JIR 免疫学研究期刊》的研究 2314 - 7156 2314 - 8861 Hindawi 10.1155 / 2021/9995869 9995869 研究文章 抑制DLBCL进展的E3连接酶Trim35是由时钟退化和NK细胞的渗透 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7347 - 8967 唐ydF4y2Ba 龚喜颜 1 2 曹 阜阳 1 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 0380 - 9537 唐 Feiyu 1 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 0898 - 1854 陆 可以 3 https://orcid.org/0000 - 0003 - 2610 - 0037 余 Qiaoyan 1 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6593 - 9260 冯 嵩山 4 杨 洹 1 2 程ydF4y2Ba Songming 1 2 他 香 1 2 他 江 1 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7058 - 8274 翁 梁 1 2 5 https://orcid.org/0000 - 0002 - 0558 - 5250 太阳 Lunquan 1 2 5 6 7 梁 古时的 1 长沙市湘雅癌症中心 长沙市湘雅医院 中南大学 长沙410008 中国 csu.edu.cn 2 分子的放射肿瘤学湖南省重点实验室 长沙410008 中国 3 病理学系 长沙市湘雅医院 中南大学 长沙410078 中国 csu.edu.cn 4 神经外科学系 长沙市湘雅医院 中南大学 长沙410078 中国 csu.edu.cn 5 湖南国际科技合作基地的精密医学癌症 长沙410008 中国 6 老年癌症研究学院 全国老年医学临床研究中心 长沙410008 中国 7 中南大学的分子成像中心 长沙市湘雅医院 长沙410008 中国 2021年 24 5 2021年 2021年 25 3 2021年 10 5 2021年 24 5 2021年 2021年 版权©2021龚喜颜Tan et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

弥漫型大b细胞淋巴瘤(DLBCL)的多数患者出现复发或难治性疾病后标准ruxolitinib、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松(R-CHOP)化疗,部分相关的特异表达肿瘤免疫微环境。然而,免疫细胞的渗透是如何妥善监管是知之甚少。在这里,我们表明,E3泛素连接酶Trim35表达人类DLBCL组织在低水平。我们还表明,过度的Trim35抑制DLBCL细胞增殖和与劣质DLBCL患者的生存。我们机械的研究表明Trim35函数作为E3连接酶调节时钟的泛素化和退化,昼夜节律性的关键调节器。高表达的Trim35与NK细胞渗透在DLBCL,部分原因是时钟的退化。,时钟显示的高表达患者总体存活率较差。总的来说,这些发现表明,Trim35抑制DLBCL通过调节肿瘤免疫微环境的恶化,这表明它可能是一个有前途的诊断和预后的生物标志物在DLBCL。

 “湖湘人才招聘项目 2019年rs1009 湖南省自然科学基金优秀年轻学者 2019年jj30043 中国国家自然科学基金 81974465 81900199 1。介绍

弥漫型大b细胞淋巴瘤(DLBCL),最常见的子类型非霍奇金淋巴瘤(NHL)在成人中,有一个中死亡率最高的癌症在世界最发达地区。三个基因表达子组,生发中心B细胞样的(GCB-like),激活B细胞样的(ABC-like)和原发性纵隔B细胞淋巴瘤,已确定,最后两组也称为non-GCB-like淋巴瘤( 1, 2]。患者GCB-like DLBCL明显比那些更好的整体存活率non-GCB-like DLBCL [ 3, 4]。同样,预后的临床指标,国际预后指标(IPI),已成功用于定义预后DLBCL的子组。这个指标考虑病人的年龄和性能状况、疾病的程度和位置,和血清LDH水平( 2]。尽管目前的治疗策略,包括标准ruxolitinib、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、和强的松(R-CHOP)化疗;标记或者放射性标记的单克隆抗体;和高剂量化疗自体外周血干细胞移植后,明显改善DLBCL的结果,大部分患者复发或对之前治疗产生耐药性 5),这部分是由于肿瘤特异表达的免疫微环境。例如,ABC-like DLBCL亚型被发现CD58基因的失活,这表明识别肿瘤细胞的ctl和NK细胞,可能是导致患者的复发或难治性疾病ABC-like DLBCL亚型。因此,有必要进一步研究底层机制调节免疫细胞进入肿瘤微环境的渗透。

