富含鸟嘌呤核酸聚合物有可能形成一个四股结构称为鸟嘌呤四重的(G4)。当四个鸟嘌呤排列在一个平面之间的氢键稳定的沃森克里克和Hoogsteen面临相邻鸟嘌呤。这些鸟嘌呤四联球菌广泛的表面积与其他四联球菌介子基地堆积,有助于G4的热力学稳定结构。所有鸟嘌呤G4s分享这鸟嘌呤的堆叠四联球菌的核心特性,可能导致共同特征识别G4s的蛋白质。G4的形成取决于单价阳离子的存在,减轻负静电电荷斥力O6的鸟嘌呤集中在四分体的中心。定位的单价阳离子(通常钠或钾)中心的四国集团,两个堆叠四联球菌,缓解负静电势的排斥效应( 1, 2]。

G4s可以大大不同的拓扑结构基础上的相对取向鸟嘌呤磷酸二酯骨干连接运行。如果所有的线是平行的5′和3′方向核糖的糖,鸟嘌呤的运行必须连接之间的循环部分从上到下被称为G4的螺旋桨取向(图 1(一))。糖苷键角并行G4s通常都在 反式构象,使这种RNA G4s的首选链取向,因为它更好地适应2′羟基。同样,锁核酸(放大器),使用2′- o, 4′- c迫使C3′-亚甲基联系 endo糖皱纹也强烈支持 反糖苷键构象所平行G4s [ 3]。出于这个原因,采用多次利用当迫使平行G4拓扑。反平行的链的循环称为侧相反如果连接相邻链和对角线连接链;这些创造的混合物 syn和 反糖苷键角和观察到的结构通常在DNA G4s [ 4)(图 1 (b))。

就像其他核酸二级结构,独特的沟槽产生的糖磷酸骨架可观测到的空间填充G4的模型结构(图 1 (c))。这些沟槽表面以及大型四联球菌的两端G4和循环本身代表了三个可行的互动网站对蛋白质绑定合作伙伴。在反平行的横向和斜循环G4离开凹槽可访问,但限制访问四分体的脸。螺旋推进器的循环的并行G4通过直接在沟槽,使分子内相互作用的循环与凹槽基地,从而模糊了凹槽但离开四分体面临更多的蛋白质和配体接触绑定(图 1)。在无数的小分子G4-binding配体,合成配体结合槽可以找到一个例子,循环序列,和四分体G4s的面孔。在某些情况下,绑定这些配体的稳定,破坏,甚至改变构象的四国集团( 5- - - - - - 7]。它不会被不合理的假设随着protein-G4交互的我们的知识增加我们将蛋白质的例子做同样的事情。

人类基因组生物信息学的分析确定了一些~ 350000独特的,假定的,G4形成网站(pq) [ 8)和高通量测序方法已经确定了450000 ( 9]。有趣的是,似乎有一个进化压力对pq蛋白质编码区域和其他pq的浓缩非编码区域相比,生成伪随机DNA序列。pq的浓缩非编码区域支持G4s可能关键监管元素。此外,有一个统计浓缩pq的致癌基因启动子区域,其中一些已确认存在体内通过G4具体交联研究[ 10[]和其他生化调查 11- - - - - - 14]。同时也成为明确的在过去的十年中,G4s发挥重要作用在维持端粒长度 15- - - - - - 17和核糖体生物起源 18),听话的~ 80%癌症的 19]。此外,鸟嘌呤富裕地区的扩张重复信使rna与两种常见形式的神经紊乱,脆性X智力缺陷( 20.],家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS) ( 21]。

存在一些争议,G4能否形成 在活的有机体内虽然重要的努力已经对实验测试这个问题,观察核酸的结构 在活的有机体内是一个巨大的任务,很容易偏置依赖于方法用于确定结构。一个方法,用于可视化独特的图案在细胞免疫荧光。Balasubramanian集团开发了选择性目标两个DNA抗体( 22, 23]和RNA G4 [ 24),成功地用于可视化这些结构 在活的有机体内。此外,一个可能的原因,quadruplex-specific小分子的生理效应细胞的证据四重的形成 体内。在这些情况下,参数可以使抗体或小分子仅仅是诱导G4的形成,结构不存在没有这些探针或的特异性抗体/药物改变了在细胞环境中,他们不再绑定到G4但施加一个通过与其他结构的交互作用。使用高通量测序和最近的一项研究 在活的有机体内化学修改表明,RNA G4s在某些哺乳动物细胞系(在全球范围内展开 25]。类似的批评可以,核酸的化学物质添加修改可能会改变他们的结构 在活的有机体内或化学试剂的浓度增加会导致非特异性影响。不管能够证明G4s的存在 体内,许多蛋白质高度保守的G4特定绑定域名,可能没有保存在真核生物,如果他们没有生物功能。调查这一目的的一个方法是通过破坏protein-G4交互。

