JAMC 化学分析方法杂志 2090 - 8873 2090 - 8865 Hindawi出版公司 254391 10.1155 / 2012/254391 254391 研究文章 1H和 13C NMR在细胞毒性3中的作用 年代1、2、3,4-Tetrahydro - β -carboline-3- carboxyacid Cichorium endivia 王 Fu-Xin 邓 An-Jun 魏 进锋 秦 Hai-Lin 王 艾平 魏 冯 1 药物研究所 中国医学科学院和北京协和医学院 北京100050年 中国 imm.ac.cn 2012 16 12 2012 2012 17 09 2012 26 11 2012 2012 版权所有©2012王福新等。 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放存取的文章，它允许在任何媒体上无限制地使用、传播和复制，只要原始作品被适当地引用。

氨基酸，3 年代1、2、3,4-tetrahydro - β-carboline-3-carboxylic acid为首次从黄叶中分离得到 Cichorium endivia．它的完全分配1H和13在大量的1D和2D NMR实验的基础上，首次进行了C NMR光谱数据。首次评价了该化合物对HCT-8和HepG2人肿瘤细胞株的细胞毒性，发现有中等活性。

 1.介绍

Cichorium endivia菊科蔬菜是一种受欢迎的菊科蔬菜，在世界各地广泛种植和食用。它受欢迎的另一个原因是它的健康特性，主要是提供抗氧化活性[ 1， 2］．但到目前为止，对该植物的植物化学研究还很少，据我们所知，仅有几篇文章报道过几种化合物，其中包括我们小组的5种[ 3.］．这项正在进行的研究旨在确认这种受欢迎的蔬菜中的生物活性化合物，以及一种流行的和已知的氨基酸 年代1、2、3,4-tetrahydro - β -carboline-3-carboxylic酸( 1)，第一次被分离。通过文献调查，可以得知，完成了核磁共振数据的赋值 1由于溶解度差，到目前为止没有获得实际的导电 1在最普遍的溶剂中，引起文献引用的明显的混乱状态[ 4， 5］．在本文中，我们描述了1H和13核磁共振波谱数据 1基于优化溶剂的确定和广泛的1D和2D NMR实验。一项关于化合物的细胞毒性的研究 1对人肝癌细胞株HCT-8和HepG2的抑制作用 1通过适度降低被试的生存能力来抑制细胞生长。

 2.结果与讨论

复合 1为无定形淡黄色粉末(MeOH/H2O)。其正离子ESI-MS谱显示m/z 217.1处有准分子离子峰[m +H]。+和239.1 [M + Na]+，其分子式确定为C12H12N2O2通过正模式HRESI-MS实验中m/z 217.0967的准分子离子峰[m +H]+．红外光谱表现出强烈的吸收 υ 马克斯 3284、3019、1642、1598、1452、1409、740厘米−1，表明存在1,2-二取代苯基团和不稳定氢。初步鉴定为3 年代1、2、3,4-tetrahydro - β -3-羧酸的比较1在DMSO-d中获得的核磁共振波谱数据6具有文学价值[ 4， 5]，但一些明显的错误或不一致是明显的，包括耦合常数和数据所有权(表 1）.而获得13在DMSO-d核磁共振溶剂中的C NMR谱6由于上述水溶性很差，化合物 1然后记录D2O + F3.CCOOD是一种很好的溶剂 1．的1核磁共振氢谱数据也清楚地显示了1,2-二取代苯基团的存在，四个诊断信号来自于一个芳香ABCD自旋系统的共振 δ H 7.13 (1 h, t, J ＝ 7 .6 Hz, H-6)， 7.22 (1H, t， J ＝ 8．0 Hz, H-7)， 7.43 (1H, d， J ＝ 8．0 和7.53 (1H, d， J ＝ 8．0 Hz, H-5)，与在 δ C HSQC谱分别为120.0 (C-6)、122.9 (C-7)、111.9 (C-8)和118.2 (C-5)。此外，在 δ H 4.38 (1 h, d, J ＝ 15 h - 6赫兹,一个)， 4.54 (1H, d， J ＝ 15.6 h -赫兹,b)， 4.27 (1H, dd， J ＝ 10．4 ， 5.6 Hz, H-3)， 3.13 (1H, dd， J ＝ 10．8 ， 16.4 Hz, H-4一个)和3.38 (1H, dd， J ＝ 5．6 ， 16.4 Hz, H-4b)也被审查1H NMR谱图，根据它们的耦合常数和借助1H,1H-COSY谱分别由一个孤立亚甲基的AB自旋体系和一个亚甲基和一个甲基的ABX自旋体系组成 年代 p 3. 杂化键。这三个官能团明显脱屏蔽，并与对应的碳信号相关联 δ C HSQC谱分别为40.5 (C-1)、55.0 (C-3)和21.7 (C-4)。简单地说，这三组人被安排为其中一组 年代 p 2 杂化的碳原子或氮原子1H和13核磁共振化学位移和检查13C和DEPT NMR数据显示十二个碳信号与两个脂肪族亚甲基，一个脂肪族甲基，四个 年代 p 2 杂交蛋氨酸，还有5个 年代 p 2 杂化季碳的分类(表 1）.除上述三个脂肪族碳外，上述核磁共振数据与一个苯基、一个四取代乙烯和一个羰基均相容。长范围1H,13C-correlations从 δ H 7.53 δ C 104.9, 125.6, 136.7和122.9，从 δ H 7.43 δ C 122.9、120.0和125.6，从 δ H 7.22 δ C 111.9, 136.7和118.2，来自 δ H 7.13 δ C 118.2, 125.6, 122.9和111.9，从 δ H 4.38和4.54至 δ C 125.4, 104.9和55.0，从 δ H 3.13和3.20到 δ C 104.9, 55.0, 171.3, 125.6/125.4，从 δ H 4.27 δ C 171.3, 40.5, 21.7和104.9建立了宪法公式 1如图所示 1．表中列出了NMR数据的完整分配 1．