昼夜节律性是一个大约24小时细胞自动由transcription-translation反馈循环的“生物钟基因,”表达在大多数细胞类型,包括免疫系统的细胞( 6- - - - - - 9]。核心的生物钟是一个自身调节的转录反馈回路包括活化剂时钟和BMAL1与抑制因子复杂,包括Per1 Per2, Cry1、Cry2 [ 9- - - - - - 12]。昼夜系统调节几乎所有生理过程和影响人类健康和疾病的状态。最新进展表明,昼夜节律性破坏导致干扰免疫反应,肥胖、2型糖尿病和癌症。迄今为止,如何调节生物钟基因的表达在肿瘤仍知之甚少。

泛素是一种小分子修饰符标签蛋白在一个非常具体的方式。最初,泛素化被形容为蛋白质标记的过程通过蛋白酶降解[ 13),负责的80 - 90%的细胞内蛋白质折叠或异常通常是短暂的。贩卖蛋白质泛素化调节蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的关系通过不同联系的polyubiquitin链( 14, 15]。Ub-activation酶(E1) Ub-conjugation酶(E2),乌兰巴托连接(E3)需要泛素附加到衬底( 16, 17]。E3连接被认为是最重要的组件的泛素结合机械,他们将直接绑定到目标蛋白质和底物特异性。蛋白质泛素化影响许多细胞过程中,基因转录、DNA修复、细胞周期和细胞凋亡 18]。Polyubiquitination通常标记蛋白质的蛋白酶体降解[ 19]。最新进展表明,线性泛素链组装复杂(LUBAC)是至关重要的是参与b细胞便通过保护DNA损害细胞死亡和b细胞淋巴瘤是一种合适的治疗目标 20.]。此外,最近的研究表明,CRL3-SPOP泛素连接酶复杂由消极抑制弥漫性大b细胞的生长调节MYD88 / NF - κB信号( 21]。越来越多的证据表明,泛素化对DLBCL发展至关重要。也被报道,生物钟基因的稳定性/,蛋白质是由自洽场E3泛素连接酶复合体涉及 β分别-TrCP和FBXL3 [ 22]。然而,它在很大程度上仍是个未知数生物钟蛋白的泛素化是如何参与DLBCL进展。

三方主题35 (Trim35),也称为造血血统开关(Hls5),属于无名指,B箱,卷曲螺旋(RBCC),或削减家庭E3连接表达各种造血细胞类型,包括胎儿肝脏祖细胞( 23]。据报道,Trim35是一个肿瘤抑制基因( 24]。执行表达式Trim35的海拉细胞抑制细胞生长,clonogenicity和致瘤性。经常差别Trim35对这些事件在肝细胞癌的表达水平Trim35负相关与肿瘤大小、组织学分级、血清甲胎蛋白浓度( 24]。此外,削减家庭蛋白质是重要的先天免疫效应器对抗病毒感染。最近的研究结果揭示了小说的角色Trim35;它催化Lys63——或者Lys48-linked polyubiquitination TRAF3,调节rig - i抗病毒免疫,和参与防御机制(IAV)感染甲型流感病毒( 25]。然而,角色的免疫微环境和DLBCL Trim35先前没有被报道。

在这项研究中,我们确定了在DLBCL Trim35表示在低水平的组织。Trim35超表达显著抑制DLBCL扩散和与预后比Trim35 DLBCL患者的不足。此外,我们发现Trim35与时钟和促进其泛素化和退化。此外,Trim35和时钟在DLBCL促进和抑制NK细胞的渗透。我们的研究揭示出生物钟蛋白的泛素化有助于肿瘤免疫微环境重塑和DLBCL进展。

