1。介绍
牛初乳是一种不透明的白色液体是一种天然的营养来源。五个主要组件在牛初乳水、脂肪、蛋白质(如——酪蛋白、白蛋白和球蛋白)、糖(本质上是乳糖),和矿物盐。因为牛初乳容易变质,它有时被加工成乳制品。最耐用的牛初乳是牛初乳奶粉,这是由脱水生牛初乳。在发展中国家,牛初乳奶粉是一种重要的蛋白质来源在人们的日常生活。酪蛋白和乳清蛋白的不同主要在疏水性和丰富。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质,和包含大约80%的总蛋白质含量的休息,20%,乳清或血清蛋白(
1,
2]。乳清蛋白显示不同的结构特点和胺基酸组成,具有高营养水平。乳清蛋白含有alphalactalbumin (
α洛杉矶),betalactoglobulin (
βlg)、免疫球蛋白、乳铁蛋白和牛血清白蛋白(
3]。Alphalactalbumin (
αla)和betalactoglobulin (
βlg)是两种生产牛初乳乳清蛋白,特别是乳腺上皮细胞只有在哺乳期(
4]。作为一个单体,alphalactalbumin (
αla)和betalactoglobulin (
βlg)强烈结合钙和锌离子,可能具有杀菌或抗肿瘤活性
5]。
高效毛细管电泳(HPCE),即毛细管电泳(CE)是一种快速分析技术。这种技术已经广泛应用于蛋白质和aminofacid很多年了。由于吸引优势分离效率和分辨率,少量的溶剂和样品,CE迅速被应用在蛋白质分离分析领域。
很长一段时间,matrix-assisted功能的激光解吸/电离质谱(MALDI)蛋白质的快速评估证明。此外,它也被测试在乳制品行业是一个有效的工具。虽然技术不确定的确切浓度牛初乳蛋白质,几种主要的相对比例牛初乳蛋白质可以被识别。在这个实验中,牛初乳的一部分粉水化与水。另一个部分是分离与CPE法和可检测差异谱光谱被发现。
目前的工作描述alphalactalbumin (
αla)和betalactoglobulin (
βlg)补液牛初乳奶粉被成功分离的浊点萃取使用非离子表面活性剂Triton x - 114。分离主要是基于他们的对比疏水性,和我们的主要目标是实现的最高浓度alphalactalbumin (
αla)和betalactoglobulin (
βlg) surfactant-poor阶段获得CPE方法的效率高。因为这些蛋白质分离使用CPE取决于几个变量,如类型和表面活性剂的浓度、pH值、净电荷、大小和样本体积(
6,
7),优化设计是在(
8]。matrix-assisted激光解吸电离时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)是用来证实alphalactalbumin分离(
αla)和betalactoglobulin (
βlg)补液的牛初乳奶粉。
2。材料和方法
2.1。材料
牛初乳奶粉(Sunlife牛初乳粉)是在当地购买的中国市场。实验中使用的所有的水Milli-Q去离子水(美国微孔,Billerica的)。乙腈(高效液相色谱级)从SK化工(韩国蔚山、韩国)。的
α-cyano-4-hydroxycinnamic酸(CHCA)从应用生物系统公司(美国CA福斯特城)。三氟乙酸(组织)是获得Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。三(羟甲基)甲胺、盐酸acid-HCl,钠chloride-NaCl isooctylphenyl醚(Triton x - 114)和蔗糖获得Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。
2.2。优化策略
有四个因素的优化研究实验。特里同x - 114浓度的因素、样品体积,氯化钠和蔗糖浓度,和博士表面活性剂溶液制备10更易与L Tris-HCl (pH值7.4),150更易与L氯化钠和6% (w / v)蔗糖(
8]。200年
μL牛初乳样本添加到表面活性剂解决方案,解决方案是均质。最后,样本离心机在1780 g×15分钟。表面活性剂在下一步中可怜的阶段进行了分析。在所有实验的温度是25°C。
2.3。毛细管电泳(CE)
CE使用P / ACE最小检测量进行毛细管电泳系统(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)正极性下分离模式。毛细管(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)和50厘米有效长度(60厘米),内径75(身份证)
μ使用m的外加电压25 kV 20°c .首次使用毛细管之前,一个冲洗1分钟(psi) 30日以0.1 mol / L盐酸。冲洗10分钟(30 psi)然后执行运行缓冲平衡毛细管10分钟(25 kV)。最后的冲洗10分钟(30 psi)进行分离毛细管柱是恒温器的温度在20°C。
