1。介绍
自发糖尿病鸟居(SDT)脂肪老鼠肥胖2型糖尿病的新模式,建立了通过引入
足总Zucker等位基因的老鼠脂肪进入SDT老鼠基因组(
1]。SDT老鼠是一个有用的模型nonobese自发发展2型糖尿病高血糖和葡萄糖耐受不良引起的胰岛素分泌减少由于
β
细胞变性(
2,
3]。这是值得注意的SDT老鼠显示眼部并发症如静脉扩张和蜿蜒的血管网络(
4]。SDT肥鼠断奶后立即表现出食欲过盛和肥胖,糖尿病及其并发症是发现在年轻的时候在SDT肥老鼠比SDT老鼠(
5]。
肥胖中扮演着重要角色在一些代谢疾病的病理生理学和糖尿病的一个危险因素或血脂异常。据报道,在皮下和内脏脂肪的分布地点影响其代谢的影响。具体来说,增加腹部肥胖已被确认为糖尿病的一个危险因素(
6- - - - - -
9]。衰老大鼠空腹和餐后血浆胰岛素水平增加有关,建议一个胰岛素抵抗状态。胰岛素抵抗的相关性与增加的脂肪重量,特别是内脏脂肪(
10,
11]。食物摄入量在SDT脂肪在6周大的老鼠显示关于增加两倍的价格相比SDT老鼠,和身体质量指数和脂肪垫重量的SDT肥老鼠在14周的年龄的增加(
1]。在SDT肥老鼠,它显示了食欲过盛和肥胖,至关重要的是,食物摄入量之间的关系的变化和脂肪组织详细检查。本研究进行调查食品限制SDT肥老鼠如何影响脂肪体重,脂肪量,或者脂肪组织的代谢功能。
2。材料和方法
2.1。动物和饮食
这个实验是在遵守指导方针进行动物实验的日本烟草生物/药理研究实验室。男性SDT -
足总/
足总(SDT脂肪)大鼠和年龄SDT - + / + (SDT)老鼠从我们的殖民地。SDT肥老鼠在6周的年龄被分为两组。一组被允许饲料(CRF-1,查尔斯河日本,日本横滨)
随意,另一组是pair-fed同样数量的食物被同龄SDT老鼠从6 - 22周的年龄。pair-fed SDT老鼠脂肪的食品消费的-60%,在50%左右
随意美联储SDT肥老鼠实验期间。总之,三组大鼠在6周的年龄准备:(a)项高脂肪喂养的老鼠
随意(脂肪族),(b)项肥老鼠pair-fed与SDT老鼠(Fatty-PF组),和(c) SDT老鼠喂食
随意(SDT组)。卫星群的每个三组建立了12周的年龄评估额外的影响。悬浮支架的笼子里的老鼠住单独的专用房间温度23
±
3°C,湿度55
±
15%,12小时光照周期,可以免费获得水。
2.2。生物参数
身体重量和血液化学参数,如葡萄糖、甘油三酯(TG)、胰岛素、瘦素和脂联素水平,测量在6、12、22周的年龄。
收集血液样本从大鼠的尾静脉。血清葡萄糖和TG水平测量使用商业套装(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)和一个自动分析仪(日立7180;日立、日本东京)。血清胰岛素和瘦素水平测定大鼠胰岛素——或瘦素酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(森永生物科学研究所、日本横滨)。血清脂联素测定用鼠标/鼠脂联素酶联免疫试剂盒(大冢制药公司,东京,日本)。
2.3。脂肪组织的重量
内脏和皮下脂肪重量在每个鼠测定6中,12,22周时代的计算机断层扫描(CT)分析。的脂肪重量测量实验室x射线CT装置(LATheta, ALOKA有限公司,大阪,日本)。老鼠麻醉50毫克/公斤的腹腔内注射戊巴比妥(东京化工、日本东京),和大约20 CT照片每只老鼠被每隔5毫米之间的隔膜和腰椎。内脏和皮下的比值(V / S)计算。
尸体剖检进行卫星组在12周的年纪,和权重的腹腔内脂肪,如附睾的腹膜后,和肠系膜脂肪,下定了决心。老鼠被放血牺牲在乙醚麻醉,收集和腹腔内脂肪和体重。附睾的脂肪得到在这尸体剖检被用于评价脂肪细胞大小和葡萄糖氧化和mRNA表达实验。因为数量足够的脂肪很容易收集,附睾的脂肪被用于实验。
2.4。脂肪细胞大小
细胞大小的附睾的脂肪在12周的年龄决定。细胞数量的固定视图区域3不同区域/鼠。细胞与视图框架不完整的形状没有统计。细胞大小估计固定面积除以细胞数量。
