IPIDgydF4y2Ba 跨学科视角传染病gydF4y2Ba 1687 - 7098gydF4y2Ba 1687 - 708 xgydF4y2Ba HindawigydF4y2Ba 10.1155 / 2019/4124865gydF4y2Ba 4124865gydF4y2Ba 研究文章gydF4y2Ba 病理学(H5N8)(进化枝2.3.4.4)病毒在实验感染鸡和老鼠gydF4y2Ba https://orcid.org/0000 - 0002 - 5349 - 8362gydF4y2Ba ProkopyevagydF4y2Ba 埃琳娜。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ZinserlinggydF4y2Ba Vsevolod。gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 英国宇航系统公司gydF4y2Ba You-ChangydF4y2Ba 4gydF4y2Ba KwongydF4y2Ba YongkukgydF4y2Ba 4gydF4y2Ba https://orcid.org/0000 - 0002 - 1931 - 2026gydF4y2Ba 整修gydF4y2Ba 奥尔加G。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba https://orcid.org/0000 - 0002 - 4561 - 6517gydF4y2Ba 水列夫gydF4y2Ba 伊万。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba KozhingydF4y2Ba 彼得·M。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba KomissarovgydF4y2Ba 安德烈gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba FadeevgydF4y2Ba ArtemgydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 彼得罗夫gydF4y2Ba 弗拉基米尔•gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba https://orcid.org/0000 - 0002 - 9734 - 0620gydF4y2Ba ShestopalovgydF4y2Ba 亚历山大·M。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba SharshovgydF4y2Ba 基里尔。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba MarquartgydF4y2Ba 玛丽E。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 的实验研究gydF4y2Ba 联邦基础和转化医学研究中心gydF4y2Ba 新西伯利亚630117gydF4y2Ba 俄罗斯gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 医疗部门gydF4y2Ba 新西伯利亚州立大学gydF4y2Ba 新西伯利亚630090gydF4y2Ba 俄罗斯gydF4y2Ba nsu.rugydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 实验医学研究所gydF4y2Ba Almazov国家联邦研究中心gydF4y2Ba 圣彼得堡197341年gydF4y2Ba 俄罗斯gydF4y2Ba iemrams.spb.rugydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 禽流感疾病部门gydF4y2Ba 动植物检疫机构gydF4y2Ba Gimcheon-si 39660gydF4y2Ba 韩国gydF4y2Ba qia.go.krgydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 病原学和流行病学gydF4y2Ba Smorodintsev研究所的流感gydF4y2Ba 圣彼得堡197376年gydF4y2Ba 俄罗斯gydF4y2Ba influenza.spb.rugydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 05年gydF4y2Ba 04gydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba 06gydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 2019年gydF4y2Ba 版权©2019埃琳娜·a·Prokopyeva et al。gydF4y2Ba 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。gydF4y2Ba

小说的出现高致病性禽流感病毒(HPAIVs)候鸟引起严重关切的问题,因为这些秋天迁移期间有可能传播病毒。我们报告的识别小说HPAIV (H5N8)进化枝2.3.4.4病毒隔离病国内鸭在商业农场10月份开始的第二波的传播,影响家禽(鸭子;chiсkens)在俄罗斯和一些欧洲地区2016年西伯利亚西部。实验感染的应变高度致命的鸡和小鼠IVPI = 2.34gydF4y2Ba 米gydF4y2Ba lgydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba = 1.3gydF4y2Ba 日志gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba ⁡gydF4y2Ba EIgydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 相应地,。接种的鸡HPAIV / H5N8 neuroinvasiveness, multiorgan失败和死亡的鸡gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba rgydF4y2Ba dgydF4y2Ba 一天后接种。病毒复制到所有器官收集样品高病毒滴度与效价最高的大脑(6.75±0.1 lgydF4y2Ba ogydF4y2Ba ggydF4y2Ba 10gydF4y2Ba TCIgydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba /毫升)。有效的病毒复制中发现了以下细胞:大脑的神经元和神经胶质细胞;肺的肺泡细胞和巨噬细胞;小肠上皮细胞;肝脏的肝细胞和枯否细胞;脾脏巨噬细胞和内皮细胞;和肾脏的肾小管上皮细胞。这些发现促进我们理解组织病理学的影响(H5N8) HPAIV感染。gydF4y2Ba

