JNA 杂志的核酸 2090 - 021 x SAGE-Hindawi访问研究 316079年 10.4061 / 2011/316079 316079年 研究文章 直接检测凝血酶结合8-Bromodeoxyguanosine-Modified适配子:修改亲和力和动力学的影响 枸杞子 把握现在 松井秀喜 小君 三好 Daisuke 部门Nanobiochemistry 首先,甲南大学 7-1-20 Minatojima-minamimachi 东京都中央区 科比650 - 0047 日本 konan-u.ac.jp 2011年 15 9 2011年 2011年 14 05年 2011年 15 07年 2011年 21 07年 2011年 2011年 版权©2011寿鹿枸杞子和小君松井。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

的亲和力8-bromodeoxyguanosine——(8-BrdG)代替thrombin-binding适配子(TBA-Br),第一和第十鸟苷残留8-BrdG取代,估计使用reflectometric干涉光谱(rif)。与未改性的稍后通知当比较TBA-Br (TBA-H),这是证明修改有效地改善了公司的亲和力;离解常数( K D )TBA-H和TBA-Br 45.4和1.99 nM,分别。这些值,通过直接观察凝血酶绑定使用rif,有相同的数量级与获得在我们之前的研究中利用构象变化稍后通知检测凝血酶结合,从而确认的有效性 K D 值。rif测量还透露,8-BrdG修改导致低离解速率常数( k d ),这表明,增强亲和力可以归因于在引入8-BrdG G-quadruplex结构的稳定。

 1。介绍

核酸的化学改性是一种有用的方法来提高稳定性的高阶结构( 1- - - - - - 5]。Thrombin-binding适配子(稍后通知)、d (GGTTGGTGTGGTTGG),是一种核酸的修改已经吸引了相当多的关注,作为改进的稳定可能会导致增强亲和力为目标物种,凝血酶,这可能是有用的诊断和治疗的各种条件。因为高阶之间的关系结构和亲和力是众所周知的,它的修改已被广泛研究。稍后通知被折叠成一个G-quadruplex结构组成的两个G-planes连接通过一个TGT循环和两个TT循环,如图 1(一)( 6- - - - - - 11]。

凝血酶的结构(a) G-quadruplex绑定适体和(b) 8-bromodeoxyguanosine。修改网站,G1和G10,用红色表示。

修改稍后通知策略可以分为两类:修改等核苷酸链锁核酸(放大器) 12, 13)或2′-fluoro-arabinonucleic酸(2′-F-ANA) ( 14)和碱基的修饰,如烷基化或phenylation [ 15]。这两种策略已经被证明是有效的为稳定高阶结构稳定G-plane中的特定糖苷键构象。

我们最近证明,稍后通知可以稳定的高阶结构通过引入8-bromodeoxyguanosine (8-BrdG,图 1 (b)),稳定 syn糖苷键的构象之间的位阻在C8位置和溴脱氧核糖一半( 16- - - - - - 18]。当两个8-BrdG残留在第一和第十鸟苷残留,一个syn构象,稍后通知明显的高阶结构稳定,提高熔点为15.8°C,凝血酶的亲和力显示更大的结合常数(12.5倍 19]。在先前的研究中,然而,稍后通知检测间接凝血酶的结合;从单个链构象转变的稍后通知G-quadruplex,由凝血酶的结合,诱导监控使用荧光染料。因此,直接测量所需的thrombin-binding现象一直为了验证估计绑定常量值和8-BrdG的影响增强亲和力的凝血酶稍后通知。此外,的实际效用8-BrdG-modified适体没有被调查。

在这项研究中,我们的直接观察凝血酶绑定到一个8-BrdG-modified稍后通知(TBA-Br)使用reflectometric干涉光谱(rif),它可以衡量一个分子层光学厚度的变化传感器芯片上,因此,将检测凝血酶结合修改后的稍后通知固定在芯片上( 20.- - - - - - 23]为了评估TBA-Br的绑定常量和有效性的TBA-Br公司开发一个敏感的传感器。

