抗除了有相同的体积比措(海,20)和体积2O3(10)海,海的累加效应32。 结论。纳米铝的联合行动2O3和措SiO产生低毒性作用,与单一的高毒性试验;这也表明,纳米2O3和措是对手。同样,在大多数金属氧化物(SiO,艾尔2O3和错),措是最有害的。大部分SiO和艾尔2O3对抗措的影响在鱼鳃。有需要适当的文档的生态影响在水生环境中纳米颗粒。

 1。介绍

纳米技术产业的快速发展在过去的20年里还没有达到其潜力( 1]。这是由于材料在纳米尺度上具有不同寻常的特性;然而,这也是这些属性在一定程度上加剧担心其潜在毒性和生态毒理学。NPs的工程材料的应用可以提高浓度地下水,土壤和地表水的礼物最重要的接触途径,途径,命运来评估环境风险( 2]。

纳米二氧化硅等多个应用程序在制备纳米复合材料增强热阻和电气和机械性能。同时,各领域使用的催化剂,色素稳定,电子和传感器。Nano-aluminium氧化物用作原料固体火箭推进剂配方和炸药。Nano-copper二氧化物用于生物医学应用抗菌素和电浆等材料作为改革的一个组成部分的催化剂。

研究与使用NPs是有限的( 3]。小型化的材料感兴趣的是因为他们的物理化学性质的差异相比,大部分材料。这些属性包括颜色、溶解度、电导率和工程纳米材料的催化活性 4]。除了他们的表面积与体积比的增加,纳米颗粒可以作为污染物吸附剂。

纳米毒理学的概念解释的毒理学基础NPs在健康和环境 5]。几项研究已经报道的有害影响NPs生物群及其散装盐,但其他污染物和组分混合物在环境尚未充分研究。NPs的水生生态系统的污染一直是全球关注的 6]。这些污染物包括纳米颗粒可能会增加金属的水平自然水和严重影响湿地栖息地( 7]。据报道,95年hr LC10各种纳米粒子对鱼从100年不等 μgL−11 mg·L−1,而95年hr LC50NPs到达mg / L的范围( 8]。预计NPs在表层水的浓度范围 μgL−1低mg·L−1( 8, 9]。

使用鱼的组织病理学改变指数作为一种工具的分类和分类阶段的组织变化相对于压力或接触化学物质已经被几位来自和科学家报道 10- - - - - - 13]。这是用来评估污染物的影响鱼的健康环境,并帮助建立一个因果关系暴露于有毒物质和各种生物反应( 10]。使用鱼疾病的发病率和患病率与污染物指标的环境压力提供了一个明确的生物端点接触的历史( 10, 13, 14]。

鱼鳃是对环境变化非常敏感,很容易受到污染物在低浓度( 15]。鳃具有大的表面积和执行各种重要功能,如呼吸、渗透调节和排泄。因为他们是外部结构与外部环境直接接触,他们敏感的化学和物理变化的水生环境 16]。鳃是气体交换的主要网站和其他重要的功能,如离子和渗透调节除了酸碱平衡;组织病理学变化,这些器官的结构包括呼吸干扰和电解质失衡 16]。

Mansouri et al。 15]报道最常见的组织病理学等鲤鱼鳃的异常增生、水肿、曲率、融合、动脉瘤、坏死10和20天后TiO的风险敞口2NPs (10.0 mg·L−1)和措NPs(2.5和5.0 mg·L−1)单独和混合。混合效应和协同作用的报道。本研究类似的 17],暴露 Carassius auratus(金鱼)混合物的悬浮液20 nm大小2O3和50纳米氧化锌。明显的形态学改变,如增生(融合的薄片)据报道在鳃。结合交互中的混合物可能是敌对的,合作的,或添加剂根据特定的属性和类型的氧化物NPs如大小和表面面积( 17]。然而,有限的研究对纳米颗粒的联合效应及其大部分金属盐在鱼用组织学生物标志物。

本研究的目的是评估不同重金属的联合毒性效应的混合物(Al2O3措,SiO2用组织学生物标志物)鱼。

 2。材料和方法 2.1。实验化学和准备的测试解决方案

大部分和纳米大小的三个盐(Al2O3措,SiO2从西格玛奥德里奇)采购。之前他们在室温下存储在实验室使用。Nano-Al2O3出现的灰色粉末,密度2.70克/厘米3和大小40 nm的纯度为99.9%。Nano-CuO红色黄色粉末,密度为8.94 g / ml 25°C < 50 nm大小。SiO2褐黄色粉末,密度为2.33 g / ml 25°C < 100纳米大小。