 俄罗斯科学基金会gydF4y2Ba 17-44-07001gydF4y2Ba 1。介绍gydF4y2Ba

不同的流感病毒在人类和动物病理学方面发挥重要作用。高致病性禽流感病毒(H5N1)全球家禽业造成相当大的经济损失和对公众健康构成严重威胁。大约20年前,一位/鹅/广东/ 1/1996 (H5N1)(简要Gs / Gd / 96),目前流行的H5N1病毒的进化枝2.3.4前体HPAIVs,第一次被孤立在养殖鹅三水,佛山,中国南方的农村地区gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba]。H5N1 HPAIVs并未消失,后来变异进一步蔓延到中东,欧洲,非洲。流感病毒和病毒传播的多样性之间的家禽和野生鸟类可能导致的外观(H5N8)进化枝2.3.4.4 Gs / GD-lineage HPAIV,它第一次出现在家禽疫情于2010年在中国(gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba),2014年在韩国国内鸭子和候鸟(gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba]。的广泛分布在两个暴发期间c HPAIVs形成2截然不同的族群(H5N8)病毒:A组(Buan-like)和B组(Gochang-like)。A组病毒成为主流在韩国gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba),随后被隔离在西伯利亚东北部2014年9月(gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba]。2016年,两波的病毒传播在俄罗斯报道:6月第一波开始在西伯利亚西部和水生鸟类的影响,而第二个波始于10月和影响家禽(鸭子;鸡)在俄罗斯和一些欧洲地区西伯利亚西部[gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba]。到目前为止,许多隔离(H5N8)已确定在北美,非洲,欧洲和继续造成野生鸟类和家禽中暴发(gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba]。病理病变HPAIV-infected鸟类是非常变量取决于很多因素,包括病毒株,主机物种,年龄和免疫状态和自然环境。然而,详细的病理学(H5N8) Gs / GD-lineage HPAIV如宿主适应、组织趋向性,病理病变,传染性、遗传性尚不清楚。这里我们研究的传染性和致病性(H5N8)进化枝(2.3.4.4)HPAIVs从西伯利亚,俄罗斯,在鸡。gydF4y2Ba

 2。材料和方法gydF4y2Ba 2.1。病毒gydF4y2Ba

国内鸭/ /西伯利亚/ 49羽毛/ 2016 (H5N8)(/ 49羽毛/ 2016),进化枝2.3.4.4,2016年10月被隔离病人家鸭的羽毛在西伯利亚的商业农场。10天的老鸡胚蛋的病毒传播和存储在-70°C。50%的鸡蛋感染剂量(gydF4y2Ba EgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 组织培养感染剂量)和50% (gydF4y2Ba TgydF4y2Ba CgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba )对MDCK细胞测定如前所述[gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 2.2。动物实验gydF4y2Ba

动物实验伦理委员会批准的联邦根本和转化医学研究中心(2017 - 15)。gydF4y2Ba

2.2.1。实验感染鸡的gydF4y2Ba

静脉注射致病性指数(IVPI)测试执行/ 49羽毛/ 2016世界动物卫生组织手册中描述(gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba]。十6 specific-pathogen-free (SPF)鸡静脉注射(iv)接种0.1毫升的1:10稀释感染性尿囊液(包含gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 6.0gydF4y2Ba EgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 的病毒)。鸡每天检查疾病的临床症状为10天。致病性指数计算的平均评分每只鸟的观察。gydF4y2Ba

脑、肺、肝、肾、肠、心脏、脾脏样本收集的三只鸟死后立即发生第三天接种(dpi)。收集一套完整的器官从鸟儿和中性缓冲福尔马林固定在10%,石蜡包埋,切片,染色与hematoxylin-and-eosin病理评估。重复的部分被免疫组织化学染色(包含IHC)方法来确定流感病毒抗原分布。简单,部分沾小鼠单克隆抗体抗甲型流感病毒核蛋白质的(mca - 400, AbD Serotec,杜塞尔多夫,德国),紧随其后的是一个生物素化的山羊anti-mouse免疫球蛋白二级抗体。结合抗体检测与avidin-biotin检测系统(亚利桑那州图森市Ventana医疗系统)。RedMap工具包(Ventana医疗系统)作为底物发色体。另一个重复的部分大脑、肺、心脏、肾脏、肝脏和脾脏被免疫荧光染色(如果有)。幻灯片是deparaffinized和水化。燥热引起抗原决定基检索进行了使用微波和10毫米柠檬酸钠缓冲渐变20 (pH值6.0)为0.05%。幻灯片洗2 * 5分钟在PBS Triton x - 100, 0.025%用PBS洗净,放置了40分钟到阻断缓冲区包含1% BSA在PBS。 Preparations were incubated for 1 hour at RT with primary mouse antibodies against influenza A NP (AA5H, Netherlands), then washed 3 times for 5 minutes in PBS, and incubated for 1h at RT with secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with fluorochrome AlexaFluor488 (Abcam, ab150105). Slides were washed 3 times for 5 minutes in PBS. Cell nuclei were contrasted with 5 μgydF4y2Ba4,6-diamino-2phenyl吲哚(DAPI),简要与去离子水清洗,并安装在FluoroShield安装介质。在激光扫描共焦显微镜图像捕获LSM710 / NLO(德国卡尔蔡司)。gydF4y2Ba