 2。方法 2.1。病人

总共69名患者被诊断出患有DLBCL在中南大学湘雅医院2013年至2019年被纳入本研究。临床资料来源于他们的医疗记录。随访期从4到88个月不等。

作为一个独立的验证中,共有61名患者被诊断出2013 - 2019年间在DLBCL,均匀R-CHOP处理,收集。病人的年龄范围从10到86年,和后续的持续时间从5到88个月。

 2.2。免疫组织化学

整体的部分代表formalin-fixed,石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织块提交免疫组织化学(包含IHC)。DLBCL决心的免疫组织化学子群non-GCB或GCB类型根据汉斯的标准( 26]。包含IHC执行以下标准协议。在细节,免疫组织化学细胞角蛋白染色进行FFPE组织使用一个直接immunoperoxidase技术。部分安装在滑动在二甲苯脱蜡,在乙醇脱水,煮在0.01 M柠檬酸缓冲(pH值6.0)在微波炉30分钟,然后用3%的过氧化氢孵化15分钟。与PBS洗涤后,幻灯片正常孵化5% BSA 1小时,其次是一夜之间孵化与兔多克隆抗体识别Trim35 (Sigma-Aldrich HPA019647, 1: 200年,上海,中国),时钟(18094 - 1 - ap, 1: 50, Protein-Tech,武汉,中国),CD3 (kit - 0003, MaiXin生物技术、福州、中国),CD19 (mab - 0705, MaiXin生物技术、福州、中国)、CD56 (mab - 0743, MaiXin生物技术、福州、中国),CD16 (Protein-Tech 16559 - ap, 1: 100年,武汉,中国),和CD68 (kit - 0026, MaiXin生物技术、福州、中国)。洗后,孵化了部分3,3 ′ -diaminobenzidine (DAB) (pv - 6000 d, ZSGB-BIO、北京、中国)。然后用苏木精复染色部分,脱水,清除和安装。CD3被用作标记的T细胞,CD19被用作标记的b细胞,CD56、CD16用作标记的NK细胞,和CD68被用作标记的肿瘤相关巨噬细胞(tam)。免疫染色的CD3、CD16 CD19、CD56 CD68、Trim35,时钟。

 2.3。细胞培养和转染

普费弗细胞(人类DLBCL细胞株)从美国购买类型文化集合(写明ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。该细胞系RPMI 1640培养基培养(Gibco-Invitrogen),这是与青霉素(100 U /毫升)补充,链霉素(100 μ克毫升1;Gibco-Invitrogen), 10%胎牛血清(的边后卫);这些细胞被文化孵化器有限公司为5%2在37°C。人类胚胎肾细胞在DMEM培养293英尺(Gibco-Invitrogen)。所有转染实验进行使用Lipofectamine 8000 (Beyotime生物科技、上海、中国)根据制造商的建议。在细节中,细胞被播种在文化板块。当细胞密度达到70 - 80%,细胞转染质粒。收集细胞的posttransfection 36-48小时免疫印迹分析。

菲佛的一代细胞稳定表达标志标记Trim35或Trim35 KO细胞系,慢病毒载体编码Flag-Trim35在慢病毒包装细胞系,转染和生产重组慢病毒被感染了重组慢病毒感染细胞的选择使用紧随其后嘌呤霉素(A1113803热费希尔科学、上海、中国)。

 2.4。质粒和小指南rna (sgRNAs)

过度表现Trim35,编码区域放大的cDNA 293英尺的细胞,和Trim35被克隆到PQCXIP-Flag萨利·和BamHI网站之间的向量。和Trim35 sgRNA是由退火两个互补的寡聚物编码sgRNA的AgeI和EcoRI网站lentiCRISPR V2向量,这称为pSilencer整个报告。使用CRISPR sgRNAs设计工具( http://crispr.mit.edu)以减少潜在的脱靶效应。sgRNA序列和基因引物所示如下:Trim35 sgRNA (CACGTCGGGACTCCGCTCCA)。