股票悬浮液的裸粉是用自来水dechlorinated获得各种浓度的测试解决方案。各自克金属氧化物的溶解在1 L dechlorinated自来水获得适当的混合物来获取股票的解决方案(图 1)。文献检索是用于获得测试浓度。准备的测试化合物的浓度的单一解决方案和混合1:1,1:2,2:1,1:1:1对散装和纳米氧化物。

(a)组织切片的鳃鱼的对照实验显示主鳃瓣(PGL),冲二次鳃瓣(SSGL)和血管(BV)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的鳃鱼暴露于纳米SiO显示总破坏主鳃瓣(PGL)和二级吉尔薄片(西格里碳素集团),侵蚀上皮(之前),和地区严重的坏死(N)和水肿(OD)(圆)污渍,×100)。

 2.2。实验生物:收集和适应环境

非洲非洲鲶鱼,鲶鱼/尖牙 claria gariepinus用于这项研究。这是选择的基础上,轻松的文化和从现有文献对污染物的反应。鱼在Akoka采购从养鱼场,拉各斯,和运输在开放鼓生态学系,在生物实验室附件花园。鱼被运送到大型控股坦克(100 L容量)的实验室一半满dechlorinated自来水离开24小时开放。少年鱼类(平均长度:12.3±3.5厘米;平均重量:18.52±6.41 g)是用于亚致死的/慢性毒性测试。只有同一批次的鲶鱼被用于实验。

鱼类适应在实验室中使用100升容量控股坦克每升20鱼类的放养密度为每窝小鱼和5鱼类幼体。生物测定的驯化持续了7天之后开始。适应环境是标准的实验室条件下进行(temp, 26.0±3.0°C;湿度、75±6%;光周期,光明,黑暗,12:12小时)。生物测定媒体(dechlorinated自来水)也是合适的质量(pH值:6.8;D。O,8。5 mg/L; Salinity, 0.0 ppt).

 2.3。实验室生物测定 2.3.1。急性毒性试验

急性毒性测试/测距进行锻炼与不同浓度以达到超过96小时死亡。生物测定容器的塑料(6米×4厘米×4厘米)。在急性毒性试验,小鱼被储存在10鱼每公升的水,由等效原液的浓度和纳米重金属单独行动。每个设置复制,即。,20.fingerlings per concentrations.

鱼被暴露于浓度1 mg / L, 10 mg / L, 100 mg / L, 1000 mg / L, 3000 mg / L的要求基于响应测试的生物。nano的96小时的急性毒性和大部分金属被发现无毒100 mg / L的浓度,并没有发现显著的死亡率最高的暴露浓度。

 2.3.2。慢性毒性试验

少年鲶鱼被慢性毒性测试中他们暴露于7毫克/ L的批量和纳米大小的三个金属氧化物单独或混合了28天。慢性毒性试验进行了在较大的塑料(11厘米×9厘米×7.5厘米)使用5 L的水,因为大尺寸的鱼相比,急性毒性测试。结束时的曝光时间,通过腰椎穿刺鱼类的固定化和解剖组织病理学调查收集鳃和保存。

 2.3.3。组织病理学检查

鳃在10%福尔马林固定,脱水乙醇分级( 18在二甲苯),清除,嵌入在石蜡,分段5 μ米旋转切片机。幻灯片是用苏木精和伊红染色技术,光学显微镜( 18]。根据[组织病理学变化进行评估 18]和[ 10),包括计算每个鱼的组织病理学改变指数(HAI)使用以下公式: (1) 海 = 1 ∑ 我 + ∑ 二世 + ∑ 三世 。

因为I, II, III对应阶段的数量变化,平均海六点量表上得分:0 =正常组织;2.0 =轻度损伤组织;4.0 =中度破坏组织;6.0 =部分严重的组织损伤;8.0 =严重的组织损伤;10 =不可挽回的损伤组织。这些阶段的变化和评分系统或规模给出了表 1。

阶段的变化和鳃的组织学改变。

改变评分 分数描述 组织学改变
0 正常组织 没有损伤或任何变更(NT)
2。0 轻微的损伤 轻度增厚鳃瓣(GL1)上皮增生(嗯)肥大(HPT)
4.0 中度破坏 中鳃瓣增厚(GL2)水肿(OD)
6.0 部分严重损害 侵蚀外盖(ERO)上皮起重(EPL)次要的部分融合薄板(FSGL1)侵蚀的鳃瓣(EGL)缩短二级薄板(SSGL)阻碍鳃瓣(单独的)钝二级薄板(BSGL)不受控制的上皮细胞的增殖(压电陶瓷)
8.0 严重的破坏 严重的鳃瓣增厚(GL3)完整的二级融合薄板(FSGL1)动脉瘤(ANS)
10.0 不可挽回的伤害 坏死(N)总损伤薄板(TDL)
3所示。结果与讨论 3.1。组织病理学的影响和联合行动的单一和组合风险敞口的<斜体> claria gariepinus < /斜体> Nanometallic 28天亚致死浓度的盐