部分肺、脑、肠、肝、脾、肾脏也收集和均质1毫升PBS和离心机;上层清液的收集和病毒滴定MDCK细胞从最初1:10稀释。病毒滴度的计算是通过科伯技术Ashmarin-Vorobyov修改(gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba根据以下公式:gydF4y2Ba 日志gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba ⁡gydF4y2Ba TgydF4y2Ba CgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50 /毫升= lgDn -gydF4y2Ba δgydF4y2Ba(ΣLi - 0.5)gydF4y2Ba

Dn是最大效应的剂量;gydF4y2Ba

李井的数量的比例是与细胞病理效应的总数井感染剂量;gydF4y2Ba

我是剂量的数量;gydF4y2Ba

δgydF4y2Ba是病毒的对数稀释。gydF4y2Ba

2.2.2。实验感染的老鼠gydF4y2Ba

鼠标致死剂量(50%gydF4y2Ba 米gydF4y2Ba lgydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba )/ 49羽毛/ 2016确定的6雌性BALB / c小鼠(联邦预算研究机构国家病毒和生物科技研究中心向量,新西伯利亚,俄罗斯)。10组小鼠轻与乙醚麻醉在吸入混合物(2 - 4 %)和鼻内接种50gydF4y2Ba μgydF4y2Bal的磷酸缓冲盐(PBS)包含gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba EgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 的病毒。老鼠每天观察接种后14天内死亡。gydF4y2Ba 米gydF4y2Ba lgydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 当时科伯计算方法如前所述Ashmarin-Vorobyov修改。gydF4y2Ba

 2.3。测序和系统发育分析gydF4y2Ba

全基因组扩增等执行/ 49羽毛/ 2016病毒根据周et al。gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba]。Nextera XT样品制备用于获取图书馆下量代测序;全基因组序列得到使用Illumina公司MiSeq长度。完成基因组序列被提交给Epiflu GISAID数据库(gydF4y2Ba www.gisaid.org/gydF4y2Ba)。GISAID爆炸是用于分析应变的身份/ 49羽毛/ 2016。对齐和身份进行百分比计算乘以兆7 (gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

 2.4。对神经氨酸酶抑制剂的敏感性测定gydF4y2Ba

菌株的敏感性/ 49羽毛/ 2016对奥司他韦(瑞士罗氏公司,巴塞尔)是评价神经氨酸酶(NA)抑制化验之前报道(gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba]。短暂,病毒是标准化NA活动水平高10倍的背景下,以生产荧光产品从methylumbelliferyl-N-acetylneuraminic酸(MUNANA)衬底(Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国)。药敏资料测定钠抑制的程度与三倍孵化后连续稀释仙女虫属。50%抑制浓度(gydF4y2Ba 我gydF4y2Ba CgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba )确定的剂量反应曲线。gydF4y2Ba

这项工作涉及到设备的使用多路存取的中心“现代光学系统”的联邦根本和转化医学研究中心(俄罗斯新西伯利亚)。gydF4y2Ba

所有的方法都是按照指导方针和有关规定执行。gydF4y2Ba

 3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

2016年,一个在俄罗斯(H5N8)病毒广泛传播在两波。夏天第一波影响野生鸟类(大冠水鸟)在图瓦(西伯利亚),和秋天的第二波影响家禽(gadwall、鸭、鸡)在欧洲的几个地区俄罗斯(坟头,卡尔梅克共和国)和西伯利亚西部gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba]。GISAID和基因库核苷酸序列分析2016 - 2017年建议(H5N8)流感病毒是广泛和野鸟和家禽感染,因此造成哺乳动物和人类传播的风险。没有(H5N8)病毒的人类病例报道。然而,其患病率和多种野鸟和家禽中爆发全球范围使它成为一个严重的公共卫生问题。gydF4y2Ba