针对G4-protein与小分子的相互作用有可能治疗多种疾病的药物( 17, 26, 27]。目前就是这样一种化合物在临床试验中对癌症治疗,也就是说,cx - 3543或Quarfloxin。虽然最初选择的交互MYC G4, cx - 3543可以本地化细胞核仁转录抑制波尔我通过阻断nucleolin之间的交互和G4s rDNA [ 18]。作为目标的小分子疗法,G4s自己曾作为治疗目标特定的蛋白质。这样的一个例子是凝血酶结合DNA寡核苷酸适配子thrombin-induced抑制血小板聚集和clot-bound凝血酶;这些有潜力用作抗凝剂在各种手术,目前在临床试验中 28]。尽管凝血酶不是天生G4-binding蛋白质、G4寡核苷酸适配子显示非凡的亲和力和特异性的区域通常与其他蛋白质的凝血酶。

为了更好地理解G4-mediated细胞过程的机制,以及小分子干扰他们,必须了解蛋白质识别内源性G4约束力的合作伙伴。虽然许多G4-binding蛋白质已确定和验证( 29日),他们明确认识G4s的信息相对较少。典型的研究这个方法包括改变的一些特性G4底物或蛋白质,随后评估这些突变影响的交互,从这个他们的角色在G4识别和推断。该方法相对简单和廉价的执行和能产生有用的信息;然而它并不总是简单展示了这种突变是直接协调互动,而不是间接影响变异的物种的相互作用通过改变构象。小角x射线散射是一个技术为基础的解决方案,可用于确定低分辨率模型的蛋白质和核酸。虽然没有提供足够的分辨率来区分单个原子,它可以提供洞察物种的形状和方向在核酸蛋白质复杂的,可以补充其他突变分析得到的数据和/或其他高分辨率结构如NMR和x射线结晶学方法。目前有超过250的高分辨率核磁共振和x射线结构G4s沉积在研究合作实验室结构生物信息学(RCSB)网站和核酸数据库(NDB),相对很少有高分辨率的蛋白质结构与G4交互解决。最广泛研究之间的互动是G4包含DNA寡核苷酸适配子与凝血酶,而大量的结构已经沉积(PDB: 1 hap、1, 3 qlp 4 dii 4 dih 5 cmx 4 i7y 4 lz1 4 lz4 5 luw中,5 luy ew1 5和5 ew2)。最近从朊蛋白肽的结构受RNA G4适体已经得到解决(2 rsk 2 ru7)。目前,据我们所知,只有3高分辨率结构解决了显示G4-peptide交互涉及蛋白质相互作用G4作为正常细胞功能的一部分(2 la5 5 de5, 2 n21)。 Herein we will discuss the insights gained from these structures as well as some key mutational analysis studies and look at the benefits, as well as drawbacks, of these approaches.

凝血酶的发展结合DNA寡核苷酸适配子的抗凝性能一直持续自1990年代初;尽管凝血酶不是自然G4-binding蛋白质,15-base DNA G4(稍后通知),通过SELEX发达,能紧密结合凝血酶和抑制纤维蛋白凝块的形成 31日, 32]。这核酸序列形成一个反平行的G4和两个鸟嘌呤四联球菌连接三个横向循环:一个面对G4由两个TT循环和另一个由TTA循环。最初的高分辨率结构稍后通知(1 hap 1郝)表明,纤维蛋白原结合位点的凝血酶(exosite I)可能与公司的循环互动;然而,由于缺乏电子密度循环地区目前尚不清楚这种交互是TT循环或TTA循环( 33]。15年后3结构(3 qlp 4 dii, 4 dih)生产的实验室Filomena西卡,明确显示了TT循环作为螯结合凸区域的两侧exosite我利用多个极性和疏水接触 34, 35]。