 2.5。细胞生存能力分析

细胞生存能力是衡量使用CCK-8化验。短暂,细胞悬浮液的密度每被播种在96 - 4000细胞孔板和孵化37°C。在孵化后,细胞在指定的条件下接受治疗。在治疗结束时,CCK-8化验是用来计算可行的细胞的数量通过测量吸光度在450 nm和规范化的一个空白的吸光度(只装满CCK-8试剂)。

 2.6。RNA制备和定量实时聚合酶链反应(PCR)

总RNA提取DLBCL细胞系利用试剂盒(英杰公司)根据制造商的指示,反向转录cDNA使用PrimeScript RT-polymerase (RR047A-6、豆类、大连,中国)。时钟的mRNA水平被发现通过使用iTaq™普遍SYBR®绿色(Bio-Rad)和GAPDH是作为内部控制。

以下引物被用于实时定量逆转录聚合酶链反应(存在):

GAPDH引物:

转发:5 ′ ——GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT

反向:5 ′ ——GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

时钟引物:

转发:5 ′ ——TGCGAGGAACAATAGACCCAA

反向:5 ′ ——ATGGCCTATGTGTGCGTTGTA

2.7。免疫印迹和免疫沉淀反应(IP)

IP,提取的蛋白质与培养细胞随后修改缓冲区IP和免疫印迹与相应的抗体。兔多克隆抗体识别Trim35 (Sigma-Aldrich HPA019647, 1: 1000年,上海,中国)从Abcam获得;的时钟(18094 - 1 - ap, 1: 1000年,Protein-Tech,武汉,中国),隐花色素2 (13997 - 1 - ap 1: 1000年,Protein-Tech,武汉,中国),和ARNTL (Protein-Tech 14268 - ap, 1: 1000年,武汉,中国)是从蛋白质技术。鼠标获得多克隆抗体识别PER2 (67513 - 1 - ig 1: 5000年,Protein-Tech,武汉,中国),GAPDH (60004 - 1 - ig 1: 3000年,Protein-Tech,武汉,中国),并标记(20543 - 1 - ap 1: 3000年,Protein-Tech,武汉,中国)购买来自蛋白质的技术。

 2.8。体外sgRNA测试

体外测试sgRNA是由慢病毒感染到人类DLBCL细胞系菲佛。收获了基因组DNA DNA提取工具包(B518215 Sangon生物技术,中国上海)和用作PCR模板,紧随其后的是T7核酸内切酶(T7EI)测定。

 2.9。T7核酸内切酶(T7EI)测定

PCR扩增子目标网站的纯化和用作输入到T7核酸内切酶(T7EI)我(D0508S、基因编辑突变检测装备,Beyotime生物技术,上海,中国。制造商的推荐协议之后。T7 EI-treated产品运行在2%琼脂糖凝胶(表达载体),沾染了核酸性染料,在凝胶成像仪成像(Bio-Rad)。

 2.10。计时器的分析

Trim35表达与肿瘤浸润免疫细胞之间的关系(TIICs)在32癌症类型确定使用计时器( https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[ 27]。计时器推断的丰富TIICs应用基因表达谱的统计分析 28]。我们分析之间的关联Trim35基因表达水平和大量的免疫细胞浸润,包括肿瘤相关巨噬细胞(tam)、单核细胞亚群,骨髓树突状细胞(dc), NK细胞、b细胞、CD4细胞+T细胞基于特定的标记基因的表达在不同的癌症包括DLBCL。标记基因用于肿瘤浸润免疫细胞的分析包括T细胞、b细胞,单核细胞,tam,巨噬细胞M1, M2巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞,树突状细胞(dc),亚群,myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)是基于数据从先前的研究 29日, 30.]。