在西伯利亚西部早期监测我们孤立低致病性禽流感病毒从野鸭羽毛,这表明病毒传播很容易在鸟类在梳理(gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba]。因此,重要的是评估分离的病毒的致病潜力和分布在俄罗斯在第二波的传播。gydF4y2Ba

在这里,我们报告的数据/国内鸭/西伯利亚/ 49羽毛/ 2016 (H5N8)(/ 49羽毛/ 2016)这是孤立于2016年10月从国内鸭羽毛生病的。/ 49羽毛/ 2016病毒系统类似于(H5Nx)病毒(主要是(H5N8))孤立在俄罗斯2016 - 2017年期间如(H5N8)株/大冠水鸟/ Uvs-Nuur湖/ 341/2016 /常见燕鸥Uvs-Nuur湖/ 26/2016 /灰色鹭Uvs-Nuur湖/ 20/2016 / wild_duck /鞑靼斯坦/ 3059/2016,(H5N2)应变隔离在Kostroma(/鸡/ Kostroma / 1717/2017_PA)。在2016 - 2017年(H5N8)菌株基因密切相关的一个/ 49羽毛/ 2016也被隔离在欧亚大陆和非洲的许多国家(见表gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba)。程度之间的身份编码序列(编码区)的基因组片段(heterotrimeric聚合酶复杂PB1和PA的子单元,核蛋白(NP),神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(MP)和非结构蛋白(NS))高于俄罗斯的压力,这可能表明病毒的几个独立的介绍到俄罗斯。gydF4y2Ba

身份表。gydF4y2Ba

俄罗斯gydF4y2Ba 非俄罗斯gydF4y2Ba
应变gydF4y2Ba %的身份gydF4y2Ba 应变gydF4y2Ba %的身份gydF4y2Ba
PB2gydF4y2Ba / great_crested_grebe / Uvs-Nuur_Lake / 341/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.65gydF4y2Ba 埃及/ green-winged_teal / / 877/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.87gydF4y2Ba
PB1gydF4y2Ba / great_crested_grebe / Uvs-Nuur_Lake / 341/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.78gydF4y2Ba 一个/ Bar-headed_Goose /青海/ BTY18-LU / 2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.65gydF4y2Ba
巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba /鸡/ Kostroma / 1717/2017 (H5N2)gydF4y2Ba 99.67gydF4y2Ba 10 / painted_stork /印度/ ca03/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.86gydF4y2Ba
哈gydF4y2Ba / wild_duck /鞑靼斯坦/ 3059/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.47gydF4y2Ba / mallard_duck /韩国/ WA137/2017 (H5N8)gydF4y2Ba 99.41gydF4y2Ba
NPgydF4y2Ba /野鸭/ Chany / 313/2016 (H1N1)gydF4y2Ba 98.00gydF4y2Ba 埃及/ green-winged_teal / / 877/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.93gydF4y2Ba
NAgydF4y2Ba / black-headed_gull /图瓦/ 41/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.65gydF4y2Ba 一个/鸡/韩国/ H903/2017 (H5N8)gydF4y2Ba 99.79gydF4y2Ba
国会议员gydF4y2Ba /鸡/ Kostroma / 1717/2017 (H5N2)gydF4y2Ba 99.69gydF4y2Ba 埃及/ green-winged_teal / / 871/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 100.00gydF4y2Ba
/ mallard_duck /韩国/ WA137/2017 (H5N8)gydF4y2Ba
NSgydF4y2Ba / black-headed_gull /图瓦/ 41/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 99.52gydF4y2Ba 10 / painted_stork /印度/ ca03/2016 (H5N8)gydF4y2Ba 100.00gydF4y2Ba
3.1。病毒复制的实验接种鸡和老鼠gydF4y2Ba

静脉注射(iv)接种三10 6周大的鸡gydF4y2Ba6.0gydF4y2Ba50%鸡蛋感染剂量(宰牲节gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)/ 49羽毛/ 2016病毒导致了100%的死亡率(IVPI = 2.34) 3天内。在所有器官样本收集第三天接种(dpi),病毒复制的病毒滴度高效价最高的大脑(6.75±0.1 log10TCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升)(见图gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

平均滴度/国内鸭羽毛/西伯利亚/ 49 / 2016 (H5N8)病毒在鸡的器官。第四,鸡被感染gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba EgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba / 100gydF4y2Ba μgydF4y2Ba西伯利亚的l /国内鸭/ / 49羽毛/ 2016 (H5N8)病毒。注意:病毒滴度测定在科伯MDCK细胞培养方法和表达gydF4y2Ba 日志gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba ⁡gydF4y2Ba TgydF4y2Ba CgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 在1毫升的研究示例М±CI95,其中M是一个算术平均值和CI是一个置信区间。gydF4y2Ba