适体的许多变体进行了稳定性的增强,亲和力,抑制凝血酶。这样一个强有力的第二代凝血酶适体是HD22-27mer [ 36(4)的高分辨率x射线结构iy7) aptamer-thrombin复杂的解决( 37)(图 2(一个))。HD22-27mer形式混合duplex-G4结构双直接束缚G4的地方。HD22-27mer形成一个不同寻常的pseudo-G4拓扑有四个循环,第一个循环连接两个相同的四个鸟嘌呤和剩余的循环形成一个更典型的横向反平行的循环模式。2日和4日的循环相互作用通过沃森克里克t氢键和帽G4的一边,而intratetrad循环和第三循环也形成一个t氢键和帽G4的对面。与凝血酶的结构和稍后通知,蛋白质识别HD22-27mer包括扩展的双链区以及突出胸腺嘧啶和pseudo-G4核心似乎涉及exosite二世而不是exosite。G20是之前的最后一个鸟嘌呤与精氨酸双地区和形式三极接触93年通过核糖两个羟基和一个磷酸基。循环2和4的G4有助于稳定的复杂与凝血酶形成多个疏水相互作用,但与稍后通知,只有胸腺嘧啶9有多个极接触exosite II。

最近31-nucleotide第三代凝血酶适体,RE31结晶在复杂与凝血酶( 38)(图 2 (b))。像HD22-27mer RE31扩展双地区以及two-tetrad G4。与HD22-27mer RE31展品的双地区连续基础上叠加G4,而和双区域似乎并不重要的凝血酶。尽管G4-duplex结的存在,绑定的RE31凝血酶比HD22-27mer更类似于稍后通知;两个分子使用TT的循环与exosite我通过氢键和疏水相互作用。

尽管这些持久性two-tetrad G4的凝血酶绑定寡核苷酸适配子,与G4的交互的核心没有观察到任何结构。相反,交互的主要网站,这是常见的所有上述结构之间,是用第二和第四G4的循环。而稍后通知和RE31使用主要是极地接触和一些辅助疏水相互作用与exosite我的凝血酶,HD22-27mer G4循环的使用主要是疏水相互作用来绑定exosite II。这种常见的绑定机制不同站点的凝血酶表明G4作为支架,介绍了单链循环对蛋白质绑定的口袋里。

图案富含精氨酸和甘氨酸已经知道在许多生理过程发挥功能作用,通常涉及核酸相互作用,几十年来( 39]。甘氨酸是氨基酸侧链的最灵活的访问二面角角度;因此序列富含甘氨酸可以尝试各种各样的构象使他们很滥交的约束力的合作伙伴。精氨酸是一种带正电的离域π电子的氨基酸。这允许良好的静电相互作用与核酸的磷酸骨架,以及潜在基地与含氮碱基堆积和氢键多达三个不同方向的通过其胍盐一半。许多目前已知G4-binding蛋白质RGG / RG主题( 29日, 39),其中一些已被证明是至关重要的G4绑定和认可,包括翻译肉瘤/融合在肉瘤(TLS /付) 40),nucleolin (NCL) [ 41),尤文氏肉瘤蛋白质(EWS) [ 421 EBNA1 [], eb病毒核抗原 43],DDX21 [ 44],脆性X智力缺陷蛋白(FMRP) [ 45]。

以来最明显的结构性的特点就是G4是四分体的脸,有人可能认为RGG图案为基础的精氨酸叠加与终端的交互鸟嘌呤四联球菌。然而,只有间接证据,四分体面临在RGG介导交互过程中发挥作用。许多小分子G4-binding配体已经被证明紧密互动通过介子堆积相互作用与四分体的脸和两个这样的分子,BRACO-19和cx - 3543,已被证明破坏与G4-binding蛋白质相互作用(EBNA1) [ 43]和NCL [ 18),它包含RGG图案。虽然这间接影响竞争与蛋白质四分体G4的脸,这些化合物还结合静电G4的凹槽和循环( 46, 47]可能防止protein-groove交互或调整循环结构破坏蛋白质绑定以这样一种方式。