 2。材料和方法 2.1。材料

人类 α凝血酶是购买技术公司血液疾病过程。(埃塞克斯VT)。 N——(6-Maleimidocaproyloxy) sulfosuccinimide钠盐(Sulfo-EMCS)和6-Hydroxy-1-hexanethiol(计画)从Dojindo购买(熊本、日本)。3-Aminopropyltriethoxysilane(摘要)从东京购买化工有限公司有限公司(日本东京)。所有的DNA amidites和5′硫醇修饰符C6从格伦研究公司购买(弗吉尼亚州英镑)。5′-Thiolated未经thrombin-binding适配子(TBA-H)从北海道获得系统科学有限公司有限公司(日本札幌)。rif传感器MI-affinity LCR-01及其消耗品(罪传感器芯片和PDMS流动细胞)买来柯尼卡美能达光电子,公司(日本东京)。其他和光纯化学试剂购买来自kouichi(日本东京)。

基的寡核苷酸适配子序列如下。

TBA-H:

5′-SH-C6TTT TTT TTT TTT TTT GGT TGGTGT GGT TGG-3′

TBA-Br:

5′-SH-C6TTT TTT TTT TTT TTT GBrGT TGGTGT GBrGT TGG-3′

 2.2。DNA合成

使用AB 3400 DNA合成仪合成TBA-Br(应用生物系统公司Inc .,东京,日本)。合成寡核苷酸提纯20%变性页面。浓度的单链寡核苷酸是由测量吸光度在260 nm高温使用uv - 1700光谱仪与TMSPC-8 thermoprogrammer(日本岛津公司有限公司日本京都)。寡核苷酸是由二硫苏糖醇治疗前使用。

 2.3。芯片的制备

罪芯片表面与紫外线辐照下真空使用uer20 1 h - 172 - vb (Ushio Inc .,东京,日本)。UV-treated芯片被浸泡在含有1%丙酮进行了1 h,和与丙酮洗涤后,芯片在110°C加热30分钟。Thrombin-binding寡核苷酸适配子是固定 原位使用rif注射1毫米Sulfo-EMCS, 50 μM适体,5毫米计画在PBS缓冲30°C。一个Econoflo注射泵(美国哈佛装置,Holliston,质量)被用来移动PBS缓冲流量为2.0 μL敏−1。获得传感器芯片存储在PBS缓冲在4°C。

 2.4。rif测量

rif传感器(MI-affinity LCR-01)是用于直接监测协会/解离过程。所有测量进行了使用绑定缓冲(20毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值7.4)包含140毫米氯化钠,氯化钾5毫米,1毫米MgCl21毫米CaCl2盯住,1%在25°C和20的流量 μL敏−1。使用软件进行动力分析与MI-affinity LCR-01。一式三份进行了测量,平均数据如表所示 1。

每个稍后通知的绑定属性。

k 一个 k d K D
米−1年代−1 年代−1 纳米
Nonmodified稍后通知 7.45±0.20×104 3.38±0.33×10−3 45.4±5.6
8-BrdG代替稍后通知 1.58±0.10×105 3.15±0.46×10−4 1.99±0.29
3所示。结果与讨论 3.1。芯片的制备

传感器芯片是准备 原位使用rif(图 2)。杂双官能交联,Sulfo-EMCS,熊马来酰亚胺组和琥珀酰亚胺组两端,是用来固定thiol-terminated适配子在胺化了的罪的筹码。计被用来限制未反应的马来酰亚胺固定化Sulfo-EMCS根的目的地。注射后的适体固定,一个大约1.2 nm观察波长的变化与修改的修改(TBA-H)和寡核苷酸适配子(TBA-Br),从而确认同等程度的寡核苷酸适配子的固定。TBA-Br拥有两个8-BrdG残留在1日和10日鸟苷网站,和我们之前研究的基础上,优化方面的数量和位置8-BrdG组( 19]。