2.5。葡萄糖氧化
葡萄糖氧化水平在附睾的脂肪在12周的年龄测定。脂肪组织样本中孵化汉克斯平衡盐溶液(pH值7.4,GIBCO,宏伟的岛,纽约,美国)含4% BSA(牛血清白蛋白,σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国),20.72 kBq /毫升(U) -14比较(美国欧宁,波士顿,MA)和0 - 100亩/毫升胰岛素(从牛胰腺,σ)120分钟37°C。合成14有限公司2被困在Scintilamine-OH (Dojindo、东京、日本)滤纸(绘画纸,梅德斯通,英国),用液体闪烁计数分析仪型号2500 TR(美国梅里登帕卡德,CT)。总脂质合成的葡萄糖被确定数量的估计14C纳入总脂质。总组织的脂质提取后与正己烷的多尔的解决方案(2-propano
l
:
n
-heptan
e
:
1
N H2所以4=
40
:
10
:
1
)。放射性的己烷分数用液体闪烁计数器测量。
2.6。信使rna量化实时定量PCR
附睾的脂肪的总RNA提取卫星组大鼠在12周的年龄。RNA转录成cDNA使用M-MLV逆转录酶和随机引物(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。反应混合物是孵化10分钟25°C, 1小时在37°C, 5分钟在95°C。实时PCR量化进行了50
μ
L反应混合物与自动序列检测器结合ABI棱镜7700序列检测系统软件(应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)。合成的反应混合物包含50 ng cDNA、3.5毫米MgCl2,0.3
μ
0.1 M引物,
μ
1.25 M探针,单位Ampli Taq黄金。循环参数10分钟在95°C,紧随其后的是40个周期95°C的15秒和60秒60°C。以下引物和FAM-conjugated探测器被设计使用底漆表达软件(应用生物系统公司):葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4) (CTACATCCGAACCTGGAG向前;相反,AGTGCATCAGACACATCAGCCC;探测器,TGCCCGAAAGAGTCTAAAGCG)、肿瘤坏死因子
α
(肿瘤坏死因子
α
)(CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA向前;相反,CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC;探针、CCCGACTATGTGTGCTCCTCACCCACA)、脂蛋白脂肪酶(LPL) (TGTCTAACTGCCACTTCAACCACA向前;相反,CATACATTCCTGTCACCGTCCA;探测器,CAGCAAAACCTTTGTGGTGATCCATGG),乙酰辅酶a羧化酶1 (ACC-1) (GCAGCTATGTTCAGAGAGTTCACC向前;相反,CCACCTCACAGTTGACTTGTTTTC;探针,CGGCGACTTACGTTCCTAGTTGCACAAAA)和18秒rRNA(从应用生物系统公司购买)。
2.7。统计分析
结果表达的意思
±
标准偏差(SD)。统计分析的平均值之间的差异进行了使用野生,其次是学生的
t
以及或Aspin-Welch
t
以及。差异被定义为重要
P
<
。
05年
。
3所示。结果
3.1。生物参数
体重在SDT肥老鼠已经升高的价格相比SDT老鼠在这个实验的起始点,6周的年龄(平均值:SDT肥老鼠,207克;SDT老鼠,174克)。体重脂肪组在12周的年龄有显著提高的价格相比SDT集团,而体重Fatty-PF组显示类似的年龄变化在12和24周的SDT组(图
1(一))。