蛋白质DHX36解旋酶是酶,这种酶能够绑定和解除RNA G4s的特异性( 57, 58]。地区DHX36独有的13个氨基酸在高等真核生物的进化,是必要的和足够的约束力G4s [ 59]。低分辨率的小角x射线散射表明G4识别主题是面向四分体的脸(图 4 (c))[ 30., 60)和突变的循环序列内生G4绑定伙伴导致亲和力下降,表明循环构象G4的也可能是重要的识别这个主题 61年]。高分辨率核磁共振结构实验室的安老爷Phan显示一个小18-amino-acid肽绑定到一个人造DNA G4 TT (GGGT) x4 (2 n21)支持这种模式绑定的 62年]。值得注意的是,类似的绑定模式一直观察RNA适配子与16-amino-acid朊蛋白的n端肽 P r P C (2 rsk和2 ru7) [ 63年, 64年]。

DHX36以来显著偏好取向平行和反平行的循环,循环序列仅限于一个胸腺嘧啶残留促进并行物种的形成。显示了螺旋桨型循环结构安排与肽形成典型的平行G4s短α螺旋区域后将覆盖整个四分体的脸。两个芳香残留物(Trp13和Tyr14)与DNA,但未做过任何改动接触传说中的稳定L型的肽。四残留物,即Gly9、Gly13 Ile12,和Ala17发现tetrad-peptide接口接近允许CH-pi交互(图 4(一))。

带正电的残留Lys8、Arg10 Lys19足够每个近距离接近G4的凹槽形成静电相互作用可以帮助稳定交互(观察数据 4(b) / 4(d));但是,先前的变异研究表明Lys8和Arg10可有可无的上下文中的完整的蛋白质( 59]。观察到的绑定模式解释DHX36对RNA G4s的偏爱;由于RNA G4s形式几乎完全平行链取向与螺旋桨式循环,他们预计会有暴露的四分体的面孔。绑定到一个大暴露疏水表面像四分体面提供一个显著增加熵通过反溶剂,因此一个高度良好的互动。DNA G4s的反平行的熵或混合类型循环结构可以避免这种惩罚通过循环基地和四分体面之间的相互作用使极地糖磷酸骨架上面G4和盾牌的疏水性四分体的脸。

核磁共振和x射线结晶学的局限性。核磁共振和x射线晶体学是两个技术有很多的优点和局限性,互为补充,使这两种技术的使用感兴趣的理想的方法来调查生物结构。在x射线晶体学将提供一个单一的形象准确的晶格结构,核磁共振显示许多模型可能的结构,所有符合同样的数据。核磁共振为基础的解决方案,这种方法可以把分子生理时间尺度上的动态,而x射线结晶学的观点,通常,热力学最稳定的系统形式。在分析x射线和NMR结构时,重要的是要记住,他们只提供快照的一个动态的过程,通常在nonphysiological条件下。见解闪烁着这些快照应该与突变的研究测试,使用信息从结构来测试它的有效性。

核磁共振结构生物学的主要缺陷是大小限制分子被调查。尤其是对蛋白质和核酸,经过一定长度,有许多重叠的信号来自不同地区的生物分子导致广泛的、一体的山峰,这使得分离和识别的信号来自哪个原子一个巨大的挑战。因此,通常,只有小肽是由该方法检查。这种方法的缺点是,不能确保小肽并不像在折叠的背景下完整的蛋白质。例如,从DHX36 18-amino-acid肽是只有2%的完整的大小1008 -氨基酸蛋白质。虽然四肽并展示重要的亲和力,全身蛋白质结合更加紧密( 59]。因此任何肽结构从研究中获得的见解,在最好的情况下,只有一块的全貌。此外,它已被观察到的结构FMRP /那么复杂,识别的G4s不仅仅是G4本身,而是连接区域和相邻的两倍或单链区;因此也比使用一个更大更好的模仿生物物种RNA / DNA寡核苷酸。这样做的问题在于,这种复合物可以超过大小限制核磁共振结构决定的,而这种大复合物通常难以结晶,通常需要外来盐条件或稳定抗体。这种结晶方法的缺点是很难证明的可靠性在生理方面获得的任何单一结构的相关性。