原位芯片制备过程监控reflectometric干涉光谱(rif)。芯片是准备在PBS 30°C。流量是2.0 μL敏−1。

 3.2。动态测量

传感器芯片固定化和TBA-H TBA-Br被注入100海里凝血酶评估。变化的反应是可再生的不到8.7%。相比TBA-H-immobilized芯片(图 3(一个)),TBA-Br-immobilized芯片(图显示一个更大的反应 3 (b))。这些结果表明,TBA-Br具有较高的亲和力比TBA-H凝血酶和相应的捕获大量的凝血酶分子。

Sensorgrams注入的100 nM凝血酶(a) TBA-H-immobilized芯片和(b) TBA-Br-immobilized芯片。测量进行了绑定缓冲在25°C。流量是20 μL敏−1。

使用sensorgrams获得100海里凝血酶注射,动力学分析(表执行 1)。TBA-Br显示更大的速率常数协会( k 一个 )(1.58×105米−1年代−1)比TBA-H (7.45×104米−1年代−1)。然而,对离解速率常数的影响更显著;TBA-Br显示离解速率常数低一个数量级( k d = 3.15×10−4年代−1比TBA-H) ( k d = 3.38×10−3年代−1)。因为凝血酶与稍后通知绑定是伴随着G-quadruplex稍后通知的形成,减少离解速率常数可能归因于G-quadruplex结构的稳定稍后通知(TBA-Br)由于引入8-BrdG;Tm TBA-H值为50.7°C, TBA-Br 66.5°C ( 19]。

离解常数( K D )TBA-H和TBA-Br 45.4和1.99 nM,分别。这些值在同一个数量级与我们之前得到的研究使用荧光染料( 19]。同样值得注意的是,TBA-H报道其他地方的离解常数是20至102.6纳米,这是通过其他检测方法,如SPR [ 24, 25),药物( 26),美国国际贸易委员会( 27),和一个电化学传感器( 28),从而支持适用条件的适用性和评估协议。直接检测稍后通知和凝血酶之间的绑定使用rif似乎是成功的,和亲和力的增强通过引入8-BrdG稍后通知确认。有趣的是,离解常数( K D )TBA-Br估计rif略低于获得使用荧光染料( 19),而电离常数( K D rif) TBA-H估计是比获得使用荧光染料。虽然目前造成这些差异的原因是不理解,这是可能的,即使在缺乏凝血酶的情况下,TBA-Br形成G-quadruplex在绑定缓冲用于rif的温度测量由于改进的稳定,这将有利于绑定与凝血酶由于preorganization效果。

 3.3。适体改性对灵敏度的影响

传感器敏感检测凝血酶对血栓形成的诊断可能有用。预计TBA-Br-immobilized芯片提供改善凝血酶敏感性由于其高度的亲和力。因此,我们调查的敏感性与TBA-Br-immobilized rif传感器芯片。应对各种浓度的凝血酶(从0.01到500 nM)绘制在图 4。TBA-Br-immobilized芯片显示一个重要反应1 nM凝血酶变化的不到5%,而TBA-H-immobilized芯片的检测极限高于5海里。虽然是中等程度,但稍后通知的确认修改提高亲和力有助于增强thrombin-sensor敏感性。

校准曲线对凝血酶TBA-H-immobilized TBA-Br-immobilized芯片和芯片。(一)波长与凝血酶浓度的变化。(b)波长变化与日志(凝血酶浓度)。测量进行了绑定缓冲在25°C。流量是20 μL敏−1。

 4所示。结论

在这项研究中,我们直接观察TBA-Br和凝血酶之间的关系通过rif为了估计动力学速率和亲和常数。估计离解常数有相同的数量级与之前的研究中获得使用荧光染料,因此建议适当修改与8-BrdG残留在稍后通知的G-plane增加亲和力。此外,减少在离解速率常数的引入8-BrdG表明亲和力增强的效果是由于8-BrdG在稳定的G-quadruplex结构稍后通知。初步TBA-immobilized传感器芯片的灵敏度的测试也表明,改性提高亲和力导致一个更好的检测极限虽然目前温和的影响。

 承认

作者感谢柯尼卡美能达光电子,Inc .)、技术援助和贷款的原型MI-affinity LCR-01 rif传感器。

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