身体重量的变化(a)和血清参数((b)葡萄糖;(c)甘油三酸酯;(d)胰岛素;瘦素(e);(f)脂联素在脂肪老鼠,Fatty-PF老鼠,SDT老鼠。体重在Fatty-PF老鼠也显示出了类似的变化,在SDT老鼠。高血糖和高甘油三酯血症在脂肪老鼠暂时提高了食品的限制,和高胰岛素血维持到12周的年龄。血清中瘦素和脂联素水平升高Fatty-PF老鼠。数据表示方法
±
SD (
n
=
5
6)。*
P
<
。
05年
,* *
P
<
。
01
:从SDT鼠明显不同。
血清葡萄糖水平在SDT肥老鼠已经升高的价格相比SDT老鼠在6周的年龄(平均值:SDT肥老鼠,313 mg / dL;SDT老鼠,158 mg / dL)。脂肪组血清葡萄糖水平升高在12和600 - 700 mg / dL 22周的年龄。Fatty-PF组血清葡萄糖水平抑制类似水平的SDT组在12周的年龄,而葡萄糖水平升高到550 mg / dL年龄(图22周
1 (b))。高甘油三酯血症脂肪组在实验期间持续。Fatty-PF组血清TG水平往往是在12周的年龄而下降,脂肪族(平均值:Fatty-PF集团271 mg / dL;脂肪族,548毫克/分升;参见图
1 (c))。高胰岛素血脂肪组在6周的年龄,然而,经过12周的年龄,胰岛素水平下降到一定程度类似于SDT组(图
1 (d))。高胰岛素血Fatty-PF组维持到12周的年龄。SDT肥老鼠血清中瘦素水平是升高的价格相比SDT老鼠在6周的年龄(平均值:SDT肥老鼠,10.0 ng / mL;SDT老鼠,2.2 ng / mL)。Fatty-PF组中的高程持续在实验期间(图
1 (e))。血清脂肪组织瘦素水平也倾向于增加。Fatty-PF组血清脂联素水平显著增加12和年龄(图22周
1 (f))。脂肪组织的脂联素水平显著增加在22周的年龄,但是在这个实验的起点水平往往是增加的价格相比SDT组。
食品限制SDT脂肪高血糖大鼠诱导时间改善和增加血清中瘦素和脂联素水平。
3.2。脂肪组织的重量
在6周的年龄,总脂肪重量,内脏脂肪重量的总和,皮下脂肪重量,大约5倍的SDT肥老鼠比SDT老鼠。每组的脂肪重量升高与老化,6 - 22周的年龄。脂肪重量和V / S比率在6周的年龄可比脂肪族和Fatty-PF组。在12周的年纪,总脂肪重量在两组类似的水平(平均值:脂肪组,87.1克;Fatty-PF组,87.8 g),但内脏脂肪重量和V / S比值Fatty-PF组相比减少与脂肪族(平均值的内脏脂肪重量或V / S比值:脂肪组织,47.9克或1.29;Fatty-PF组,37.0克或0.75;见表
1,图
2)。此外,皮下脂肪重量Fatty-PF组增加的价格相比脂肪组织。类似的变化观察到22周的年龄,但变化不显著(表
1)。
计算机断层扫描分析12周的年龄(代表x线断层照片)。(一)肥老鼠;(b) fatty-PF老鼠;(c)项老鼠。黄色:皮下脂肪;红色:内脏脂肪;蓝色:精益。在肥鼠内脏脂肪面积减少了食物的限制。
检查腹腔内脂肪体重在12周的年龄,附睾的和腹膜后脂肪重量Fatty-PF组在12周的年龄而减少的脂肪组织,而两组之间的肠系膜脂肪重量没有变化(表
2)。
食品限制SDT脂肪大鼠诱导减少内脏脂肪重量和V / S比值。
3.3。脂肪细胞大小
脂肪细胞脂肪组在12周的年龄大小约为2.3倍,在SDT集团(的意思
±
SD:脂肪组织,8059年
±
1967年
μ
米2;SDT集团,3553年
±
341年
μ
米2)。脂肪细胞大小Fatty-PF组(的意思
±
SD: 6080
±
355年
μ
米2)往往是下降了约25%,相比之下,在SDT组(图
3)。
食品限制SDT脂肪大鼠诱导脂肪细胞大小的小型化。
3.4。葡萄糖氧化
基葡萄糖氧化水平和刺激葡萄糖氧化水平SDT肥老鼠的脂肪组织倾向于减少相比与SDT老鼠(图
4),特别是在100纳米胰岛素,减少葡萄糖氧化的脂肪族是很有意义的。葡萄糖氧化水平Fatty-PF组恢复到类似的水平在SDT组。