鼠标致死量(MLD的50%gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)是由鼻内接种系列稀释的病毒。/ 49羽毛/ 2016是高致病性的老鼠,MLDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba1.3的日志gydF4y2Ba10gydF4y2Ba开斋节gydF4y2Ba50gydF4y2Ba。所有被感染的老鼠出现症状包括体重损失,折边皮毛、弯腰驼背的姿势,和颤抖。gydF4y2Ba

 3.2。表型分析gydF4y2Ba

奥司他韦的敏感性数据分析标准方法(gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba]。集成电路的解释gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值是基于世界卫生组织流感的抗病毒工作组(WHO-AVWG)标准建立了甲型流感病毒(gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba]:正常抑制流感(NI)(< 10倍高于正常抑制),降低抑制(RI)(甲型流感10 - 100倍高于正常抑制),和高度减少抑制(HRI)(甲型流感> 100倍高于正常抑制)。我们相比与疫苗株А/ 49羽毛/ 2016 /加州/ 07/2009 (H1N1) pdm09孤立在流感大流行期间,并演示了正常抑制奥司他韦。的比较证实NI / 49羽毛/ 2016。gydF4y2Ba

 3.3。微观病变、病毒抗原分布和病毒载量在鸡器官gydF4y2Ba

研究微观损伤和病毒复制的网站,我们做了一个比较分析的器官从感染鸡3 dpi和2未感染鸡(控制)。Hematoxylin-and-eosin(他),包含IHC,如果染色AI病毒核蛋白抗原进行(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba,5。垫)。gydF4y2Ba

组织学损伤和免疫组织化学检测病毒抗原在肺,大脑和肝脏的鸡感染了高致病性禽流感病毒(H5N8);用红色病毒抗原染色。注意:(a)红细胞parabronchial腔和肺的心房。酒吧= 50gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(b)是一样的。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(c)在肺泡巨噬细胞和肺泡细胞病毒抗原。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(d)静脉和毛细血管充血的大脑。酒吧= 100gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(e)当地的大脑渗透。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(f)许多AIV抗原被发现在神经元与放大x1000(插入)和神经胶质细胞。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(g)在肝静脉和毛细血管充血。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(h)营养不良的变化在一个面积广阔的肝实质;激活巨噬细胞的优势;和大量的肥大细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞。酒吧= 100gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(i)病毒抗原在枯氏细胞与放大x1000(插入)和肝细胞(bar = 20gydF4y2Ba μgydF4y2Ba米)。插入表明病毒抗原在肝细胞的存在。放大x1000。他:hematoxylin-and-eosin染色;包含IHC:免疫组织化学染色。gydF4y2Ba

组织学损伤和免疫组织化学检测病毒抗原的心,肠、肾脏、脾鸡感染了高致病性禽流感病毒(H5N8);用红色病毒抗原染色。注意:(a) lymphohistiocytic心肌炎。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(b)病毒抗原在细胞。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(c)密集的小肠的单核细胞浸润;上皮细胞的脱屑。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(d)在上皮细胞病毒抗原。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。E肾静脉和毛细血管充血。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(f)在肾小管上皮细胞病毒抗原。放大x40。(g)当地的脾坏死。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。(h)脾巨噬细胞的病毒抗原。酒吧= 20gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。他:hematoxylin-and-eosin染色;包含IHC:免疫组织化学染色。gydF4y2Ba

 3.3.1。肺gydF4y2Ba

中庭肺肺泡和气囊含有浆液性渗出物和巨噬细胞都降低了。大量的有核红细胞parabronchial流明(出血),中庭,和空气毛细血管。纤毛和呼吸(pseudostratified)上皮杯状细胞部分增殖,部分经历了变质的变化(营养不良;hyperproduction粘液)。血管内皮细胞肿胀,部分被烧毁。我们还发现了血管周围水肿、出血和水肿具有高蛋白质含量(3/3)(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(一)和gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(b))。病毒抗原染色观察肺泡细胞,肺泡巨噬细胞(3/3)和病毒滴度分别为6.06±0.06日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(c)和放大)。这些变化表明严重病变导致急性呼吸衰竭。gydF4y2Ba