 2.11。统计分析

使用SPSS 24.0进行统计分析。数值数据表示为 的意思是 ± 标准 错误 并使用小动物——一张长有学生的计算 t 以及、卡方检验和斯皮尔曼相关分析。 p 值是由星号表示的数据: ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。所有实验至少重复3次。

 3所示。结果 3.1。低表达Trim35 DLBCL的不良预后相关

评估对DLBCL Trim35细胞生长的影响,我们建立了普费弗细胞稳定表达Trim35 (Trim35-OE)慢病毒转导(图 1 (d))。然后,CCK-8化验和细胞计数分析进行评估对DLBCL Trim35细胞增殖的影响。结果表明,过度Trim35大大抑制DLBCL的增殖细胞(数字 1 (e)和 1 (f)),这表明Trim35可能参与DLBCL的抑制。确认的相关性Trim35 DLBCL,我们接受从61年主要DLBCL患者临床组织样本包含IHC分析。与相邻正常淋巴结,核Trim35肿瘤组织的免疫反应性明显降低(图 1(一)和 1 (b))。值得注意的是,nongerminal中心b细胞类型(NGCB) DLBCL组织表达Trim35水平低于GCB DLBCL组织(图 1 (c))。此外,kaplan meier Trim35明显的生存分析表明,高表达与较长的操作系统在DLBCL患者( p = 0.0172 )(图 1 (g))。接下来,在一个单一因子分析、性和细胞的起源没有预后意义。然而,癌症诊断阶段,血清LDH和IPI评分操作系统被认为是独立的预后指标(癌症诊断阶段, p = 0.0132 , 人力资源 = 3.530 (95% CI, 1.521 - -8.193);血清LDH、 p = 0.036 , 人力资源 = 2.116 (95% CI, 0.8643 - -5.178);IPI评分, p = 0.0078 , 人力资源 = 2.906 (95% CI, 1.065 - -7.931))(表 1)。总的来说,这些数据显示Trim35 DLBCL的抑制功能。

低表达Trim35 DLBCL与不良预后相关。(一)免疫组织化学染色在人类DLBCL Trim35组织和正常的淋巴结。具体Trim35信号显示在布朗(DAB染色),并使用苏木精复染色进行核(蓝色)。酒吧,200 μm。(b, c)总结整个群DLBCL患者,由包含IHC评估。的 p 卡方检验值的计算。(d) Pfeiffer细胞感染病毒表达Flag-Trim35或空向量。被选中后,蛋白质提取表示蛋白质免疫印迹。(e) CCK-8化验Trim35-overexpressing细胞和空vector-expressing细胞的稳定。(f)增长曲线的稳定Trim35超表达组和空载体组数。(g)患者的总体生存分析高(红色)和低(蓝色)Trim35基于包含IHC染色蛋白表达。样品与Trim35染色在< 5%的细胞被认为是低表达,和染色> 5%被认为有高表达。所有实验至少重复3次。NS p < 0.05 , ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

单一因子分析整体DLBCL患者(OS)。

特征 变量 (总 n = 61年 ) 风险比(95%置信区间) p 价值
年龄(年) < 60 46 1.429 (0.5667 - -3.604) 0.4046
> 60 15
性 男性 39 0.9404 (0.3972 - -2.226) 0.8881
女 22
细胞的起源 华东桐柏 24 0.5581 (0.2379 - -1.309) 0.1587
Non-GCB 37
癌症在诊断阶段 I / II 23 3.530 (1.521 - -8.193) 0.0132
III / IV 38
血清LDH 正常的 37 2.116 (0.8643 - -5.178) 0.036
升高 24
IPI评分 0/1/2 42 2.906 (1.065 - -7.931) 0.0078
3/4/5 19
3.2。Trim35正与NK细胞浸润和抑制DLBCL进展有关