NPs与其他污染物之间的相互作用依赖于NPs的属性如大小、组成、形态、孔隙度、聚合/解集,和总体结构。NPs的毁灭性影响,大部分主要是由于分散,持久性和生物富集和生物放大潜力除了毒性的生物组织( 19]。

鱼鳃是主要的靶器官受到NPs的影响。Jayaseelan等人,Griffitt et al。 20., 21)报告等生理变化在渗透调节功能障碍,呼吸气体交换、体液渗透平衡。由于上皮的大表面积/体积比,污染物的器官更容易受到影响 22]。组织学和生化分析以往的研究揭示了鳃的主要靶器官( 10, 11, 21]。生理变化可能成为可见的组织学改变,揭示了Griffitt et al。 21)报道,NPs产生鳃上皮肥大细胞( 21]。

在这项研究中,最在鱼鳃组织病理学病变如增生、水肿,曲率,缩短和鳃片晶的融合,动脉瘤,坏死和量化使用索引,用于描述一些研究[ 10- - - - - - 13]。表 2和 4- - - - - - 7和数字 1- - - - - - 12显示单一的组织病理学影响和联合行动和联合曝光 claria gariepinusnanometallic 28天亚致死浓度的盐。单一接触nano-SiO, nano-Al2O328天后,nano-CuO产生不同的影响。Nano-SiO是最有毒,组织病理学改变指数(HAI)为20.0,其次是nano-CuO(海,10.0)和nano-Al2O3(海,2.0)。吉尔吉尔改变包括高频率流失的薄板(EGL),肥大(HPT)、水肿(OD)和坏死(N)。

28天单一和联合曝光的 claria gariepinus纳米尺度的金属。

浓缩的。比 Nanometals 认为海 有毒的水平 实际的海 有毒的水平 类型的联合效应 吉尔病理学
单独 SiO艾尔2O3 措 20.02。010.0 高低温和的 NANANA NANANA NANANA EGL,肥大水肿坏死
1:1 SiO +基地2O3 SiO +措 22.030.0 高高 2。06.0 低低 敌对的敌对的 肥大,SSGL
2:1 SiO +基地2O3 SiO +措 22.030.0 高高 8.06.0 低低 敌对的敌对的 呃,SSGL
1:2 SiO +基地2O3 SiO +措 22.030.0 高高 16.06.0 温和的低 敌对的敌对的 压电陶瓷,EPL,坏死
1:1:1 SiO +基地2O3+措 30或22 高 6.0 低 敌对的 EGL, SSGL

有毒水平:海: X< 10,低;10≥ X< 20,温和; X≥20日高。

(一)组织切片散装SiO吉尔暴露。中等鳃瓣畸形如水肿(OD),肥大(HPT)和上皮增生观察(HPS)。主鳃瓣也观察到(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔暴露于散装措。两中小学完全毁灭的薄板。领域的侵蚀上皮(之前),动脉瘤(ANS),坏死(N),血管(BV)也观察到(圆)污渍,×100)。

(一)组织切片基本吉尔吉尔暴露nano-CuO显示水肿薄板(OD),上皮增生(HPS),侵蚀上皮(之前),血管(BV)(圆)污渍,×100)。(b)组织切片的吉尔接触散装2O3显示主鳃瓣(PGL),缩短二级鳃瓣(SSGL),肥大(HPT),和一些轻微的坏死区域(N)(圆)污渍,×400)。

(一)组织切片nano-Al吉尔暴露2O3显示主鳃瓣(PGL),弯曲的二级鳃瓣(CSGL),上皮增生(HPS),上皮起重(EPL)和血管(BV)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔接触散装SiO /措(1:1)显示二级鳃瓣(西格里碳素集团),肥大(HPT)和上皮起重(EPL)(圆)污渍,×400)。

(a)组织切片的吉尔暴露nano-SiO /措(1:1)显示主鳃瓣(PGL)缩短辅助鳃瓣(SSGL),血管,基本层水肿,侵蚀上皮(圆)污渍,×100)。(b)组织切片的吉尔暴露nano-SiO /2O3(1:1)显示主鳃瓣(PGL),侵蚀二级鳃瓣(ESGL)和肥大(HPT)(圆)污渍,×100)。