 3.3.2。大脑gydF4y2Ba

轻微的局部软化被确认在所有鸡。主要提出了血管周围淋巴细胞组成的袖口在大脑皮层。静脉和毛细血管充血。蛋白质含量高的水肿出现(3/3)(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(d)和gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(e))。病毒抗原染色观察神经元和神经胶质细胞(见图所示gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(f)和放大),病毒滴度分别为6.75±0.1日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升。因此,血管炎和viral-induced病变神经元和神经胶质细胞的观察,这是有关neuroinvasiveness (H5N8)的高致病性禽流感病毒。gydF4y2Ba

(H5N8)的neuroinvasiveness HPAIV早些时候所示研究[gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba),引起的病变引起的类似H5N2, H5N6和H5N8病毒在国内北京鸭子(gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba),通过HPAIV (H5N8)在增肥鸭gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba),和(H5N1)的老鼠gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba]。病毒滴度的大脑中H5N6——H5N8-infected H5N2-infected鸭子鸭子明显高于[gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

轻微的局部软化、坏死的神经元和疾病的血液流变学检查情况下表示神经亲和力高(H5N8) HPAIV,由包含IHC证实了积极的病毒学的结果,如果分析。病毒传播到大脑中导致严重的神经功能障碍被认为是高甲型流感的原因之一(H5N8)毒性鸡。gydF4y2Ba

 3.3.3。肝gydF4y2Ba

我们观察到静脉和肝鼻窦充血。轻度拥堵和血栓形成也见过(1/3)。地方大血管附近的白细胞浸润主要被确定(3/3)(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(g))。当地肝实质的炎症与肝细胞退化与优势的巨噬细胞和肥大细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞是检测(1/3)(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(h)和放大)。病毒抗原染色观察肝细胞和枯否细胞,在和病毒滴度分别为4.69±0.28日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升(见图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba(我)和放大)。因此,肝脏血液供应和焦肝炎的干扰。gydF4y2Ba

 3.3.4。心gydF4y2Ba

多病灶的lymphohistiocytic心肌炎和心脏细胞退化观察(见图gydF4y2Ba 3(一个)gydF4y2Ba)。心肌间质水肿液被确认的积累(3/3)。病毒抗原染色观察细胞(见图gydF4y2Ba 3 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

 3.3.5。肠gydF4y2Ba

脱皮的绒毛上皮细胞层观察。肠上皮杯状细胞增生显示。轻微的单核细胞浸润黏膜下层是确定了。坏死的病灶部位被发现在粘膜固有层(3/3)(见图gydF4y2Ba 3 (c)gydF4y2Ba)。病毒抗原染色存在于上皮细胞的绒毛(见图gydF4y2Ba 3 (d)gydF4y2Ba),病毒滴度分别为5.75±0,13个日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升。因此,catarrhal-desquamative肠炎与高水平的病毒抗原在炎症细胞观察小肠。gydF4y2Ba

 3.3.6。肾脏gydF4y2Ba

焦点由病毒引起的急性坏死和出血的观察到肾脏(1/3)。病毒抗原染色存在于近端小管上皮细胞的肾元,和病毒滴度分别为6.0±0.35日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升(见图gydF4y2Ba 3 (e)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 3 (f)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

 3.3.7。脾gydF4y2Ba

观察静脉和毛细血管充血。单核细胞浸润主要大血管附近出现。多灶性坏死(3/3)(见图gydF4y2Ba 3 (g)gydF4y2Ba)。病毒抗原存在于巨噬细胞、内皮细胞和病毒滴度分别为4.25±1.06日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升(见图gydF4y2Ba 3 (h)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一般来说,如果染色更密集的大脑,肺和心脏。NP病毒抗原染色在肾脏和脾脏是微不足道的(没有显示)。病毒抗原的存在与IHC检测到如果在协议分析和组织病理学变化(见附加的。垫)。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们调查了甲型流感病毒(H5N8),孤立在第二波传播于2016年在西伯利亚西部。它显示高度毒性特性(IVPI = 2.34);multiorgan传播(大脑、心脏、小肠、肝、脾脏和肾脏)在接种鸡。病毒有效复制收集的所有器官中病毒滴度高,和大脑中的效价最高(6.75±0.07日志gydF4y2Ba10gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba/毫升)。/ 49羽毛/ 2016显示高致病性小鼠(MLD)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 1.3的日志gydF4y2Ba10gydF4y2Ba开斋节gydF4y2Ba50gydF4y2Ba),这可能表明病毒感染哺乳动物宿主的能力,并且有可能导致高死亡率的鸡。所确定的氨基酸变化需要进一步的研究来揭示他们的角色在高度致命的感染,这可能表明病毒感染哺乳动物宿主的能力。奥司他韦和有效地抑制了病毒显示抑制内正常的ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba磁化率范围。gydF4y2Ba