为了解决Trim35抑制DLBCL进展如何,我们评估是否Trim35 upregulation导致抗肿瘤效应通过重塑免疫微环境。来验证这个假设,我们使用肿瘤免疫Gene-Immune进行分析评估资源(时间)( https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。正如预期的那样,结果表明,Trim35的表达是高度相关的渗透记忆b细胞、CD4细胞+(nonregulatory) T细胞CD4细胞+CD4记忆T细胞,休息+CD4记忆T细胞+Th2细胞、自然杀伤(NK)细胞,NK细胞休息,M1巨噬细胞和单核细胞(图 2(一个))。验证的相关性Trim35表达和免疫细胞浸润,包含IHC进行确定肿瘤浸润T细胞(CD3的数量+),b细胞(CD19+)、巨噬细胞(CD68+)和NK细胞(CD16+和CD56+)[ 31日在DLBCL]。代表包含IHC图像如图 2 (b)和细胞密度(细胞计数/毫米)61年例DLBCL患者量化和策划;结果显示肿瘤浸润NK细胞(CD16之间的正相关关系+和CD56+)和Trim35(图 2 (c))。此外,更好的生存在高渗透的患者NK细胞( CD 56 积极性 > 15 % )比那些低渗透( CD 56 积极性 < 15 % )( p = 0.0205 )。和更好的整体存活率与CD16(样本的高表达 CD 16 积极性 < 0.8 % 低表达的细胞被认为是,那些 染色 > 0.8 % 被认为有高表达)(数据吗 2 (d)和 2 (e))。综上所述,这些结果表明,Trim35可能抑制DLBCL进展通过调节NK细胞浸润。

Trim35正与NK细胞浸润和抑制DLBCL进展有关。(a)与免疫细胞在DLBCL Trim35表达的相关性。(b)代表包含IHC肿瘤浸润CD3的图像+,CD19+,CD16+、CD56+和CD68+细胞从两个Trim35的高、低表达患者。规模的酒吧,50 μm。(c)的差异CD3 / CD19 / CD16 / CD56 CD68 Trim35子组之间的积极评估未配对t检验分析。(d, e) kaplan meier DLBCL操作系统分析对表型特征。NK细胞标记(CD56的分析+和CD16+)进行可评价的疣状。NS p < 0.05 , ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 3.3。Trim35是时钟的E3泛素连接酶,促进其蛋白酶体降解

据报道,生物钟基因参与调节肿瘤微环境和癌症进展。探讨分子介质Trim35的肿瘤抑制功能,我们在293英尺的细胞过表达Flag-Trim35然后执行IP分析检查Trim35和几个时钟蛋白质之间的相互作用(图 3(一个))。在这些蛋白质中,时钟被Flag-Trim35成功coimmunoprecipitated,表明两个蛋白质之间的相互作用。Trim35报道为E3连接酶,所以我们探索Trim35能否促进泛素化和退化的时钟。Trim35过度诱导时钟泛素化(图 3 (b)在293英尺的细胞)。此外,Trim35淘汰赛细胞系构建,来验证有效sgRNA Trim35;我们量化编辑效率使用T7核酸内切酶分析。的Trim35 sgRNAs能够诱导indels在特定目标位点(图 3 (c))。符合这一发现,Trim35增加时钟蛋白质的消耗水平在DLBCL细胞系(图 3 (d))。有趣的是,稳定超表达在DLBCL Trim35细胞系的内源性蛋白质水平降低时钟(图 3 (e))。这些观察表明,Trim35参与调节时钟表达式。接下来,我们分析了内生时钟泛素化在DLBCL细胞系蛋白酶体抑制剂MG132的存在与否。正如预期的那样,我们发现Trim35-induced抑制时钟可以有效地废除了MG132(数字 3 (f)和 3 (g)),这表明时钟是退化通过proteasome-mediated蛋白质水解降解途径。此外,我们观察到Trim35对时钟的mRNA水平没有影响(数据 3 (h)和 3(我))。进一步定义是否Trim35调制内生稳定性的时钟,我们抑制 新创蛋白质含量的时钟Trim35过表达和Trim35摧毁细胞。我们的数据表明,Trim35显著诱导退化时钟蛋白质在这些cycloheximide-treated DLBCL细胞(数字 3 (j)和 3 (k))。这些结果表明,Trim35函数作为E3连接酶促进时钟通过蛋白酶体降解途径。