(一)组织切片吉尔暴露于散装SiO / Al2O3(1:1)显示主鳃瓣(PGL),侵蚀二级鳃瓣(ESGL)和肥大(HPT)。缩短第二鳃瓣(SSGL)和坏死面积(N)也观察到(圆)污渍,×100)。(b)组织切片的吉尔接触散装2O3/措(1:1)显示主鳃瓣(PGL),总破坏二级鳃瓣,水肿(OD)动脉瘤(ANS)和坏死(N)(圆)污渍,×100)。

(一)组织切片吉尔暴露于nano-SiO / Al2O3(2:1)显示二级鳃瓣(西格里碳素集团),血管,上皮增生(HPS)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔接触散装SiO /2O3(2:1)显示主鳃瓣,缩短第二鳃瓣(SSGL)和血管(BV)(圆)污渍,×400)。

(a)组织切片的吉尔暴露nano-SiO /措(2:1)显示融合二级鳃瓣(FSGL),二级鳃瓣(西格里碳素集团)和上皮增生(HPS)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔接触散装SiO /措(2:1)显示肥大(HPT),血管(BV)、上皮增生(HPS)(圆)污渍,×400)。

(一)组织切片吉尔暴露于散装2O3/措(2:1)显示水肿(OD)和上皮增生(HPS)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔接触散装2O3/措(1:2)显示主鳃瓣(PGL),上皮起重(EPL)和肥大(HPT)(圆)污渍,×400)。

(一)组织切片nano-Al吉尔暴露2O3/措(1:2)显示主鳃瓣(PGL),弯曲的二级鳃瓣(CSGL)和缩短辅助鳃瓣(SSGL)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔暴露nano-SiO /措(1:2)显示二级鳃瓣(西格里碳素集团),薄板(正),炎症和血管(圆)污渍,×400)。

(a)组织切片的吉尔接触散装SiO /措(1:2)显示上皮增生(HPS),坏死(N),肥大(HPT)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔接触散装SiO /2O3(1:2)显示轻度坏死(N)和二级鳃瓣(单独的)。没有观察到严重损害(圆)污渍,×400)。

(一)组织切片吉尔暴露于nano-SiO / Al2O3(1:2)显示曲线二次鳃瓣(CSGL),上皮起重(EPL)和肥大(HPT)(圆)污渍,×400)。(b)组织切片的吉尔暴露nano-SiO /2O3/错显示总吉尔建筑的破坏。可见血管(圆)污渍,×400)。

组织病理学改变指数(HAI)表明,鳃受到这些金属氧化物纳米粒子的影响,和类似的损失已报告在其他鱼类接触铜NPs ( 22, 23),TiO2NPs ( 24),和其他NPs如氧化钴(III)(有限公司2O3)纳米颗粒 24)和胶态微粒银纳米颗粒( 25]。

如果联合曝光的效果与另一个nanometallic nano-SiO盐的比率(1:1)的个体效应,那么SiO +的海2O3和SiO +错应该是22.0和30.0,分别。SiO +的实际影响2O3和SiO +措海:分别为2.0和6.0。肥大的吉尔改变包括低频(HPT)和缩短二级鳃瓣(SSGL)。这意味着联合行动2O3和措SiO产生低毒性作用,与单一的高毒性试验;这也表明,艾尔2O3和措是对手。

增加浓度的SiO混合物(SiO +2O3和SiO +措)比2比1没有区别的毒性水平。SiO +的实际影响2O3和SiO +措海:分别为8.0和6.0。吉尔改变包括低频鳃上皮增生(EH)和缩短二级鳃瓣(SSGL)。

增加的浓度2O3和错的混合物(SiO +2O3和SiO +措)比1到2仍然没有改变有毒水平措海为6.0、但有中等毒性2O3海为16.0。吉尔改变包括中等频率的上皮细胞不受控制的增殖(压电陶瓷),鳃上皮起重(EPL)和坏死(N)。

三个nanometallic盐的混合物(SiO,艾尔2O3,措)比1:1:1生产低毒性作用(海,6.0)相比,除了个人的影响,认为是海:30或22。鳃上皮起重(EPL)频率较低,缩短二级鳃瓣(SSGL)。