1H和13化合物的核磁共振波谱数据 1．

数量 δ H ab δ C 交流 δ H 德 δ H d ［ 4］ δ H d ［ 5］ δ C d ［ 5］
1 4.38 d (15.6) 40.5吨 4.15 d (15.3) - - - - - - - - - - - - 40.3
1 b 4.54 d (15.6) 4.23 d (15.9) 4.22 d (4.8) - - - - - -
3. 4.27 dd (10.4, 5.6) 55.0 d 3.60米 3.14 - - - - - - 55.3
4 3.13 dd (10.8, 16.4) 21.7吨 2.81 dd-like 2.83 ddd (10.5, 5.0, 2.4) - - - - - - 18．0
4 b 3.38 dd (5.6, 16.4) 3.13 br想 3.69 dd (10.5, 5.0) - - - - - -
4“ 104.9秒 104.3
4 b” 125.6f年代 128.5
5 7.53 d (8.0) 118.2 d 7.32 d (7.5) 7.33 d (8.0) 7.38 d (8.2) 118.5
6 7.13吨(7.6) 120.0 d 7.06吨(7.5) 7.08吨(8.0) 7.06吨(8.2) 117.5
7 7.22吨(8.0) 122.9 d 6.97吨(7.8) 6.99吨(7.5) 6.96吨(8.2) 121.1
8 7.43 d (8.0) 111.9 d 7.43 d (7.5) 7.44 d (7.5) 7.44 d (8.2) 111.8
8 136.7秒 136.1
9 125.4f年代 - - - - - -
羧基 171.3秒 10.91秒 10.93秒 - - - - - - 165.6
9-NH - - - - - - 10.66秒

一个D2O + F3.CCOOD;b400 MHz。c100 MHz。d在DMSO-d6；e300 MHz。f作业可以交换。

化合物的结构 1和关键的HMBC(→:H→C)相关性。

关于化合物的评价 1由于其对两种人类癌症细胞系的细胞毒性作用，使用硫代霍丹明B (SRB)测定细胞生长。三个重复的方法的结果用存活率比阴性对照的百分比表示。复合 1对HCT-8和HepG2细胞表现出中等的细胞毒性，当浓度为140时，48小时后HepG2和HCT-8细胞活力分别为80.42%和80.22%，72小时后分别为76.14%和71.48% μ克/毫升。其他时间点的存活率相对较低。

 3.实验 3．1.一般的实验程序

红外光谱在Nicolet 5700谱仪上得到。1D和2D NMR谱记录在Mercury-400或MERCURY-300 NMR谱仪上。化学变化( δ )，以四甲基硅烷(TMS)为内标( δ 0.00)。ESI-MS和hesi - ms在安捷伦1100系列LC-MSD-Trap-SL光谱仪上测定。RP-18 (YMC-GEL, ODS-A, 12 nm, S-50 mm;采用柱层析法(YMC Co.，京都，日本)。溶剂为分析级，购自北京化工公司(中国北京)。