食品限制SDT脂肪大鼠诱导脂肪组织的代谢功能的改进。
3.5。在脂肪组织mRNA的表达
GLUT4和ACC-1 mRNA水平之间的脂肪族和SDT组没有变化,而那些Fatty-PF组水平升高与脂肪族(数据
5(一个)和
5 (b))。脂肪组织LPL mRNA水平增加的价格相比SDT集团和Fatty-PF组的水平,此外,升高(图
5 (c))。肿瘤坏死因子
α
mRNA水平的脂肪族倾向于增加的价格相比SDT集团,而脂肪族和Fatty-PF组之间的水平并没有改变(图
5 (d))。
ACC-1 GLUT4 (a) (b), LPL (c)和肿瘤坏死因子
α
(d)的mRNA水平附睾的脂肪在12周的年龄。mRNA表达都是衡量一个实时定量PCR方法。与18秒rRNA mRNA水平纠正。数据表示方法
±
SD (
n
=
6
)。#
P
<
。
05年
:从SDT肥鼠明显不同。
4所示。讨论
SDT老鼠,这是一个模型nonobese 2型糖尿病,成立于1997年由筱原et al。
2]。河鼠自发高血糖和葡萄糖耐受不良引起的胰岛素分泌减少由于
β
细胞变性(
12]。有趣的是,SDT老鼠显示眼部并发症,如静脉扩张和蜿蜒的血管网络,它是由高血糖引起的(
4]。也报道,SDT老鼠是有用的作为一个糖尿病肾病模型(
13]。最近,Masuyama et al。
1]介绍了SDT肥老鼠
足总Zucker等位基因的老鼠脂肪SDT老鼠基因组。SDT肥老鼠表现食欲过盛、肥胖、高血糖和高脂血症。5周的肥老鼠患糖尿病的年龄,一个开发时间非常早于SDT老鼠(
5]。早期发病率或进展的糖尿病被认为是由食欲过盛引起的,这与瘦素信号引入引起的异常
足总等位基因。在这项研究中,我们调查的影响食物限制bloodchemical参数和脂肪组织在SDT肥老鼠。
在食物限制,身体重量的脂肪族被监管类似水平的SDT组(图
1(一))。老鼠Fatty-PF组显示改善高血糖和TG水平是下降的趋势在12周的年龄(数字
1 (b)和
1 (c))。这些改进在葡萄糖和TG水平也报道food-regulated条件下Zucker糖尿病性脂肪肝大鼠(
14)和食品限制OLETF大鼠(
15]。此外,食物限制在正常大鼠(Wistar鼠)没有显示降低影响空腹血糖水平,而空腹血浆胰岛素水平下降(
16]。Fatty-PF组的改善并不是不断观察,观察和葡萄糖的高程和TG水平在22周的年龄(数字
1 (b)和
1 (c))。自从SDT脂肪大鼠胰腺功能的可能的弱点(
1),认为胰岛素分泌恶化,和糖尿病的发病率在老鼠不能单靠食物限制抑制。Fatty-PF组血清胰岛素水平下降到一个类似的水平在SDT脂肪族(图22周的年龄
1 (d))。同时,海拔TG水平22周Fatty-PF组的年龄被认为是由胰岛素缺乏引起的。血清中瘦素水平和血清脂联素水平在SDT肥老鼠增加了食品限制(数据
1 (e)和
1 (f))。据报道,血浆瘦素水平下降,和血浆脂联素水平增加了食品限制Wistar鼠和OLETF大鼠(
15,
16]。脂联素水平的变化与我们研究的结果是一致的,但是瘦素水平的变化与我们的结果不一致。因为存在瘦素抵抗SDT肥老鼠,血清中瘦素水平可能不是限制减少了食物。此外,血清中瘦素水平的提高food-restricted SDT肥老鼠被认为是由于皮下脂肪的增加体重(表
1)。另一方面,血清脂联素水平的增加food-restricted SDT肥老鼠被认为是相关的减少内脏脂肪重量。调查食品的影响限制在SDT肥老鼠,生化参数的时间改善高血糖和增加adipokine水平观察。尤其是改善高血糖是部分,原因被认为是与SDT老鼠的背景因素。
在脂肪组织权重分析pair-feeding SDT肥老鼠,内脏脂肪或V / S比值显著降低,而皮下脂肪倾向于增加与SDT肥鼠相比(表
1)。据报道,总脂肪重量,包括内脏脂肪和皮下脂肪,减少了食物限制在正常大鼠(