组织病理学禽流感造成的不同菌株被描述由几个作者(gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 24gydF4y2Ba),展示了病毒的多重的能力在不同的器官和细胞类型导致坏死病灶。然而,炎症反应在不同实验和鸟类之间存在着显著的差异。因此,一个适当的组织病理学特征为每个小说应变是至关重要的。gydF4y2Ba

的溢出(H5N8) HPAIV家禽动物卫生部门造成了严重的威胁,尤其是在西伯利亚,经历了2005年(H5N1)爆发gydF4y2Ba 25gydF4y2Ba]。因此需要严格的生物安全措施保护家禽农场免受病毒条目。gydF4y2Ba

 4所示。结论gydF4y2Ba

新型高致病性禽流感病毒(H5N8)(进化枝2.3.4.4)2016年10月被隔离病国内鸭羽毛的商业农场在西伯利亚。这种病原体是高致命性在实验感染鸡和小鼠和IVPI = 2.34gydF4y2Ba 米gydF4y2Ba lgydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba = 1.3gydF4y2Ba 日志gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba ⁡gydF4y2Ba EgydF4y2Ba 我gydF4y2Ba DgydF4y2Ba 50gydF4y2Ba 相应地,。我们确定了鸡的内脏器官受损的结构元素HPAIV (H5N8):gydF4y2Ba

在肺部,肺泡巨噬细胞和肺泡细胞;gydF4y2Ba

在大脑中,神经元和胶质细胞;gydF4y2Ba

肝细胞和枯否细胞在肝脏,;gydF4y2Ba

在心脏,细胞;gydF4y2Ba

在肠上皮细胞;gydF4y2Ba

在肾脏近端小管上皮细胞的肾元;gydF4y2Ba

在脾、巨噬细胞和内皮细胞。gydF4y2Ba

此信息可以帮助研究HPAIV (H5N8)引起的感染病毒继续传播。gydF4y2Ba

 数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

 信息披露gydF4y2Ba

赞助商不扮演任何角色的研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。gydF4y2Ba

 的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

 确认gydF4y2Ba

我们感谢GISAID EpiFlu™数据库(gydF4y2Ba http://www.gisaid.orggydF4y2Ba),作者提供的序列数据。显微分析已经得到了总统的支持下的格兰特(协议# 075-15-2019-1083(МК-3318.2019.4))。排序,系统发育分析,确定对神经氨酸酶抑制剂是支持的俄罗斯科学基金会的资助(项目# 17-44-07001)。gydF4y2Ba

 补充材料gydF4y2Ba

免疫荧光检测病毒抗原的内部器官的鸡感染了高致病性禽流感病毒(H5N8)。注意:a:大脑,b:肺,和c:心。格林:细胞内流感NP蛋白染色与NP抗流感抗体(AA5H、荷兰);蓝色:核沾染了4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。图像是通过LSM710 / NLO显微镜,利用Plan-Apochromat 63 x客观(德国卡尔蔡司)。gydF4y2Ba