Trim35控制时钟的泛素化和退化。(一)293英尺细胞转染Flag-tagged Trim35或空向量。转染后48小时,细胞溶解产物是准备和接受IP anti-Flag珠子和免疫印迹表示。293英尺(b)的免疫印迹细胞溶解细胞转染Trim35或空向量,连同HA-Ub。细胞溶解产物是准备和接受IP anti-HA珠子和免疫印迹表示。(c) Trim35 sgRNAs是人类Trim35位点设计目标。琼脂糖凝胶显示修改这两个位点在转染细胞。(d) Pfeiffer细胞感染病毒表达Trim35 sgRNA或控制sgRNA和选择;细胞溶解产物表明蛋白质免疫印迹。微量化蛋白质乐队,表现为相对的表达式。 (e) Pfeiffer cells were infected with Flag-Trim35 expression virus. Protein extracts were immunoblotted for the indicated proteins. CLOCK bands were quantified by densitometry and presented as relative expression. Pfeiffer cells with stable Trim35 overexpression (f) and Trim35-depleted Pfeiffer cells (g) were treated with a proteasome inhibitor MG132 (10  μg / mL)在过去5个小时才消散。时钟蛋白质含量进行了检测和分析。蛋白质乐队被测密度术和作为相对量化表达式。(h i)中描述的相同的细胞(e、d)被用于存在时钟mRNA表达分析。结果规范化GAPDH mRNA水平和表达褶皱mRNA表达与控制的变化。(j, k)中描述的相同的细胞(e、d)培养6 h和24小时之前进一步孵化放线菌酮(CHX)表示时间点。在不同时间点的时钟被免疫印迹检测。微量化时钟乐队,表现为相对的表达式。每个实验都成功进行了三次。NS p > 0.05 , ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 3.4。时钟是高度表达DLBCL和NK细胞渗透负相关

调查是否Trim35抑制DLBCL进展通过时钟,我们首先评估人类DLBCL Trim35的临床意义。人类DLBCL时钟表达式分析了样本,代表包含IHC图像如图 4(一)。时钟在DLBCL显著增加组织的表达与正常淋巴结组织(图 4 (b)),与Trim35的表达呈负相关。接下来,进一步阐明时钟的相关性在人类DLBCL的免疫微环境,我们确定时钟之间的关系表达式和几个免疫细胞的标记。一致,我们发现时钟、CD56、CD16之间的负相关,NK细胞(图的两个生物标志物 4 (d)包含IHC),代表图像(图所示 4 (c))。否则,时钟高表达患者的总体生存的患者明显比低时钟表达式( p = 0.0309 )(图 4 (e))。这些结果表明,通过时钟Trim35可能改造肿瘤免疫微环境。

时钟是高度表达在DLBCL和NK细胞浸润呈负相关。(一)免疫组织化学染色时钟在人类DLBCL组织和正常淋巴结组织。特定的时钟信号在布朗(DAB染色),并使用苏木精复染色进行核(蓝色)。酒吧,200 μm。(b)总结整个群DLBCL患者,由包含IHC评估。的 p 卡方检验值的计算。(c)代表包含IHC Trim35和肿瘤浸润CD3的图像+,CD19+,CD16+、CD56+和CD68+细胞从两个时钟的高、低表达患者。规模的酒吧,50 μm。(d)的差异CD3 / CD19 / CD16 / CD56 CD68积极性两个时钟之间的子组被一个未配对的评估 t 测试。(e)患者的总体生存高(红色)和低(蓝色)时钟表达式基于包含IHC染色。NS p > 0.05 , ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 4所示。讨论