核磁共振方法的优点之一是能够识别无序区域。即使没有放松的色散实验中,模型通过核磁共振可以暗示的可变性无序的地区。x射线晶体学,另一方面,陷阱无序区域成一个稳定的构象可以混淆数据解释和导致误导的结果。灵活的区域这种陷阱的一个例子是在x射线结构FMRP RGG域和那么RNA。NMR数据复杂,第一,获得了定义糟糕的循环区域,暗示构象的灵活性。意外地循环两种不同的构象被捕获在一个不对称单位的晶体构象支持循环区域样本的概念多重构象。在单位有只有一个复杂的细胞,会有不确定性的动态循环核苷酸。

研究的另一个考虑G4s通过核磁共振或结晶学技术是他们需要高生物分子浓度会导致工件被观察到在晶格和NMR数据。例如,第一个自然G4和蛋白质的结构在同一晶体单元细胞的观察 Oxytrichia新星结束端粒结合蛋白(OnTEBP)。OnTEBP可以绑定到单链重复端粒(TTTTGGGG在年底 Oxytrichia新星)和保护他们免受DNA损伤修复机制在dsDNA承认优惠( 65年]。霍法和舒尔茨 66年)正在研究单链重复的绑定(GGGGTTTTGGGG) OnTEBP地区和x射线晶体学数据分析观察到衍射从DNA四倍的似乎是绑定到OnTEBP (1 jb7)。三个对称相关OnTEBP蛋白质出现在单位细胞每个绑定到ssDNA和每个导致绑定一个DNA四重的形成从一个二聚体的单链衬底。一OnTEBP蛋白质之间的相互作用与主要槽G4骨干和特色静电和氢键脱氧核糖糖组。另外两个OnTEBP蛋白质绑定通过TTTT循环序列通过静电相互作用、氢键、介子以及CH-pi堆积相互作用。作者承认在他们的论文中,相互作用可能是由于水晶填料的相互作用和生理上可能不是相关的,这可以作为一个例子,为什么一个分析数据时必须照顾nonphysiological条件下收购。

低pH值、高盐和高样品浓度通常被用来获得更好的衍射晶体或更多的离散核磁共振乐队。图 1是仔细考虑的重要性的解决方案获得结构信息以及获取这些信息的方法。两个完全不同的拓扑发现同样的DNA序列依赖的阳离子是四倍的稳定。Na的存在⁺稳定的反平行的 67年, 68年而K)形式⁺使结晶的平行 69年)的形式。

突变分析和高分辨率核磁共振和x射线研究提供了宝贵的见解生物分子的结构;这反过来又阐述了许多重要的生物过程的分子机制。与这些结构功能关系,我们可以合理的方法如何改变这些流程和修改它们修复病态。尽管G4s的识别蛋白质远未被理解,收集的数据中出现了几个趋势。很明显,G4s的循环结构和枢纽地区毗邻呈现出独特的景观识别的蛋白质分子。到目前为止,这似乎是最常见的模式识别。凝血酶结合寡核苷酸适配子似乎正规的凝血酶结合使用两个横向的胸腺嘧啶环,像军凝血酶上闩。EWS RGG域和付家/ TLS也似乎主要交互G4s的循环;模式识别在这种情况下很可能从phosphoribose骨干连接链的位置以来G4基地本身已被证明是可有可无的。FMRP的情况下,RGGGGR肽稳定的从G4过渡到双填充它们之间的连接与基地叠加和Hoogsteen氢键型双链。

突变了付家/ TLS蛋白质及其G4衬底显示优惠识别可以介导RNA / DNA G4 2′哦交互。这将是有趣的,看看其他G4-binding等突变蛋白质受到那些执行付/ TLS蛋白质。到目前为止,只有DHX36 G4-binding蛋白质,可以直接与开放guanine-tetrad面对G4及其对RNA G4s的偏好,这令人满意地解释了自反平行的面孔G4s通常被循环。然而,由于大部分的亲和力为G4丢失只检查DHX36特定主题肽时,可能存在其他绑定接口的G4有助于全身蛋白质的亲和力。

目前大多数G4-binding小分子直接与guanine-tetrad交互的脸。显然,这将直接与DHX36绑定但也已被证明能够防止绑定其他RGG域包含G4-binding蛋白质,使特定的目标和机械说明其影响具有挑战性的 18, 43, 47]。另一种方法来设计化合物结合G4s将设计化合物,模仿他们的独特的循环结构。自循环识别似乎许多G4-binding蛋白质的特异性的关键,建立小分子与这种交互竞争可能导致更具体的化合物可以用于更有针对性的方式影响细胞的途径。