在每个运行中,毛细管与0.1 mol / L盐酸清洗0.5分钟,然后与电泳缓冲1.5分钟。分离缓冲是50毫米柠檬酸缓冲(pH值3.0),和应用25 kV电压。电泳缓冲是透过0.22
μ过滤器在使用前。样品溶解在1毫升的缓冲区和过滤[0.22
μCE分析m(微孔)]。样本注入毛细管使用压力0.5 psi 10年代。的吸光度测定波长214 nm的检测的蛋白质。
2.4。MALDI-TOF样品制备
准备一个饱和溶液CHCA矩阵:10毫克干CHCA矩阵是添加到管包含1毫升水的解决方案/乙腈/ 0.1%组织(4/5/1,v / v / v)。管是漩涡彻底1分钟,然后离心1分钟。0.5
μL(样本/矩阵(1/5,v / v)每口井的混合物被发现在一个不锈钢MALDI样板。
2.5。质谱分析
所有的谱测量进行4700蛋白质组学分析仪(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)配备一个Nd: YAG激光操作在200赫兹(355海里)。离子形成的脉冲激光光束被加速到20公斤伏在正离子线性模式740 ns的延迟时间。容器的大小被设置为10 ns。输入带宽设置为25兆赫。收购方法设置如下:60 subspectra获得在一个地方,是平均每subspectrum 25杆,所以谱谱是1500镜头的积累光谱/现货。对于每一个样本,五是同样发现和检查,采集方法运行三次。最后数据的削减意味着这15个并行测试的结果作为一个整体。这仪器操作参数优化离子峰对应apomyoglbin(马,m / z 16952),硫氧还蛋白(
E。
杆菌、m / z 11674)和胰岛素(牛,m / z 5734)。
3所示。结果与讨论
3.1。CE分析方法和结果
强调从牛初乳乳清蛋白质的提取和分离酪蛋白由浊点萃取蛋白质,CE是用于识别
α乳白蛋白和
β乳球蛋白从补液的牛初乳中提取粉。标准的重复和浊点萃取样品从牛初乳的补液粉如图
1(一)和
1(b)和图
1分别(c)。的保留时间
α乳白蛋白和
β乳球蛋白是大约10和15分钟的最佳分离条件。在图
1(c),只有两个乳清蛋白峰(
α乳白蛋白和
β乳球蛋白)。与女士MALDI-TOF证明是正确的在接下来的实验。从图
1(c),这也证明了萃取过程的效率是成功的。
标准物质的重复和补液的牛初乳浊点萃取后粉。有alphalactalbumin (a), betalactoglobulin (b),和样例(c)。
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3.2。MALDI-TOF女士分析
强调从牛初乳乳清蛋白质的提取和分离酪蛋白蛋白质通过CPE, MALDI-TOF女士完好的样品两个蛋白质分数应用。一个简单的样品处理,只有涉及到稀释的沉淀蛋白质。图
2(一个)显示获得的质谱,它总结了不同蛋白质在表面活性剂贫穷和水阶段。理论摩尔质量是在协议与前所述整个牛牛初乳蛋白分析MALDI-TOF女士。
MALDI-TOF质量光谱的牛初乳奶粉样品稀释用水补液(a)和牛初乳浊点萃取后粉(b)。
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的质谱图
2(一个)显示离子ca.m / z11958和23919对应
α酪蛋白和
β分别酪蛋白。这些离子在图
2 (b)更高的m / z值对应
α乳白蛋白(m / z14152)和
β乳球蛋白(m / z18318)。最后,离子ca.m / z 14152图
2 (b)可能对应于物种来自乳糖之外
α乳白蛋白。表面活性剂的主要蛋白质识别贫困阶段(图
2 (b))
α乳白蛋白和
β乳球蛋白,分数的乳清蛋白
2]。除了这些蛋白质,
α酪蛋白和
β酪蛋白也发现在水相。事实上,去年还存在蛋白质的两亲性角色(
4,
5],确凿的存在表面活性剂可怜的阶段。
4所示。结论
CPE运用效率是奶牛牛初乳样品能够提取和分离乳清和酪蛋白蛋白质只使用200年
μL的样本体积、样品体积没有任何样品预处理。特里同x - 114 (1%, w / v), 150更易/ L氯化钠、蔗糖(6%,w / v) 7.0 pH值用于蛋白质的分离。在这样的条件下,获得了良好的分配系数,使分离
α乳白蛋白和
β乳球蛋白(表面活性剂中贫困阶段)从酪蛋白蛋白质(水相)中只有15分钟,用最小的成本,表明该因子设计已成功应用于实验领域工作,这项工作的主要目的。虽然得到分配系数,评论是很重要的,一些疏水蛋白质在表面活性剂可怜的阶段,反之亦然,演示了通过MALDI-TOF MS分析。浊点萃取后,毛细管电泳用于检查提取过程的效率。结果已经有效地证实了表征与matrix-assisted激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。最后,采用策略也可用于分离这些观察牛初乳中蛋白质后适当优化CPE法等任务。