我们目前的研究发现显著减少Trim35表达人类DLBCL组织与正常淋巴结组织相比,人类便指示Trim35的临床意义。我们进一步表明,过度的人类DLBCL Trim35细胞可以抑制其增殖并在DLBCL与贫穷的生存。一种机械的研究表明,Trim35函数作为E3连接酶调节时钟的泛素化和退化。一致,生物信息学方法和包含IHC人类DLBCL样本分析显示Trim35和时钟表达积极的和消极的与NK细胞渗透,分别。此外,我们的研究证实,Trim35和时钟表达和NK细胞渗透是DLBCL的独立预后变量。未来的研究需要发现的详细机制在DLBCL时钟调节NK细胞浸润。

人类肿瘤逃避免疫监视,提高他们的生存 32, 33]。抗癌免疫疗法已被证明是一个强大的治愈癌症的方法。NK细胞存在于外周血和一些淋巴肿瘤和nonlymphoid器官和及时招募网站作为肿瘤免疫监视的一个重要组成部分 31日, 34]。迅速激活NK细胞也分泌多种细胞因子和趋化因子,如干扰素 γ(干扰素 γ),促进其他参与者的招聘和激活在抗肿瘤反应 35]。他们的效应函数也代表一个至关重要的因素在决定对抗癌治疗的反应;例如,NK细胞发挥重要作用在rituximab-dependent杀害淋巴瘤细胞(ADCC)机制(通过一个依赖抗体的细胞毒性 36, 37]。先前的研究也证实,绝对在NK细胞计数减少预测没有响应和较短的风平浪静的生存和无进展生存(PFS)在DLBCL,这表明外周血自然杀伤细胞计数(NKCC)可能是一个有价值的生物标志物在临床实践中,为小说的发展铺平道路联合治疗方法b细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)旨在加强anti-CD20抗体的活动为他们提供足够数量的功能效应细胞( 38- - - - - - 40]。此外,主机响应的预后和治疗意义由NK细胞渗透被描述在霍奇金淋巴瘤和DLBCL [ 41]。所有的这些发现强调NK细胞在DLBCL的至关重要的作用。

靶蛋白的时钟是一个关键的昼夜节律的监管机构,这是一个生物机制,规定一系列有节奏的生理过程。这个生理控制的功能依赖于细胞的新陈代谢,在肿瘤微环境和生物系统 42]。先前的研究已经为特征的影响生物钟在肿瘤发生和特定的免疫细胞。例如,最近的一项研究表明,CD4细胞+和CD8+T细胞与核心时钟分子,尤其是肺腺癌和肺鳞状细胞癌( 43]。此外,据报道,肿瘤生长速度增加和延迟减少昼夜中断条件下相比正常光照周期(LD)安排在小鼠黑色素瘤模型 44]。然而,很少有人知道生物钟基因的作用在肿瘤微环境调控和DLBCL进展。我们的研究结果显示,生理时钟基因有很强的负相关与NK细胞渗透DLBCL组织。此外,我们发现时钟通过ubiquitination-proteasome通路由Trim35退化。一致,时钟在DLBCL患者和与Trim35的表达呈负相关。

据我们所知,Trim35是第一个E3连接酶的时钟确定到目前为止,也扩展了我们的理解肿瘤恶化的Trim35的抑制作用。

 5。结论

总体而言,目前的研究显示,Trim35 E3泛素连接酶作用的时钟来推进其泛素化和蛋白酶体降解;这种抑制DLBCL发展通过提高细胞毒性NK细胞的渗透到肿瘤。Trim35是一种很有前途的预后标志物DLBCL,未来的研究应该进一步揭示的详细机制进行时钟蛋白的泛素化与肿瘤微环境的改造和治疗反应。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

我们感谢所有的人参加了这项工作。这项工作得到了国家自然科学基金(81900199、81900199 l),湖南省自然科学基金优秀年轻学者(2019 jj30043 l),和“湖湘人才招聘项目(2019 l rs1009)

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