 ３．２．植物材料

Cichorium endivia2009年7月购于北京新发地农产品批发市场，经马林副教授(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所)鉴定。代金券标本保存于北京协和医学院中国医学科学院药物研究所新药安全评价中心。

 ３．３．提取和分离

风干并粉碎 c . endivia(5.8 kg)用95%乙醇(80 L, 2 h;70 L, 1 h;68升，1小时)。将组合的乙醇提取物真空蒸发，得到墨绿色残渣(1233 g粗乙醇提取物)，悬浮在80%乙醇溶液中。用石油醚(60-90°C, 2 L, 1.5 L, 1.5 L, 1.5 L)提取悬浮液。在真空中蒸馏水层也会产生深绿色的残留物(940g, 80%的乙醇提取物)。残渣用水重新溶解，用乙酸乙酯在分离漏斗中彻底分离。其余水溶性部分装入Daion HP-20色谱柱，H洗脱2O, 60% EtOH, 95% EtOH。60%乙醇洗脱液在真空中蒸发，得到黑色残渣(40 g)。

60%乙醇馏分在乙醇溶剂中重新溶解 n -BuOH, 5% NaHCO洗涤3.然后H2分别啊。蒸发的 n -BuOH在减压下得到5.5 g棕绿色残渣，用MeOH-H洗脱进入ODS-A色谱柱2O的极性降低(40%-100%)，得到化合物 1(108毫克)为淡黄色粉末。

3.3.1。3<italic>S</italic>-1,2,3,4- tetrahydro -<italic>β</italic>-carboline-3-carboxylic Acid (<bold><bold />1<bold /></bold>)

淡黄色的粉末。红外(KBr) υ 马克斯 (cm−1): 3284、3019、2849、1642、1598、1452、1409、1271、1221、740;1H和13C NMR波谱数据列于表中 1．ESI-MS(正模)m/z: 217.1 [m +H]+和239.1 [M + Na]+；HRESI-MS(正模式)m/z: 217.0967 [m +H]+(计算的C12H12N2O2217.0972)。

 3．4．细胞毒性试验

HCT-8和HepG2细胞在含0.22%碳酸氢钠、10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μ克/毫升链霉素。细胞在5% CO中培养2-空气在37°C。复合 11.4 mg/mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶解，使用前立即用RPMI1640培养基稀释至所需浓度。

采用SRB (sulforhodamine B)测定细胞活力。简单地说，将细胞接种于96孔板( 1 × 10 4 细胞/孔)常规培养24 h。复合 1添加到连续浓度(从14 μ克/毫升到140 μg/mL)，单独加入PBS作为阴性对照，继续孵育48 h。用TCA (0.4% m/v)固定板后，每孔加入SRB (1mg /mL)。孵育20分钟后，每孔用1% v/v的酸冲洗3次。然后分别在Tris (100 mmol/L)中加入孔。在515 nm处用微孔板分光光度计记录每个孔的吸光度。

 致谢

作者感谢马磊副教授对样品的鉴定。感谢国家天然药物生物活性物质与功能国家重点实验室和药物安全评价中心提供的研究细胞和设备。

 杜邦公司 m . S。 Mondin Z。 威廉姆森 G。 价格 k·R。 品种、加工和贮藏对莴苣菊苣类黄酮苷含量和组成的影响 农业与食品化学杂志 2000 48 9 3957 3964 2 - s2.0 - 0033804796 10.1021 / jf0002387 Llorach R。 Martinez-Sanchez 一个。 Tomas-Barberan f。 吉尔 m . I。 费雷尔 F。 5个莴苣品种和小叶莴苣多酚及抗氧化特性的研究 食品化学 2008 108 1028 1038 10.1016 / j.foodchem.2007.11.032 陈 c·J。 邓 a·J。 刘 C。 史 R。 秦 h·L。 王 答:P。 王亚南的活动 Cichorium endivia枸杞提取物及其化学成分 分子 2011 16 9049 9066 10.3390 / molecules16119049 彭 j . P。 乔 y Q。 姚 x。 从大叶葱中提取含氮化合物。和葱属植物 中国药物化学 1995 5 134 Yahara 年代。 使用Uda N。 Yoshio E。 Yae E。 番茄甾体生物碱苷( Lycopersicon esculentum） 天然产物杂志 2004 67 3. 500 502 2 - s2.0 - 1642424212 10.1021 / np030382x