16- - - - - -
18),OLETF大鼠(
15),和Zucker肥老鼠
19]。内脏脂肪的变化在我们的研究在一些报道结果一致,但皮下脂肪量的变化在我们的研究结果不一致的一些结果。这些改变脂肪组织的重量在这个研究与thiazolidinediones(类似于治疗后的变化
20.,
21]。吡格列酮治疗后,皮下脂肪面积增加,而内脏脂肪面积和内脏比皮下脂肪减少
20.,
21]。在人类肥胖、腹部内脏和皮下脂肪的贡献是广泛注意
22,
23]。有一种强烈的内脏肥胖和胰岛素抵抗之间的联系的葡萄糖稳态模式,包括2型糖尿病(
24,
25]。此外,内脏脂肪与原发性高血压,血脂异常,和心血管疾病
26,
27]。评价模式的脂肪分布在SDT阐明脂肪老鼠被认为是非常重要的病理生理特征在人类肥胖。
根据CT分析在6、12和22周的年龄,我们显示显著差异在内脏脂肪比皮下脂肪(表12周的年龄
1)。所以我们调查了脂肪体重,脂肪细胞大小,葡萄糖氧化和量化mRNA在这个年龄。检查腹腔内脂肪重量,附睾的和腹膜后脂肪重量的SDT脂肪老鼠减少食品限制为6周,而肠系膜脂肪体重没有变化(表
2)。附睾的腹膜后脂肪重量Wistar鼠和OLETF大鼠已经减少了食物限制(
15,
16]。此外,在OLETF大鼠肠系膜脂肪重量降低食物限制为12周。肠系膜脂肪体重的减少可能不是由食物限制为6周,这是一个条件在我们的研究中。
脂肪细胞大小的SDT肥老鼠倾向于减少食物限制(图
3)。据报道,减少能量摄入,也就是说,限制食物摄入,诱发小型化Sprague-Dawley老鼠的脂肪细胞(
28,
29日]。一般来说,食物限制被认为是诱导增加小老鼠的脂肪细胞的数量。此外,据报道,脂肪细胞大小的小型化引发血浆脂联素水平的增加
30.]。血清脂联素水平的增加可能在pair-feeding老鼠(图
1 (f)小型化)诱导的脂肪细胞的大小。
胰岛素在pair-feeding SDT stimulated-glucose氧化脂肪老鼠被升高的价格相比SDT肥老鼠(图
4),并认为葡萄糖代谢功能项限制脂肪老鼠被提拔为食物。葡萄糖利用率指标和葡萄糖代谢指标的腹膜后和附睾脂肪组织已经在food-restricted Wistar鼠也增加了(
16,
17]。因为据报道,胰岛素stimulated-glucose氧化提高了增强胰岛素敏感性(
31日),经济复苏的葡萄糖氧化food-restricted SDT肥老鼠可能是由于glicolipid异常的改善,如血清葡萄糖水平的降低和TG水平(数字
1 (b)和
1 (c))。另外,血瘦素水平和脂联素水平的增加被认为是诱导好对脂肪组织的代谢功能的影响(
16,
32- - - - - -
35]。此外,GLUT4 LPL和ACC mRNA表达pair-feeding SDT肥老鼠增加(图
5)。据报道,这些mRNA表达在脂肪组织增加了胰岛素治疗(
36,
37]。自从pair-feeding SDT脂肪大鼠的血清胰岛素水平增加(图12周的年龄
1 (d)),这些信使rna表达的高程的增加被认为是引起胰岛素水平。此外,这些信使rna表达的高程的另一个原因是强化食品限制(图的胰岛素敏感性
4)。减少肿瘤坏死因子
α
mRNA表达,增加GLUT4 mRNA的表达与thiazolidinediones治疗所示(
38,
39),但肿瘤坏死因子
α
信使rna表达并没有改变在这个研究(图
5 (b))。虽然这评价使用附睾的脂肪,脂肪组织是由使用其他脂肪组织的进一步检查可能是至关重要的。在调查的影响食品限制脂肪组织在SDT肥老鼠,减少内脏脂肪重量和观察脂肪细胞大小的小型化。此外,食品限制诱导脂肪组织的代谢功能的改进。
食品限制SDT老鼠脂肪部分改进的醣脂类参数和诱导减少内脏脂肪重量。此外,食物的限制影响了脂肪细胞大小和脂肪组织的代谢功能。总之,SDT肥老鼠是一个有用的模型来评估功能或脂肪组织的形态学特征和开发一个典型的新药物。