 湾gydF4y2Ba x F。gydF4y2Ba 隔离和表征的禽流感病毒在中国gydF4y2Ba 1998年gydF4y2Ba 广州,中国gydF4y2Ba 华南农业大学兽医学院gydF4y2Ba 赵gydF4y2Ba K。gydF4y2Ba 顾gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 钟gydF4y2Ba lgydF4y2Ba 段gydF4y2Ba Z。gydF4y2Ba 张gydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba 朱gydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba 赵gydF4y2Ba G。gydF4y2Ba 赵gydF4y2Ba M。gydF4y2Ba 陈gydF4y2Ba Z。gydF4y2Ba 胡gydF4y2Ba 年代。gydF4y2Ba 刘gydF4y2Ba W。gydF4y2Ba 刘gydF4y2Ba X。gydF4y2Ba 彭gydF4y2Ba D。gydF4y2Ba 刘gydF4y2Ba X。gydF4y2Ba 描述三个H5N5和一个H5N8高致病性禽流感病毒在中国gydF4y2Ba 兽医微生物学gydF4y2Ba 2013年gydF4y2Ba 163年gydF4y2Ba 351年gydF4y2Ba 357年gydF4y2Ba 10.1016 / j.vetmic.2012.12.025gydF4y2Ba 宋gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 康gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 李gydF4y2Ba E。gydF4y2Ba 首歌gydF4y2Ba B。gydF4y2Ba KwongydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba 金gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 崔gydF4y2Ba K。gydF4y2Ba 金gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 李gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 月亮gydF4y2Ba O。gydF4y2Ba 宋gydF4y2Ba W。gydF4y2Ba 崔gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 门敏gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 锺株gydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba 公园gydF4y2Ba y . H。gydF4y2Ba 李gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 李gydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba 高致病性禽流感病毒在家禽(H5N8)及其与候鸟的关系在2014年在韩国gydF4y2Ba 兽医微生物学gydF4y2Ba 2014年gydF4y2Ba 173年gydF4y2Ba 249年gydF4y2Ba 257年gydF4y2Ba 10.1016 / j.vetmic.2014.08.002gydF4y2Ba 马尔琴科gydF4y2Ba 诉Y。gydF4y2Ba SusloparovgydF4y2Ba i M。gydF4y2Ba KolosovagydF4y2Ba n P。gydF4y2Ba 甲型流感(H5N8)病毒隔离在俄罗斯,2014年gydF4y2Ba 档案病毒学gydF4y2Ba 2015年gydF4y2Ba 160年gydF4y2Ba 2857年gydF4y2Ba 2860年gydF4y2Ba 10.1007 / s00705 - 015 - 2570 - 4gydF4y2Ba 李gydF4y2Ba D。gydF4y2Ba SharshovgydF4y2Ba K。gydF4y2Ba SwaynegydF4y2Ba d E。gydF4y2Ba 整修gydF4y2Ba O。gydF4y2Ba 水列夫gydF4y2Ba 我。gydF4y2Ba KabilovgydF4y2Ba M。gydF4y2Ba AlekseevgydF4y2Ba 一个。gydF4y2Ba IrzagydF4y2Ba V。gydF4y2Ba ShestopalovgydF4y2Ba 一个。gydF4y2Ba 小说重组进化枝2.3.4.4禽流感A (H5N8)病毒在野生水生鸟类,俄罗斯,2016年gydF4y2Ba 新发传染病gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 359年gydF4y2Ba 360年gydF4y2Ba 10.3201 / eid2302.161252gydF4y2Ba 马尔琴科gydF4y2Ba 诉Y。gydF4y2Ba SusloparovgydF4y2Ba i M。gydF4y2Ba KomissarovgydF4y2Ba 答:B。gydF4y2Ba FadeevgydF4y2Ba 一个。gydF4y2Ba GoncharovagydF4y2Ba n I。gydF4y2Ba ShipovalovgydF4y2Ba 答:V。gydF4y2Ba SvyatchenkogydF4y2Ba s V。gydF4y2Ba DurymanovgydF4y2Ba a·G。gydF4y2Ba IlyichevagydF4y2Ba t . N。gydF4y2Ba SalchakgydF4y2Ba l·K。gydF4y2Ba SvintitskayagydF4y2Ba e . P。gydF4y2Ba 费奥多尔gydF4y2Ba v . N。gydF4y2Ba RyzhikovgydF4y2Ba 答:B。gydF4y2Ba 再引入A / H5N8高致病性禽流感病毒的进化枝2.3.4.4。在俄罗斯gydF4y2Ba 档案病毒学gydF4y2Ba 2017年gydF4y2Ba 162年gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 1381年gydF4y2Ba 1385年gydF4y2Ba 10.1007 / s00705 - 017 - 3246 - zgydF4y2Ba 马纳尔gydF4y2Ba D。gydF4y2Ba PoengydF4y2Ba m·J。gydF4y2Ba BestebroergydF4y2Ba t M。gydF4y2Ba 在野生鸟类禽流感病毒:病毒进化multihost生态系统gydF4y2Ba 病毒学杂志gydF4y2Ba 2018年gydF4y2Ba 92年gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba e00433-18gydF4y2Ba 10.1128 / JVI.00433-18gydF4y2Ba NappgydF4y2Ba 年代。gydF4y2Ba 主要gydF4y2Ba N。gydF4y2Ba Sanchez-GonzalezgydF4y2Ba R。gydF4y2Ba Vergara-AlertgydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 的出现和传播高致病性禽流感A (H5N8)在2016 - 2017年在欧洲gydF4y2Ba 跨界和新兴疾病gydF4y2Ba 2018年gydF4y2Ba 65年gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 1217年gydF4y2Ba 1226年gydF4y2Ba 10.1111 / tbed.12861gydF4y2Ba 项目的gydF4y2Ba N。gydF4y2Ba NaguibgydF4y2Ba M . 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