 3.2。组织病理学的影响和联合行动的单一和组合风险敞口的<斜体> claria gariepinus < /斜体> 28天亚致死浓度的大部分金属盐

表 3和 4- - - - - - 7和数字 1- - - - - - 12显示单一的组织病理学影响和联合行动和联合曝光 claria gariepinus28天亚致死浓度的大量金属盐。单一的接触散装SiO,散装2O3,大部分措28天后产生不同的影响。大部分措是最有毒的、组织病理学改变指数(HAI)为20.0,其次是散装2O3(海,10.0)和体积SiO(海,6.0)。吉尔吉尔改变包括高频率流失的薄板(EGL),肥大(HPT)、水肿(OD),阻碍鳃瓣(西格里碳素集团)动脉瘤(ANS)和坏死(N)。

28天单一和联合曝光的 claria gariepinus批量大小的金属。

浓缩的。比 大部分金属 认为海 有毒的水平 实际的海 有毒的水平 类型的联合效应 病理学
单独 措SiO艾尔2O3 20.06.010.0 高低温和的 NANANA NANANA NANANA 肥大,EGL,开发部,西格里碳素集团,ANS,坏死
1:1 措+ SiO措+基地2O3 26.030.0 高高 14.032.0 温和的高 敌对的添加剂 肥大,EGL, OD EPL, ANS, N, TDL
2:1 措+ SiO措+基地2O3 26.030.0 高高 6.06.0 低低 敌对的敌对的 呃,坏死肥大
1:2 措+ SiO措+基地2O3 26.030.0 高高 14.08.0 温和的低 敌对的敌对的 呃,水肿
1:1:1 措+ SiO +基地2O3 30或26 高 12.0 低 敌对的 EGL, SSGL

有毒水平:海: X< 10,低;10≥ X< 20,温和; X≥20日高。

鱼的主要变化在急性和慢性接触NPs及其大部分是层状上皮细胞的形态学变化。二次薄板的上皮细胞层变得与表面积减少水肿,导致窒息。这种变化也可能表明急性炎症由于上皮钠泵的失败 26]。上皮水肿和融合影响污染物的毒性动力学和分销鳃上皮细胞( 27]。

此外,层状上皮的结构变化引起气体的体积变化、离子交换( 28, 29日]。类似的Ostaszewska等人的研究和Johari et al。 30.- - - - - - 32]报道这些组织学变化如杯状细胞肿胀、绒毛变形、增生、炎症、坏死,液泡中肠组织。

如果联合曝光的影响大部分措与另一大部分金属盐的比率(1:1)的个体效应,那么措+ SiO和措+的海2O3应该是26.0和30.0,分别。措的实际影响+ SiO和措+2O3海:分别为14.0和32.0。措+ SiO的吉尔改变包括中等频率的肥大(HPT),侵蚀鳃瓣(EGL)和鳃上皮起重(EPL)。措的吉尔改变+2O3包括中等频率的水肿(OD)动脉瘤(ANS),总伤害吉尔薄板(TDL),坏死(N)。这意味着SiO和艾尔的联合行动2O3措了低毒性作用,与单一的高毒性试验;这也表明,大部分SiO和体积2O3是对手。

增加浓度的混合物(措措+ SiO措+基地2O3)比2比1没有区别的毒性水平。措的实际影响+ SiO和措+2O3海:分别为6.0和6.0。吉尔的改变包括低频鳃上皮增生(呃),肥大,坏死(N)。

增加SiO的浓度和艾尔2O3混合物(措+ SiO措+基地2O3)比1到2的毒性水平没有区别2O3。措+的实际影响2O3海:8.0。有中等毒性SiO海为14.0。吉尔的改变包括中等频率的上皮增生(EH)和水肿(OD)。

混合物的三个批量金属盐(SiO,艾尔2O3,措)比1:1:1生产低毒性作用(海,12.0)相比,除了个人的影响,认为是海:26 - 30。鳃上皮起重(EPL)频率较低,缩短二级鳃瓣(SSGL)。

动脉瘤是一种常见的变更。这是吉尔肿胀的血管组织,这可能扰乱血流量( 32, 33]。鱼的鳃的组织学反应主要是由于循环障碍,动脉瘤、后退和渐进的变化,和增生( 34, 35]。

 4所示。结论

的共同行动2O3和措SiO产生低毒性作用,与单一的高毒性试验;这也表明,艾尔2O3和措是对手。同样,在大多数金属氧化物(SiO,艾尔2O3和错),措是最有害的。SiO和艾尔的联合行动2O3措了低毒性作用,与高毒性的单一曝光。大部分SiO和体积2O3对抗措的影响在鱼鳃。需要适当的文档的生态影响在水生环境中纳米颗粒。

 数据可用性

所有数据已经提供的手稿。任何进一步的数据,可能需要相应的作者联系。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 补充材料

表4 - 7列表数据用于计算和估算结果总结在表 2和 3。

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